王一帆　陳子茵　賈新蕾　黃增朝　呂靜　黃郁蔥

摘 要：根據(jù)GenBank上登錄的紅笛鯛SR-BI基因設(shè)計(jì)引物，采用RT-PCR方法擴(kuò)增該基因胞外段序列，然后將該基因胞外段序列定向克隆到原核表達(dá)載體pET-28a（+）中，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，并對(duì)重組表達(dá)菌株的表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果顯示，成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET28a-SR-BI，并能在大腸桿菌BL21中表達(dá)，表達(dá)的融合蛋白分子量為50.0ku。融合蛋白的最佳誘導(dǎo)表達(dá)溫度、IPTG濃度和時(shí)間分別為16℃、0.05mmol/L和8h。研究結(jié)果為進(jìn)一步研究SR-BI的功能奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：紅笛鯛;SR-BI基因;原核表達(dá);條件優(yōu)化

中圖分類號(hào) S942.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 1007-7731（2021）03-0001-06

Prokaryotic Expression and Condition Optimization of SR-BI Gene in Lutjanus sanguineus

WANG Yifan et al

（Fisheries College of Guangdong Ocean University/Provincial Key Laboratory of Pathogenic Biology and Epidemiology for Aquatic Economic Animals of Guangdong & Key Laboratory of Control for Diseases of Aquatic Economic Animals of Guangdong Higher Education Institute， Zhanjiang 524088， China）

Abstract：A pair of primers were designed based on Scavenger receptor class B type I（SR-BI） gene sequence published in GenBank. The extracellular region sequence of SR-BI gene was amplified by RT-PCR and then inserted into the pET-28a（+） vector to construct prokaryotic expression plasmid. The recombinant plasmid was transformed into E.coli BL21 to overexpressed in the presence of isopropyl-β-D-thiogalato pyranos ide （IPTG）， and the expression conditions of the recombinant strain were optimized. The results showed that the prokaryotic expression plasmid pET28a-SR-BI was successfully constructed and expressed in E. coli BL21. The molecular weight of the expressed recombinant fusion protein was 50.0 ku. The optimal induction expression temperature， IPTG concentration and induction time of the recombinant fusion protein was 16℃， 0.05mmol/L and 8h， respectively. The research results laid the foundation for the further research on the functions of SR-BI.

Key words： Lutjanus sanguineus; SR-BI gene; Prokaryotic Expression; Condition optimization

清道夫受體（Scavenger Recptors，SRs）是一類與膜相關(guān)或可溶性的、能結(jié)合修飾后的LDL（Low-Density Lipoprotein）或其他多聚陰離子配體的跨膜糖蛋白[1]，首次發(fā)現(xiàn)于小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的巨噬細(xì)胞上存在攝取和降解乙?；兔芏戎鞍祝╝c-LDL）的結(jié)合位點(diǎn)，后來被稱為巨噬細(xì)胞清道夫受體1[2]。根據(jù)分子結(jié)構(gòu)、表達(dá)特征及與配體識(shí)別機(jī)制，目前已發(fā)現(xiàn)的清道夫受體至少包含8種不同類別（A、B、C、D、E、F、G、H）[1]。清道夫受體具有廣泛的受體識(shí)別譜，能夠識(shí)別修飾低密度脂蛋白、革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁成分的脂多糖（LPS）和革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁成分磷壁酸（LTA）多種微生物結(jié)構(gòu)成分，還可識(shí)別由細(xì)胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到膜外的磷脂酰絲氨酸，并能夠結(jié)合多種蛋白質(zhì)、核苷酸、多糖以及脂類等，參與機(jī)體一系列的生理和病理過程，包括動(dòng)脈粥樣硬化形成或抑制、阿爾茨海默氏病、宿主免疫防御、細(xì)胞粘附、凋亡細(xì)胞清除、組織保護(hù)和維護(hù)機(jī)體平衡等[3-5]，在動(dòng)物生命代謝過程中起著重要作用。

