姚錦愛，黃 鵬，蘭成忠，侯翔宇，余德億

（福建省作物有害生物監(jiān)測與治理重點實驗室/福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/福建省作物有害生物綠色防控工程研究中心，福建 福州 350013）

0 引言

【研究意義】鐵皮石斛（Dendrobium officinale）屬于蘭科石斛屬的多年生草本植物，富含多種生物堿、石斛多糖、氨基酸、菲類化合物以及微量元素等，具有益胃生津、滋陰清熱、增加免疫力等作用，是一種非常珍貴的中藥材[1]。目前福建、安徽、浙江、江蘇、云南、廣西和廣東等省是鐵皮石斛人工栽培的主產(chǎn)區(qū)。由于生長環(huán)境條件改變和大棚集約化的生產(chǎn)模式，其病蟲危害日益加重，對鐵皮石斛種植造成重大威脅?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】莖腐病是鐵皮石斛發(fā)生最嚴(yán)重的病害之一。目前報道的引起鐵皮石斛莖腐病的病原菌主要有鐮刀菌（Fusariumspp.）、疫霉菌（Phytophthora nicotianae） 以及立枯絲核菌（Rhizoctonia solani），其中由鐮刀菌引起的莖腐病田間發(fā)病率較高，致病性強，防治難[2?5]。鐮刀菌屬內(nèi)的多個種對鐵皮石斛根莖部均可致病，而因地域環(huán)境、栽培方式、氣候條件等的差異，鐵皮石斛莖腐病主要致病菌種類也存在差異?！颈狙芯壳腥朦c】引起福建省鐵皮石斛莖腐病的病原真菌種類有待深入探討?！緮M解決的關(guān)鍵問題】為了進(jìn)一步明確福建省鐵皮石斛莖腐病的主要病原真菌，以該地區(qū)鐵皮石斛種植基地莖腐病病株為研究對象，通過癥狀觀察、形態(tài)學(xué)及ITS、ACT、EF1-α、RPB2和LSU等基因序列分析，結(jié)合致病性測定準(zhǔn)確鑒定福建省鐵皮石斛莖腐病的病原菌，以期為鐵皮石斛主要病害如莖腐病和根腐病等的高效防治提供依據(jù)和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試植物：鐵皮石斛病株采自福建省詔安縣和松溪縣的鐵皮石斛種植基地。健康鐵皮石斛苗購自種植基地。

培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，補蒸餾水定容至1 L；察氏（Czapek）培養(yǎng)基：硝酸鈉3 g、磷酸氫二鉀1 g、硫酸鎂0.5 g、氯化鉀0.5 g、硫酸亞鐵0.01 g、蔗糖30 g、瓊脂粉16 g，添加蒸餾水定容至1 L。

試劑：植物基因組DNA 提取試劑盒，天根生化（北京）科技有限公司；TaqDNA 聚合酶、dNTPs和瓊脂糖，生工生物（上海）工程股份有限公司。

儀器：Nikon E200 光學(xué)顯微鏡（Nikon，日本）；C1000 Thermal Cyclers 型 PCR 儀（Bio-Rad， 美國）；DYCP-31DN 型瓊脂糖水平電泳儀（北京六一生物科技有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 鐵皮石斛莖腐病田間發(fā)病癥狀觀察 2019-2020 年在福建省詔安縣和松溪縣等多個鐵皮石斛種植基地對莖腐病發(fā)生條件及發(fā)病癥狀進(jìn)行觀察。

1.2.2 病原菌的分離純化與形態(tài)學(xué)鑒定 選取感病鐵皮石斛發(fā)病部位，在病健交界處用滅菌解剖刀取大小為0.5 mm×0.5 mm 的小塊，置于70 %酒精中30 s，后用無菌水沖洗2～3 次，于無菌濾紙上晾干后平放PDA 平板中央，26 ℃培養(yǎng)。2 d 后分離物上長出白色菌絲，顯微鏡下觀察挑取單孢接種于新的PDA 平板上中央，26 ℃繼續(xù)培養(yǎng)5～7 d 后，挑選分離所得代表菌株（編號FJDO-1 和FJDO-2）在顯微鏡下對菌絲和孢子進(jìn)行觀察，鏡檢30 個視野。

1.2.3 致病性測定 在培養(yǎng)7 d 的菌株（編號FJDO-1）菌落上，用無菌打孔器取直徑為5 mm 的菌餅，同時用滅菌1 mL 注射器針頭在10 個離體莖稈上分別輕輕刺傷1～3 個小口，將菌餅置于刺傷傷口表面上，并用無菌水浸濕的棉花包裹（圖1-D），進(jìn)行病原菌致病性測定。以只接種PDA 培養(yǎng)基為空白對照。接種7 d 后，對鐵皮石斛發(fā)病部位進(jìn)行病原菌再次分離和鑒定，觀察與原接種菌的性狀特征，發(fā)病癥狀是否一致。

