王榮波，陳姝樽，李本金，劉裴清，鄧麗霞，翁啟勇

（福建省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所/福建省作物有害生物監(jiān)測與治理重點實驗室，福建 福州 350013）

0 引言

【研究意義】彩葉草 [Plectranthus scutellarioides(L.) R.Br.]，屬于唇形科（Lamiaceae）鞘蕊花屬（Coleus）多年生常綠草本觀葉植物，原產(chǎn)自熱帶或亞熱帶地區(qū)的印度尼西亞、馬來西亞、菲律賓等地，現(xiàn)世界各地均有栽培[1]。彩葉草品種多樣、葉色絢麗、葉型美觀，觀賞價值很高，是園林造景常用的觀葉植物。目前，彩葉草的應用不再局限于城市環(huán)境景觀的建設，人們對其藥用價值的關(guān)注成為該領域的熱點[2]。彩葉草具有極高的藥用價值，可以治療多種疾病，如頭痛、擦傷、眼炎及消化不良等[3]。彩葉草中所含有的迷迭香酸是一種高價值的天然酚類化合物，具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫及抗氧化的功能，廣泛應用于食品、醫(yī)藥、化工等領域[4?6]。近年來，隨著彩葉草研究的深入及應用領域的拓展，其需求量日益增長，因此，彩葉草人工栽培面積正在不斷擴大。由于種植面積的擴大且多采用設施栽培，造成彩葉草病害日趨嚴重。漳州是福建花卉苗木最大的生產(chǎn)出口基地[7]，彩葉草作為基礎性花卉裝飾品種種植面積龐大，但2017 年以來，葉枯病在種植地普遍發(fā)生，危害嚴重，發(fā)病率在50%以上，已嚴重影響了彩葉草觀賞價值，給當?shù)貜臉I(yè)者帶來了嚴重的經(jīng)濟損失。明確葉斑病病原菌可為采取有效措施對該病害進行防控奠定基礎?！厩叭搜芯窟M展】目前，關(guān)于彩葉草病害的相關(guān)研究報道較少，最主要的病害是由Peronospora belbahrii引起的霜霉病，該病害在日本、英國、德國、美國及巴西等國家均普遍發(fā)生[8?10]。在意大利，由黃萎病菌Verticillium dahliae引起的黃萎病與鏈格孢Alternaria alternata引起的葉片壞死作為彩葉草新病害進行了報道[11?12]。國內(nèi)關(guān)于彩葉草真菌病害的報道主要為介紹病害癥狀、危害情況及防治措施等[13?16]?！颈狙芯壳腥朦c】漳州地區(qū)2017–2020 年的6–9 月為彩葉草葉斑病的高發(fā)期，嚴重降低了彩葉草的觀賞性和經(jīng)濟價值，亟需明確葉斑病病原菌種類，進而制定有效的防控措施?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過病原菌分離純化、致病性檢測、形態(tài)學特征觀察、ITS與LSU 序列分子生物學鑒定等方式對彩葉草葉斑病病原菌進行分類鑒定，并在室內(nèi)測定6 種殺菌劑對該病原菌的毒力，以明確病原菌種類，篩選出高效防治藥劑，為彩葉草葉枯病的發(fā)生和防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試植株：帶病彩葉草植株于2017 年7 月在福建漳州花卉種植基地采集；供試菌株ZZCYC1706 分離自彩葉草葉部病斑。

培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（Potato Dextrose Agar，PDA）：稱取200 g 馬鈴薯，洗凈去皮切碎，加水1000 mL 煮沸30 min，紗布過濾，趁熱分別加入20 g葡萄糖與20 g 瓊脂充分溶解，蒸餾水定容至1000 mL，分裝，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