清道夫受體BI（Scavenger receptor class B type I，SR-BI）是哺乳動(dòng)物中研究較為深入的清道夫受體基因家族成員之一，與CD36和LIMPⅡ（lysosomal integral membrane protein Ⅱ）同屬B族清道夫受體[3]。SR-BI為典型的Ⅲ型跨膜糖蛋白，結(jié)構(gòu)如馬蹄樣，由5個(gè)區(qū)域構(gòu)成：1個(gè)大的環(huán)狀細(xì)胞外域、2個(gè)胞內(nèi)域、2個(gè)跨膜域，胞外域中間部分是主要的配體結(jié)合區(qū)域。SR-BI是目前在分子水平上證實(shí)的第一個(gè)高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）受體，介導(dǎo)脂質(zhì)的選擇性攝取和膽固醇的逆轉(zhuǎn)運(yùn)[6]。近年來，越來越多的研究表明，SR-BI不僅參與脂類代謝和與某些代謝性疾病的形成有關(guān)外，并且作為模式識(shí)別受體在機(jī)體先天性免疫中也發(fā)揮著重要作用[7-8]。SR-BI作為一種具有重要功能的模式識(shí)別受體，能夠識(shí)別許多病原相關(guān)分子模式，如LPS[9]、革蘭氏陰性菌（大腸桿菌、沙門氏菌）和革蘭氏陽性菌（金黃色葡萄球菌、李斯特氏菌）[10]及結(jié)核桿菌[11]等，因此作為吞噬性受體直接介導(dǎo)非調(diào)理素病原微生物的吞噬或者與TLR（Toll-like receptors）形成共受體調(diào)節(jié)促炎癥反應(yīng)因子共同應(yīng)答病原微生物，在對(duì)外來病原，特別是對(duì)細(xì)菌及其炎癥反應(yīng)復(fù)合物的免疫應(yīng)答中發(fā)揮關(guān)鍵作用。此外，有研究表明，SR-BI作為（hepatitis C virus，HCV）進(jìn)入宿主肝細(xì)胞的一個(gè)可能的靶受體，與丙型肝炎病毒的入侵和感染有關(guān)[12-13]。

目前，在水生動(dòng)物的相關(guān)研究較少，目前僅有大西洋鮭（Salmo salar L.）[14]、日本沼蝦（Macrobrachium nipponense）[15]、日本囊對(duì)蝦（Marsupenaeus japonicus）[16]和菲律賓簾蛤[17]等水生動(dòng)物的SR-BI基因得到克隆鑒定，研究發(fā)現(xiàn)水生動(dòng)物SR-BI與哺乳動(dòng)物SR-BI具有相似的結(jié)構(gòu)特征，參與脂質(zhì)代謝和抗菌免疫，但對(duì)于魚類的SR-BI的功能尚未有相關(guān)的研究報(bào)道。紅笛鯛（Lutjanus sanguineus）是我國(guó)南方沿海地區(qū)重要的海水養(yǎng)殖魚種，然而隨著集約化養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大和養(yǎng)殖環(huán)境日益惡化，病害頻繁暴發(fā)，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[18]。目前，對(duì)于紅笛鯛的免疫系統(tǒng)研究尚處起步階段，已獲得了紅笛鯛的SR-BI基因全長(zhǎng)，但尚未見相關(guān)的蛋白水平研究。系統(tǒng)研究紅笛鯛SR-BI基因的功能，對(duì)于闡明魚類的脂類代謝、免疫識(shí)別等重要生理機(jī)制具有重要意義。為此，本研究通過構(gòu)建SR-BI蛋白胞外段基因的原核表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)入到原核表達(dá)載體BL21中進(jìn)行SR-BI重組蛋白的表達(dá)，對(duì)誘導(dǎo)溫度、IPTG濃度和誘導(dǎo)時(shí)間等表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)SR-BI蛋白進(jìn)行純化和鑒定，以期為進(jìn)一步研究紅笛鯛SR-BI的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 試驗(yàn)用健康紅笛鯛（體質(zhì)量約500g）購(gòu)自湛江某海水養(yǎng)殖場(chǎng);原核表達(dá)載體pET-28a（+）、大腸桿菌BL21由本實(shí)驗(yàn)室保存;總RNA提取試劑盒（TriZolTM Up Plus RNA Kit）、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TransScript? One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix）購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)公司;質(zhì)粒提取試劑盒（GeneJET Plasmid Miniprep Kit）、瓊脂糖凝膠回收試劑盒（GeneJET Gel Extraction Kit）購(gòu)自賽默飛世爾科技（Thermo Fisher Scientific）公司;引物、氨芐西林（Amp+）、異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）購(gòu)自上海生工生物工程有限公司;考馬斯亮藍(lán)快速染色液、一抗、二抗購(gòu)自天根生化公司。其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 SR-BI基因的擴(kuò)增 在無菌條件下取紅笛鯛的脾、頭腎組織，加入液氮研磨組織，于無RNA酶操作環(huán)境下參總RNA抽提試劑盒說明書提取組織總RNA。1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的完整性，紫外分光光度法檢測(cè)其純度和濃度，確保其OD260/OD280在1.8～2.0。組織的總RNA按照cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA第一鏈，置-40℃保存待用。根據(jù)筆者提交NCBI的紅笛鯛SR-BI基因胞外段序列（GenBank登錄號(hào)：MW246167）設(shè)計(jì)含EcoRI和XhoI酶切位點(diǎn)上下游引物F/R，上游引物F：CCGGAATTCATGGACGACCAGATCGTTAAAAAC，下游引物R：CCGCTCGAGTTATTCCATAACAGCCGGC。PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以cDNA作為模板擴(kuò)增SR-BI蛋白的胞外段基因序列，PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃、3min，94℃、30s，60℃、30s，72℃、60s;35個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后72℃延伸6min。PCR反應(yīng)結(jié)束后其產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，擴(kuò)增的目的片段條帶按切膠回收試劑盒說明書進(jìn)行切膠回收，回收產(chǎn)物與pMD-18T 載體連接并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)，涂布于氨芐青霉素（AMP）濃度為100μg/mL的LB瓊脂培養(yǎng)基上，挑取單克隆并進(jìn)行菌落PCR鑒定，陽性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2 原核表達(dá)載體pET28a-SR-BI的構(gòu)建 將序列測(cè)序正確的pMD-18T-SR-BI重組質(zhì)粒與原核表達(dá)空質(zhì)粒pET28a參質(zhì)粒提取說明書分別提取質(zhì)粒，然后用限制性內(nèi)切酶EcoRI和XhoI分別進(jìn)行雙酶切，37℃溫水浴中2～3h后，將酶切產(chǎn)物分別進(jìn)行瓊脂凝膠電泳和切膠回收。將純化后的酶切產(chǎn)物利用T4 DNA連接酶連接到表達(dá)質(zhì)粒pET28a構(gòu)建成重組質(zhì)粒pET28a-SR-BI，然后轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21，涂布于Kana+的LB瓊脂培養(yǎng)基上，進(jìn)行菌落PCR鑒定，陽性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，確保構(gòu)建的表達(dá)序列不突變和移碼。