圖1 鐵皮石斛莖腐病的癥狀及病原菌的形態(tài)Fig. 1 Symptom and morphology of stem rot on D. officinale

1.2.4 病原菌分子生物學(xué)鑒定 參照Yao 等[6]的方法，對代表菌株（編號FJDO-1）基因組DNA 進(jìn)行PCR擴增。根據(jù)真菌基因組DNA 提取試劑盒的說明書提取DNA。采用ITS基因、ACT基因、EF1-α基因、RBP2 基因和LSU基因引物（表1），分別對病原菌基因組DNA 進(jìn)行PCR 擴增。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min（ITS），72 ℃延伸1.5 min，35 個循環(huán)；最后72 ℃延伸8 min，ACT和EF1-α基因PCR 反應(yīng)程序的退火溫度分別為58 ℃和56 ℃，其余基因擴增的退火溫度與ITS相同。PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂凝膠電泳檢測后，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序；為了進(jìn)一步揭示該菌株的分類地位，將獲得的核酸序列在NCBI 的BLAST 中進(jìn)行同源性比對分析[7]，使用PhyloSuite 1.2.1 對上述5 個不同基因序列進(jìn)行串聯(lián)[8]；用PartitionFinder 2 確定的最佳數(shù)據(jù)分區(qū)[9]，最后用MEGA 6.0 軟件進(jìn)行多基因系統(tǒng)發(fā)育分析[10]。

表1 莖腐病菌鑒定所用 PCR 引物Table 1 PCR primers for pathogenic identification of stem rot disease

1.2.5 病原菌生物學(xué)特性研究 （1）溫度對病原菌菌絲生長的影響。在純化培養(yǎng)5 d 的病原菌邊緣取直徑5 mm 的菌餅轉(zhuǎn)接于PDA 培養(yǎng)基中央，分別置于10～40 ℃間以5 ℃為梯度（7 個梯度）的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)暗培養(yǎng)6 d，采用十字交叉法測量菌落直徑。每處理重復(fù)3 次。

（2）pH 對病原菌菌絲生長的影響。取直徑為5 mm 的菌餅接種于用0.1 mol·L?1HCl 和0.1 mol·L?1NaOH 調(diào)配pH 為4、5、6、7、8、9、10 的PDA 培養(yǎng)基上，后置于28 ℃恒溫培養(yǎng)，6 d 后采用十字交叉法測量菌落直徑，每處理重復(fù)3 次。

（3）光照條件對病原菌菌絲生長的影響。取直徑為5 mm 的菌餅轉(zhuǎn)接于PDA 培養(yǎng)基中央，分別置于黑暗、光照和黑暗光照交替（12 h/12 h）3 種不同光照條件下，26 ℃恒溫培養(yǎng)，6 d 后采用十字交叉法測量菌落直徑，每處理重復(fù)3 次。

（4）碳源對病原菌菌絲生長的影響。在察氏培養(yǎng)基配制配方的基礎(chǔ)上，將培養(yǎng)基中的蔗糖替換為等量的淀粉、麥芽糖、乳糖、葡萄糖，配制成含不同碳源的培養(yǎng)基，以不含碳源培養(yǎng)基作為空白對照；再將5 mm 的活化菌餅接于不同碳源培養(yǎng)基中央，26 ℃恒溫培養(yǎng)，6 d 后采用十字交叉法測量菌落直徑，每處理重復(fù)3 次。

（5）氮源對病原菌菌絲生長的影響。取察氏培養(yǎng)基配制配方的基礎(chǔ)上，將培養(yǎng)基中的硝酸鈉替換為等量的蛋白胨、牛肉浸膏、酵母、硫酸銨，配制成不同氮源的培養(yǎng)基，以不含氮源培養(yǎng)基為空白對照。再將5 mm 的活化菌餅接于不同氮源培養(yǎng)基中央，26 ℃恒溫培養(yǎng)，6 d 后采用十字交叉法測量菌落直徑，每處理重復(fù)3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 鐵皮石斛莖腐病癥狀

調(diào)查發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛莖腐病在夏季高溫高濕的環(huán)境中易發(fā)生。幼苗或新發(fā)枝感染時，植株下部葉片失綠變黃，莖稈黃化、萎蔫、枯萎（圖1-A），隨著時間的推移病斑逐漸向上蔓延，葉片出現(xiàn)萎蔫下垂、變褐等癥狀，嚴(yán)重的開始脫落、皺縮，最后整株黃化枯萎。莖稈基部或中部呈水漬狀的病斑，后變黃干枯縊縮，濕度大時病株莖基部可見白色或粉紅色霉?fàn)钗铩?/p>