供試藥劑：95%嘧霉胺（pyrimethanil），京博農(nóng)化科技股份有限公司；99%腐霉利（procymidone），瀘州東方農(nóng)化有限公司；96%啶菌噁唑（pyrisoxazole），沈陽科創(chuàng)化學品有限公司；96%啶酰菌胺（boscalid），陜西美邦農(nóng)藥有限公司；98%異菌脲（iprodione），江蘇輝豐農(nóng)化股份有限公司；96.4%克菌丹（captan），瀘州東方農(nóng)化有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原真菌的分離培養(yǎng) 采用常規(guī)組織分離法[17]

進行病原菌分離，將采集的病葉清洗干凈后，在病葉的病健交界處切取5 mm × 5 mm 的組織，用75%酒精處理45 s 后，2% NaClO 浸泡2 min，無菌蒸餾水沖洗3 次，然后置于滅菌且干燥的吸水紙上，吸收并晾干水分。晾干后的葉片組織在無菌條件下接種于含有50 mg·mL?1的氨芐和利福平的PDA平板上。于28 ℃黑暗培養(yǎng)5 d 后，挑取菌落邊緣少量菌絲進行轉(zhuǎn)接培養(yǎng)，并進行單孢分離獲得純培養(yǎng)物（代表菌株為ZZCYC1706）。

1.2.2 致病性測定 柯赫氏法則驗證采用分生孢子懸浮液接種[18]進行：將純化后的菌株ZZCYC1706于28 ℃黑暗培養(yǎng)7 d，待病原菌產(chǎn)孢后，用無菌水將孢子洗脫下來并配置成1×106個·mL?1的分生孢子懸浮液備用。選取苗齡為3 個月長勢一致的彩葉草植株，將配制好的分生孢子懸浮液均勻噴灑到植株的葉片上，每個處理接種5 株，同時設置無菌水為對照。接種后置于25 ℃培養(yǎng)箱黑暗條件下保濕24 h，然后轉(zhuǎn)移至12 h 光周期條件下保濕培養(yǎng)，觀察發(fā)病情況。待接種植株發(fā)病后，對發(fā)病葉片重新進行病原菌分離，并觀察與原始菌株是否一致。

1.2.3 致病菌形態(tài)學鑒定 將純化后的菌株接種于PDA 平板上，28 ℃黑暗培養(yǎng)5 d，觀察菌落形態(tài)和顏色；挑取菌落邊緣菌絲，在光學顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)；用無菌水將分生孢子洗脫并配制成懸浮液，吸取5 μL 孢子懸浮液置于載玻片上，于光學顯微鏡下觀察分生孢子的形態(tài)特征并測量其大小。根據(jù)Lawrence 等[19]提供的形態(tài)學特征對分離菌株進行初步鑒定。

1.2.4 致病菌分子生物學鑒定 采用CTAB 法提取病原菌基因組DNA[20]。以提取的DNA 為模板，分別擴增核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ribosomal DNA internal transcribed spacer, ITS）序列和線粒體核糖體大亞基RNA 基因（large subunit ribosomal RNA gene, LSU）片段。采用的通用引物對序列分別為ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）/ ITS4（5′-TCCT CCGCTTATTGATATGC-3 ′ ）和LR5（5 ′-ATCCTG AGGGAAACTTC-3′）/ LROR（5′-GTACCCGCTGA ACTTAAGC-3′）[21]，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR 反應體系：25 μL 反應體系，包含2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，上下游通用引物 (10 μmol ·L?1) 各1 μL，模板DNA 1 μL，用雙蒸水補足至25 μL。擴增程序：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，28個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取5 μL 反應產(chǎn)物于1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物片段大小，并送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

測序所得核酸序列提交至NCBI（http://www.ncbi.nlm.gov）數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對分析，并登錄GenBank 獲得登錄號。在GenBank 數(shù)據(jù)庫中下載已經(jīng)報道的12 種鏈格孢屬（Alternariaspp.）真菌的ITS和LSU 序列，以Verticillium dahlia為外群，利用IQTREE（http://iqtree.cibiv.univie.ac.at/）在線軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。經(jīng)MAFFT（https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/mafft/）進行多重序列比對后采用Maximum likelihood（ML）方法并設置Ultrafast bootstrap 參數(shù)為1 000 進行構(gòu)建，其他設置均采用默認的參數(shù)[22]。