1.2.3 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá) 將含有重組質(zhì)粒pET28a-SR-BI和空質(zhì)粒pET28a的BL21分別接種于含100μg/mLKana+的LB中，37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)過夜，將活化的菌種按照1：100的比例接種于含100μg/mLKana+的LB中，37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)至吸光度（OD600）達(dá)0.4～0.6，然后加入0.5mmol/L的誘導(dǎo)劑異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)6h，取1mL菌液12000g離心1min收集菌液，使用無菌PBS洗滌3次，加入50μL的PBS懸浮菌體，按照1∶5比例加入6×Loading Buffer混勻，100℃煮沸5min，離心后取上清進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析。

1.2.4 原核表達(dá)的條件優(yōu)化

1.2.4.1 溫度 IPTG誘導(dǎo)濃度設(shè)置為0.1mmol/L，分別于11℃、16℃、22℃和28℃恒溫條件下200r振蕩培養(yǎng)6h，分別離心收集菌體，用PBS清洗菌體后進(jìn)行超聲破碎。超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)的程序設(shè)置為：功率為200w，破碎行6s，間隔8s，破碎至菌液澄清透亮，高速離心分離上清和沉淀，SDS-PAGE分析目的蛋白的表達(dá)量。

1.2.4.2 IPTG濃度 IPTG誘導(dǎo)濃度分別設(shè)置為0.05、0.1、0.4和0.7mmol/L，16℃、200r/min振蕩培養(yǎng)6h后分別取樣，分別離心收集菌液，蛋白提取和SDS-PAG方法同1.2.4.1。

本研究構(gòu)建了的原核表達(dá)載體pET28a-SR-BI，并在大腸桿菌中成功表達(dá)，獲得了融合蛋白最佳誘導(dǎo)表達(dá)溫度、IPTG誘導(dǎo)濃度和誘導(dǎo)時(shí)間分別為16℃、0.05mmol/L和8h，表達(dá)的融合蛋白分子量為50.0ku。

參考文獻(xiàn)

[1]Plüddemann A，Neyen C，Gordon S.Macrophage scavenger receptors and host-derived ligands[J].Methods，2007，43（3）：207-217.

[2]Goldstein J L，Ho Y K，Basu S K，et al.Binding site on macrophages that mediates uptake and degradation of acetylated low density lipoprotein，producing massive cholesterol deposition[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1979，76（1）：333-337.

[3]Murphy J E，Tedbury P R，Homer-Vanniasinkam S，et al.Biochemistry and cell biology of mammalian scavenger receptors[J].Atherosclerosis，2005，182（1）：1-15.

[4]Areschoug T，Gordon S.Scavenger receptors：role in innate immunity and microbial pathogenesis[J].Cellular microbiology，2009，11（8）：1160-1169.

[5]Canton J，Neculai D，Grinstein S.Scavenger receptors in homeostasis and immunity[J].Nature reviews.Immunology，2013，13（9）：621-634.

