史 浩 沙玉柱 魏 紅 呂衛(wèi)兵 文禹梁 劉 秀 羅玉柱 王繼卿 李少斌 胡 江

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅省草食動物生物技術(shù)重點實驗室，蘭州 730070)

藏綿羊又稱藏系綿羊，是中國三大原始綿羊品種(蒙古羊、藏綿羊、哈薩克羊)之一，繁育在海拔3 000 m以上的青藏高原地區(qū)，存欄量約2 500萬只，是中國群體數(shù)量最大的綿羊品種。藏綿羊生活在高寒低氧的環(huán)境中，全年放牧飼養(yǎng)，主要通過采食天然牧草獲取營養(yǎng)。

藏綿羊?qū)η嗖馗咴母吆脱鹾屠浼緺I養(yǎng)匱乏等嚴(yán)酷生態(tài)因子具有較好的適應(yīng)性，但暖、冷季營養(yǎng)供給嚴(yán)重不均衡是限制藏綿羊產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要因素。所以，解析藏綿羊應(yīng)對冷季營養(yǎng)脅迫的適應(yīng)策略、提高藏綿羊適應(yīng)冷季營養(yǎng)匱乏的能力成為其保護(hù)利用的主要目標(biāo)。

動物的生長、發(fā)育和健康(所有功能)都受到所處環(huán)境微生物的影響，并決定了宿主的生理、行為、生態(tài)和進(jìn)化[1-2]。多樣化和反應(yīng)靈敏的腸道菌群是動物適應(yīng)的重要機制，使動物個體能夠適應(yīng)飼糧營養(yǎng)成分和質(zhì)量隨季節(jié)變化而變化的廣泛采食[3]。瘤胃是反芻動物發(fā)酵、消化和代謝的重要場所，對反芻動物營養(yǎng)物質(zhì)消化和吸收起著至關(guān)重要的作用[4]。反芻動物瘤胃中含有大量微生物，包括細(xì)菌、原蟲和真菌等，其中細(xì)菌種類最多，約7 000種，在瘤胃中通過發(fā)酵對纖維物質(zhì)進(jìn)行消化吸收[5]。根據(jù)底物和發(fā)酵產(chǎn)物不同，將細(xì)菌分為纖維降解菌[包括黃色瘤胃球菌(Ruminococcusflavefaciens)、白色瘤胃球菌(Ruminococcusalbus)、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌(Fibrobactersuccinogenes)]、部分溶纖維丁酸弧菌、半纖維素降解菌、蛋白質(zhì)降解菌[包括溶纖維丁酸弧菌(Butyrivibriofibrisolvens)和嗜淀粉瘤胃桿菌(Ruminobacteramylophilus)]、脂肪降解菌等[6-8]；瘤胃中的原蟲主要為纖毛蟲和極少數(shù)的鞭毛蟲，雖在瘤胃中少于細(xì)菌，但體積較大，占瘤胃微生物的30%～80%，由于牧草營養(yǎng)成分的影響，反芻動物瘤胃中的細(xì)菌及原蟲數(shù)量與種類也會隨之發(fā)生改變[9-10]。

短鏈脂肪酸(short-chain fatty acid，SCFA)與反芻動物瘤胃營養(yǎng)以及瘤胃微生物之間有著密切的關(guān)系，瘤胃通過對養(yǎng)分的消化吸收產(chǎn)生大量SCFA，且不同種類SCFA對反芻動物生理作用不同，SCFA是有機物質(zhì)在瘤胃中發(fā)酵的主要產(chǎn)物，同時，可以使瘤胃保持一個理想的酸性環(huán)境，從而形成一個良性循環(huán)的瘤胃環(huán)境[11-12]。相對于瘤胃微生物來說，瘤胃中的SCFA由瘤胃微生物厭氧發(fā)酵產(chǎn)生，包括甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸和異戊酸等，對動物體代謝作用最為重要的有乙酸、丙酸和丁酸，約占瘤胃SCFA的95%[13]。研究顯示，瘤胃微生物的組成和多樣性也與瘤胃SCFA組成相關(guān)[14]。目前，針對藏綿羊不同季節(jié)瘤胃微生物菌群密度與SCFA濃度互作的研究鮮見報道，已有研究主要針對藏綿羊瘤胃纖毛蟲種群動態(tài)受季節(jié)影響、瘤胃細(xì)菌數(shù)量及其放牧地牧草養(yǎng)分隨季節(jié)變化以及放牧綿羊瘤胃液中SCFA濃度隨季節(jié)而發(fā)生動態(tài)變化[9,15-16]。因此，本試驗旨在探討暖、冷季藏綿羊瘤胃SCFA濃度、微生物菌群密度及其互作特征，進(jìn)而為藏綿羊應(yīng)對不同季節(jié)營養(yǎng)供給變化的適應(yīng)機制研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及樣品采集