1.2.5 殺菌劑室內(nèi)毒力測定 采用菌絲生長速率法測定6 種供試藥劑對彩葉草葉枯病病原菌菌絲生長的抑制活性[23]。每種藥劑根據(jù)預試驗結(jié)果分別設5 個濃度梯度，用丙酮溶液作為溶劑。其中包括質(zhì)量濃度為1.0、2.5、5.0、10.0、15.0 μg·mL?1的95%嘧霉胺，質(zhì)量濃度為0.01、0.05、0.10、1.00、5.00 μg·mL?1的98%異菌脲，質(zhì)量濃度為6.25、50.00、100.00、250.00、500.00 μg·mL?1的96.4%克菌丹，質(zhì)量濃度為 0.10、0.25、0.50、1.00、2.00 μg·mL?1的96%啶菌噁唑，質(zhì)量濃度為 10、20、40、80、160 μg·mL?1的99%腐霉利，質(zhì)量濃度為 10、30、90、180、270 μg·mL?1的96%啶酰菌胺。將藥劑溶于丙酮后配制成不同濃度的母液，然后將篩選藥劑母液按照相應濃度梯度采用體積比加入PDA 培養(yǎng)基中混勻，制成不同濃度藥劑的PDA 平板，以加等量丙酮溶液的PDA 平板為對照，各處理重復3 次。取菌落邊緣生長一致直徑為6 mm 的菌絲塊接種到含藥平板中央，置于28 ℃生化培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)待對照組菌落直徑生長至培養(yǎng)皿的80%左右時，用十字交叉法測量各處理的菌落直徑，取平均值，計算相對抑制率，相對抑制率/%=（對照菌落直徑?處理菌落直徑）/（對照菌落直徑?菌餅直徑）×100。取藥劑濃度的對數(shù)值為橫坐標x，菌絲生長相對抑制率的概率值為縱坐標y，求出毒力回歸方程和相關(guān)系數(shù)，并計算出各藥劑對彩葉草葉枯病病原菌的有效抑制中濃度EC50。

2 結(jié)果與分析

2.1 彩葉草葉枯病田間癥狀

2017 至2020 年的6-9 月，福建漳州花卉種植基地的彩葉草葉斑病大面積發(fā)生，病葉率達80%以上，病株率可達50%（圖1-A）。該病發(fā)生初期，主要在葉片正面和背面形成黑色圓形或不規(guī)則病斑（圖1-C、D），后病斑逐漸干枯變色，最終多個病斑匯合形成大面積枯死斑，葉片皺縮干枯脫落（圖1-B），導致彩葉草的觀賞性和經(jīng)濟價值喪失。

圖1 彩葉草葉斑病自然發(fā)病癥狀Fig. 1 Leaf spots on coleus occurred in nature

2.2 病原菌的分離與致病力測定

采用常規(guī)組織分離法對采集的病葉進行病原菌分離，純化后獲得菌株ZZCYC1706。分離菌株在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d 后，菌落較為致密，呈絮狀平鋪生長，菌落灰黑色，菌絲呈絨毛狀或帶絮狀、較緊密，最外圍菌絲為灰白色，菌落邊緣整齊，向內(nèi)顏色逐漸加深，具有清晰的輪紋（圖2-A）。當在PDA 平板上生長至10 d 時，菌絲變成灰白色，呈現(xiàn)絮狀（圖2-B），菌落面呈青灰色（圖2-C）。采用分生孢子懸浮液接種彩葉草葉片，接種2 d 后產(chǎn)生針點狀黑色小病斑，隨后逐漸擴大成不規(guī)則或圓形病斑（圖2-E），其癥狀與彩葉草田間自然發(fā)病前期癥狀一致，無菌水噴施的陰性對照葉片未見發(fā)病癥狀（圖2-D），說明分離菌株ZZCYC1706 為彩葉草葉斑病的病原菌。