[6]Acton S，Rigotti A，Landschulz K T，et al.Identification of scavenger receptor SR-BI as a high density lipoprotein receptor[J]. Science，1996，271（5248）：518-520.

[7]董占鵬，柴春利，代方銀，等.家蠶B型清道夫受體基因的鑒定及系統(tǒng)發(fā)生與表達(dá)分析[J].蠶業(yè)科學(xué)，2010，36（05）：743-753.

[8]Peiser L，Mukhopadhyay S，Gordon S.Scavenger receptors in innate immunity[J].Current opinion in immunology，2002，14（1）：123-128.

[9]Vishnyakova T G，Bocharov A V，Baranova I N，et al.Binding and internalization of lipopolysaccharide by Cla-1，a human orthologue of rodent scavenger receptor B1[J].The Journal of biological chemistry，2003，278（25）：22771-22780.

[10]Vishnyakova T G，Kurlander R，Bocharov A V，et al.CLA-1 and its splicing variant CLA-2 mediate bacterial adhesion and cytosolic bacterial invasion in mammalian cells[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2006，103（45）：16888-16893.

[11]Philips J A，Rubin E J，Perrimon N.Drosophila RNAi screen reveals CD36 family member required for mycobacterial infection[J].Science，2005，309（5738）：1251-1253.

[12]Dubuisson J，Helle F，Cocquerel L.Early steps of the hepatitis C virus life cycle[J].Cellular microbiology，2008，10（4）：821-827.

[13]Lavillette D，Tarr A W，Voisset C，et al.Characterization of host-range and cell entry properties of the major genotypes and subtypes of hepatitis C virus[J].Hepatology，2005，41（2）：265-274.

[14]Kleveland E J，Syvertsen B L，Ruyter B，et al.Characterization of scavenger receptor class B，type I in Atlantic salmon （Salmo salar L.） [J].Lipids，2006，41（11）：1017-1027.

[15]Ding Z，Luo N，Kong Y，et al.Scavenger Receptor Class B，Type I，a CD36 Related Protein in Macrobrachium nipponense：Characterization，RNA Interference，and Expression Analysis with Different Dietary Lipid Sources[J].International journal of genomics，2016，6325927.

[16]Bi W J，Li D X，Xu Y H，et al.Scavenger receptor B protects shrimp from bacteria by enhancing phagocytosis and regulating expression of antimicrobial peptides[J].Developmental and comparative immunology，2015，51（1）：10-21.

[17]Yang D，Han Y，Chen L，et al.Scavenger receptor class B type I （SR-BI） in Ruditapes philippinarum：A versatile receptor with multiple functions[J]. Fish & shellfish immunology，2019，88：328-334.

[18]Zhang X，Dai L，Wu Z，et al.Molecular cloning，mRNA expression，and characterization of heat shock protein 10 gene from humphead snapper Lutjanus sanguineus[J].Marine genomics，2011，4（3）：143-150.

[19]Silverstein R L，F(xiàn)ebbraio M.CD36，a scavenger receptor involved in immunity，metabolism，angiogenesis，and behavior[J].Science signaling，2009，2（72）：re3.

[20]Rosano G L，Ceccarelli E A.Recombinant protein expression in Escherichia coli：advances and challenges[J].Frontiers in microbiology，2014，05：172.

[21]黃瑜，牛金中，湯菊芬，等.尼羅羅非魚NCCRP-1基因的原核表達(dá)及條件優(yōu)化[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2018，37（09）：3753-3758.

[22]Donovan R S，Robinson C W，Glick B R.， et al.Optimizing the expression of a monoclonal antibody fragment under the transcriptional control of the Escherichia coli lac promoter[J].Canadian journal of microbiology，2000，46（6）：532-541.

[23]Meng Z，Zhang X Y，Guo J，et al.Scavenger receptor in fish is alipopolysaccharide recognition molecule involved in negative regulation of NF-κB activation by competing with TNF receptor-associated factor 2 recruitment into the TNF-α signaling pathway[J].Journal of immunology，2012，189（8）：4024-4439.

[24]楊晰朦，陳香梅.結(jié)核分枝桿菌ESAT6-CFP10融合蛋白的原核表達(dá)及其表達(dá)條件的優(yōu)化[J].中國(guó)生物制品學(xué)雜志，2020，33（03）：286-292.

（責(zé)編：張宏民）

基金項(xiàng)目：廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2016A030313748）;大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃（CXXL2019139）;南方海洋科學(xué)與工程廣東實(shí)驗(yàn)室（湛江）自主項(xiàng)目（ZJW-2019-06）。

作者簡(jiǎn)介：王一帆（1996—），男，河北人，碩士生，研究方向：水產(chǎn)動(dòng)物病害防治。 *通訊作者? 收稿日期：2020-12-24