2.2 病原菌的形態(tài)特征及致病性

代表菌株FJDO-1 在PDA 培養(yǎng)基上生長良好，菌落呈圓形，正面可觀察到氣生菌絲茂盛，初期菌落為白色，漸變?yōu)榈仙?，羊毛狀，邊緣整齊，背面可觀察到同心不規(guī)則輪紋，中央紫色色素較為集中(圖1-B)。光學(xué)顯微鏡觀察，可看到菌株FJDO-1的菌絲白色透明、有分枝和分隔，分生孢子有的呈鐮刀形，有的呈豆莢狀，透明，大多數(shù)具2～5 個橫隔，其大小為（19.8～39.2）μm×（2.9～4.3 μm）(圖1-C)。植株接種菌株 FJDO-1 菌絲塊7 d 后，可看到接種部位均出現(xiàn)帶有水漬狀的病斑，隨后莖稈皺縮，與田間自然發(fā)病植株癥狀完全相同(圖1-E、F)；而對照沒有出現(xiàn)發(fā)病癥狀。從接種發(fā)病的植株莖稈上取發(fā)病部位進(jìn)行再分離純化，獲得1 株與原接種菌株在培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征上一致的病原菌，進(jìn)一步確定菌株FJDO-1 為鐵皮石斛莖腐病病原菌。

2.3 菌株FJDO-1 的分子鑒定

選取ITS、ACT、EF1-α、RPB2 和LSU基因序列對菌株FJDO-1 基因組DNA 進(jìn)行PCR 擴增，分別得到大小為517、227、682、1178、565 bp 的片段。通過測序后將獲得的序列在GenBank 基因庫中進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)菌株FJDO-1（ITS、EF1-α、ACT、RPB2 和LSU序列登錄號分別為MK880499、MK895954、MW546934、MZ031970 和MZ031390），與尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum（ITS、EF1-α、ACT、RPB2 和LSU序列登錄號分別為MG198889、 LT841228、MH828025、MT305136 和JN938909）的同源性均達(dá)99 % 以上。 將獲得的MK880499、 MK895954、MW546934、MZ031970 和MZ031390 序列與GenBank中同源性較高的種的序列構(gòu)建多基因系統(tǒng)發(fā)育樹（表2，圖2），發(fā)現(xiàn)在多基因系統(tǒng)發(fā)育樹上，菌株FJDO-1 與尖孢鐮刀菌聚為一支，其遺傳距離最近，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征、致病性測定結(jié)果和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果確定引起鐵皮石斛莖腐病的病原菌為尖孢鐮刀菌F. oxysporum。

圖2 基于ITS/ACT/EF1-α/RPB2/LSU 基因序列采用鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Phylogenetic tree based on sequences of ITS/ACT/EF1-α/RPB2/LSU genes using neighbor-joining method

表2 基于ITS、ACT、EF1-α、RPB2 和LSU 基因系統(tǒng)發(fā)育樹登錄序列Table 2 Sequences of ITS, ACT, EF1-α, RPB2, and LSU genes for construction of phylogenetic tree

2.4 病原菌生物學(xué)特性

2.4.1 溫度對病原菌菌絲生長的影響 如圖3 所示，病原菌在15～40 ℃條件下均能生長，15～30 ℃時，菌絲生長速度呈升高趨勢，30～40 ℃時，菌絲生長速度呈下降趨勢。菌絲適宜生長溫度為25～30 ℃，在30 ℃時，菌絲生長最快，培養(yǎng)6 d 菌落直徑為80.33 mm。結(jié)果表明，該病原菌最適生長溫度為30 ℃，不耐低溫。

圖3 不同溫度對病原菌菌絲生長的影響Fig. 3 Effect of temperatures on mycelial growth of F.oxysporum

2.4.2 pH 對病原菌菌絲生長的影響 如圖4 所示，病原菌在pH 4～11 條件下均能生長，當(dāng)pH 為4～7 時菌絲生長速度呈升高趨勢，pH 8～11 時菌絲生長速度呈下降趨勢。菌絲適宜生長pH 為7 ～ 8，在pH 為 7 時菌絲生長最快，培養(yǎng) 6 d 菌落直徑為84.33 mm，結(jié)果表明，該病原菌喜中性或偏堿性環(huán)境，最適生長pH 值為7。

圖4 不同pH 對病原菌菌絲生長的影響Fig. 4 Effect of pHs on mycelial growth of F. oxysporum

2.4.3 光照條件對病原菌菌絲生長的影響 如圖5 所示，病原菌在不同光照條件下均能較好地生長，培養(yǎng) 6 d 菌落直徑分別為65.67 、74.00 和80.67 mm，具有差異顯著，病原菌在全光照條件下菌落直徑最大，說明該病原菌喜光照。