圖2 菌落形態(tài)和致病性鑒定Fig. 2 Colony morphology and pathogenic assay

2.3 病原菌形態(tài)學特征觀察

菌株ZZCYC1706 在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d 后產(chǎn)生孢子，挑取表面菌絲在顯微鏡下觀察分生孢子梗、分生孢子及菌絲的形態(tài)。初生分生孢子梗較短，直立或稍有彎曲，有分隔，呈褐色，具有分支，末端有分生孢子著生位點（圖3-A）；菌株分生孢子倒圓棒狀、長橢圓形或橢圓形，顏色為淺褐色至褐色（圖3-B），大小為（8.0～13.5） μm×（22.5～43.0）μm，具有2～7 個橫向隔膜，大部分為5 個，分隔處略隘縮或隘縮；0～2 個縱向隔膜，大多數(shù)為1 個；大多數(shù)分生孢子逐漸變窄形成一個錐形頂端喙（圖3-C）?；谏鲜鲂螒B(tài)特征和菌落形態(tài)，結(jié)合文獻資料初步判斷該病原菌為鏈格孢菌Alternariaalternata[19,21]。

圖3 病原菌分生孢子梗及分生孢子形態(tài)特征Fig. 3 Morphological characteristics of conidiophore and conidia

2.4 病原菌分子生物學鑒定

對分離菌株ZZCYC1706 的ITS、LSU基因片段進行PCR 擴增和測序，擴增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示擴增的ITS、LSU條帶單一清晰，分子量大小與預期一致。擴增產(chǎn)物經(jīng)測序后分別獲得大小為 543 bp 和914 bp 的基因片段序列，提交GenBank 進行登記，獲得登錄號分別為OK413398、OK413397。將序列在NCBI 上進行BLAST 同源比對，結(jié)果表明分離的病原菌與Alternaria alternata的同源性最高，其序列與登錄號MZ047493 和KY000652 的同源性分別達到99.81%和100%。

進一步聯(lián)合ITS、LSU基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并以大麗輪枝菌（V. dahliae）作為外群，結(jié)果（圖4）顯示，分離菌株ZZCYC1706 與A. alternata（菌株號CBS 106.24）聚于同一分支，且支持率達到100%，能夠明顯區(qū)分于同屬其他真菌?；诜肿由飳W鑒定，并結(jié)合菌株形態(tài)特征，將彩葉草葉斑病病原菌鑒定為鏈格孢菌A. alternata。

圖4 基于ITS 和LSU 序列構(gòu)建鏈格孢屬系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 4 Phylogenetic tree of Alternaria spp. based on ITS and LSU sequences

2.5 常用殺菌劑對病原菌的室內(nèi)毒力測定

分別用嘧霉胺、異菌脲、克菌丹、啶菌惡唑、腐霉利、啶酰菌胺等6 種殺菌劑對病原菌ZZCYC1706進行室內(nèi)毒力測定。結(jié)果表明，6 種藥劑對病原菌A. alternata的菌絲生長都有一定的抑制作用。如表1所示，所測殺菌劑的抑菌概率值y和殺菌劑質(zhì)量濃度轉(zhuǎn)換成的對數(shù)值x的相關(guān)系數(shù)r均在0.9 以上，甚至達到0.999，說明所建立的回歸方程是有效的。在供試的6 種藥劑中，96%啶菌惡唑抑菌效果最好，其EC50為0.621 μg·mL?1，其次為98%異菌脲和95%嘧霉胺，EC50分別為1.155 、5.258 μg·mL?1；而96.4%克菌丹效果較差，EC50值最高，為89.010 μg·mL?1。

表1 6 種藥劑對彩葉草葉斑病病原菌的毒力測定Table 1 Toxicities of 6 fungicides on A. alternata

3 討論與結(jié)論

彩葉草是城市景觀建設中廣泛使用的一種重要的觀賞花卉，同時也極富藥用價值[1,2]。彩葉草原產(chǎn)于亞太熱帶地區(qū)，現(xiàn)在世界各國廣泛栽培。其栽培過程中經(jīng)常出現(xiàn)灰霉病、疫病、白粉病、菌核病、黑斑病等病害，尤其是葉部病害嚴重影響彩葉草的觀賞價值[13]。但是，目前關(guān)于彩葉草葉斑病的研究較少，國內(nèi)僅對其危害癥狀、發(fā)生情況及防治措施進行介紹，對該病害病原物進行分離鑒定和系統(tǒng)研究有待深入進行。本研究通過傳統(tǒng)植物病原菌鑒定方法與分子生物學手段相結(jié)合鑒定了彩葉草葉斑病的致病菌為鏈格孢（A. alternata），并對其防治藥劑進行了篩選。

傳統(tǒng)植物病原菌的鑒定采用柯赫氏法則結(jié)合形態(tài)學觀察的方法，形態(tài)學主要通過分生孢子、菌絲形態(tài)差異等特征來確定病原菌的分類。而鏈格孢屬（Alternariaspp.）是一個在生物學、生態(tài)學和形態(tài)學上都非常豐富的真菌群，該屬絕大多數(shù)真菌都具有串聯(lián)的分生孢子，由于分生孢子的形態(tài)較為接近，界限模糊，給鏈格孢屬真菌的種類鑒定帶來一定的困難[21]。形態(tài)學與DNA 序列如ITS 等核糖體序列相結(jié)合常用于真菌的系統(tǒng)分類，但ITS等包含的信息有限，只能根據(jù)序列分析鏈格孢屬種間形態(tài)差異大的菌種，而形態(tài)差異小的則不能區(qū)分[24]。本研究將ITS 與LSU 的序列進行聯(lián)合分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，明確了彩葉草葉斑病的病原菌為鏈格孢A. alternata。

A. alternata是鏈格孢屬（Alternariaspp.）的模式菌種，能夠在100 多種植物上引起葉斑病和其他病害，也可引起多種作物采后病害，在世界范圍內(nèi)造成巨大的經(jīng)濟損失[25]。在我國，已經(jīng)報道在枇杷[26]、葡萄[27]、蝙蝠葛[28]、苦蕎麥[29]、鳳尾蘭[30]、野生水稻[31]等植物上引起葉斑病或褐斑病，但是在彩葉草上屬于首次報道。目前，關(guān)于該病害的化學防治藥劑的報道較少，張丹華等[26]對枇杷上分離的鏈格孢進行室內(nèi)毒力測定，發(fā)現(xiàn)咪鮮胺、嘧菌酯、甲基硫菌靈、多菌靈及苯醚甲環(huán)唑5 種殺菌劑對菌株生長均有抑制作用。其中，苯醚甲環(huán)唑的抑制效果最好，EC50為3.84 mg·L?1。趙熾娜等[32]研究發(fā)現(xiàn)申嗪霉素對鏈格孢菌的抑制中濃度（EC50）為17.5616 mg·L?1，并且當申嗪霉素質(zhì)量濃度為50.0 mg·L?1時，對該菌的抑制率為71.21%。本研究選用嘧霉胺、異菌脲、克菌丹、啶菌惡唑、腐霉利、啶酰菌胺等6 種殺菌劑進行室內(nèi)毒力測定，其中啶菌惡唑的EC50為0.621 μg·mL?1，遠優(yōu)于之前報道的藥劑，并且篩選的異菌脲和嘧霉胺也具有良好的抑菌效果。同時，啶菌惡唑?qū)儆谶拎哼蜻悮⒕鷦?，異菌脲是二甲酰亞胺類高效廣譜、觸殺型殺菌劑，而嘧霉胺為苯氨基嘧啶類殺菌劑，因此，在防治葉斑病過程中，可以將這3 種藥輪換使用，以提高田間防效并延緩病菌產(chǎn)生抗藥性。