圖5 不同光照條件對病原菌菌絲生長的影響Fig. 5 Effect of light conditions on mycelial growth of F.oxysporum

2.4.4 碳源對病原菌菌絲生長的影響 病原菌在供試的5 種碳源中都可有效生長。其中乳糖、麥芽糖和葡萄糖為碳源的菌絲生長速度與缺碳源的對照組差異不顯著，以淀粉和蔗糖為碳源的菌絲生長速度顯著高于不含碳源的空白對照組，以淀粉為碳源的培養(yǎng)基菌落生長最快，培養(yǎng)6 d 后菌落直徑為73.67 mm，結(jié)果表明淀粉是病原菌菌絲生長的最佳供試碳源（圖6）。

圖6 不同碳源對病原菌菌絲生長的影響Fig. 6 Effect of carbon sources on mycelial growth of F.oxysporum

2.4.5 氮源對病原菌菌絲生長的影響 病原菌在供試的5 種氮源中都可有效生長，且差異顯著。其中以酵母為氮源的菌絲生長速度高于不含氮源的空白對照組，以蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基菌落生長最快，培養(yǎng)6 d 后菌落直徑為74.67 mm，結(jié)果表明蛋白胨是病原菌菌絲生長的最佳供試氮源（圖7）。

圖7 不同氮源對病原菌菌絲生長的影響Fig. 7 Effect of nitrogen sources on mycelial growth of F.oxysporum

3 討論與結(jié)論

本研究通過形態(tài)學(xué)，結(jié)合ITS、ACT、EF1-α、RPB2 和LSU等5 個基因序列分析鑒定了引起鐵皮石斛莖腐病的病原菌為尖孢鐮刀菌。目前，關(guān)于鐵皮石斛莖腐病病原菌報道的種類較多，趙桂華等[16]通過形態(tài)學(xué)和ITS序列鑒定江蘇省鐵皮石斛莖腐病菌為可可球二孢（Lasiodiplodia theobromae）；孫惠芳等[17]通過形態(tài)學(xué)和ITS序列鑒定云南大理鐵皮石斛莖腐病菌為茄病鐮孢菌（F. solani）；王國榮等[18]通過形態(tài)學(xué)和ITS序列鑒定浙江省杭州市蕭山區(qū)、義烏市和樂清市等地鐵皮石斛莖腐病菌為尖孢鐮刀菌（F.oxysporum），但是該病原并未造成維管束變色，與本研究結(jié)果不一致；曹星星[19]通過形態(tài)學(xué)和ITS及EF1-α基因序列鑒定浙江省永康市鐵皮石斛莖腐病菌為磚紅鐮孢菌（F. incarnatum）和層出鐮孢菌（F.proliferatum）；曹瑱艷等[1]認(rèn)為厚垣鐮刀菌為浙江省金華市武義縣鐵皮石斛根腐病的主要致病菌；李夢嬌[20]通過形態(tài)學(xué)和ITS序列鑒定云南省德宏州鐵皮石斛莖腐病菌為尖孢鐮刀菌（F. oxysporum），該病原可造成植株維管束變色，與本研究結(jié)果一致。

楊成前等[21]研究表明，尖孢鐮刀菌菌絲生長最適溫度為25～30 ℃，最適pH 為7，菌絲生長最適碳、氮源分別為蔗糖和甘氨酸。曹興等[22]指出尖孢鐮刀菌菌絲生長最適溫度為25 ℃，最適pH 值為5，最適碳源和氮源分別為乳糖和硝酸鈉，在12∶12 光暗交替條件下菌絲生長最快。蔣欣東等[23]研究表明，尖孢鐮刀菌菌絲生長最適溫度為25～30 ℃，最適pH 為10，在不同光照條件下生長趨勢差異不大。敬雪敏等[24]研究指出尖孢鐮刀菌菌絲生長最適溫度為25 ℃，pH 為7，最適碳源分別為可溶性淀粉和麥芽糖，最適氮源分別為尿素和蛋白胨，完全黑暗條件適于菌絲生長。本研究結(jié)果表明，病原菌在15～40 ℃條件下均能生長，適宜生長溫度為25～30 ℃，最適為30 ℃，最適pH 為7，這與楊成前等[21]研究結(jié)果基本一致；最適碳氮源分別為淀粉與蛋白胨，這與敬雪敏等[24]研究結(jié)果基本一致；光照有利于菌絲生長，這與以上結(jié)論存在差異，說明不同寄主上的尖孢鐮刀菌具有一定生物學(xué)上的差異，可成為下一步研究的方向，并且有關(guān)引起鐵皮石斛莖基腐病病原菌尖孢鐮刀菌的侵染機制和病害防治措施等方面仍需進(jìn)一步研究。