在甘肅省甘南藏族自治州合作市佐蓋曼瑪鄉(xiāng)(海拔3 300 m)同一牧戶羊群選取1周歲(±1月齡)、身體健康、體重[(35.12±1.43)kg]相近、自然放牧的歐拉型藏綿羊母羊12只。分別在7(暖季)和12月(冷季)采集藏綿羊瘤胃液。試驗羊只歸牧后，在次日早晨測量體重，利用羊用胃管式瘤胃采樣器采集瘤胃液，將樣品立刻放入準(zhǔn)備好的液氮罐中進(jìn)行冷凍保存，帶回實驗室-80 ℃保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 藏綿羊瘤胃SCFA濃度測定

利用島津(GC-2010 plus)氣相色譜儀測定瘤胃SCFA濃度，內(nèi)標(biāo)為2-乙基丁酸(2EB)，色譜柱：AT-FFAP(50 m×0.32 mm×0.25 μm)毛細(xì)管柱。色譜柱程序升溫：溫度60 ℃保持1 min，以5 ℃/min升至115 ℃，不保留，再以15 ℃/min升至180 ℃，檢測器溫度260 ℃，進(jìn)樣口溫度250 ℃。

1.2.2 瘤胃微生物菌群密度測定

利用天根糞便基因組DNA提取試劑盒(DP-328)提取藏綿羊瘤胃微生物總DNA。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性和純度，用超微量分光光度計(Therm Nano Drop-2000)檢測OD260/280的值。

以瘤胃微生物DNA為模板，選取產(chǎn)甲烷菌(Methanogenic bacteria)、蛋白質(zhì)降解菌(包括溶纖維丁酸弧菌和嗜淀粉瘤胃桿菌)、纖維降解菌(產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌、黃色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌)進(jìn)行相對定量研究。利用NCBI BLAST(www.ncbi.nih.gov/BLAST)搜尋菌群16S rRNA序列，采用Primers軟件設(shè)計特異性引物(表1)，引物由上海生物工程有限公司合成。以細(xì)菌為內(nèi)參，引物序列參考Muyze等[17]研究方法，利用熒光定量PCR儀(ABI QuantStudio-6)測定微生物黃色瘤胃球菌、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌、白色瘤胃球菌、嗜淀粉瘤胃桿菌、溶纖維丁酸弧菌和產(chǎn)甲烷菌的相對密度。PCR反應(yīng)體系20 μL：2×SuperReal PreMix Plus 10 μL，上、下游引物各0.6 μL，模板1 μL，50×Rox Reference Dye 0.4 μL，ddH2O 7.4 μL。反應(yīng)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性15 min;95 ℃變性10 s，60 ℃退火32 s，共40個循環(huán)。

表1 菌群引物序列

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)利用Excel 2010進(jìn)行整理，然后采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示。SCFA濃度及比例進(jìn)行獨立樣本t檢驗和單因素方差分析，目的菌相對密度采用2-△△Ct法分析。瘤胃SCFA濃度與微生物區(qū)系相對密度進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 藏綿羊暖、冷季瘤胃SCFA濃度及比例的測定結(jié)果

由表2可知，冷季總SCFA濃度顯著高于暖季(P<0.05)，其中，乙酸與丙酸濃度在冷季顯著高于暖季(P<0.05)，而其他SCFA濃度在暖、冷季無顯著差異(P>0.05)；各種SCFA所占比例分析發(fā)現(xiàn)，異丁酸比例在暖、冷季無顯著差異(P>0.05)，冷季乙酸、丙酸比例顯著高于暖季(P<0.05)，而暖季丁酸、異丁酸、異戊酸、戊酸比例顯著高于冷季(P<0.05)。冷季乙酸/丙酸顯著高于暖季(P<0.05)。

表2 藏綿羊瘤胃SCFA濃度及比例的測定結(jié)果

2.2 藏綿羊暖、冷季瘤胃微生物菌群密度的測定結(jié)果

由圖1可知，藏綿羊暖、冷季瘤胃微生物菌群密度存在顯著差異(P<0.05)，暖季瘤胃黃色瘤胃球菌、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌、白色瘤胃球菌、嗜淀粉瘤胃桿菌和產(chǎn)甲烷菌的相對密度顯著高于冷季(P<0.05)；暖季瘤胃微生物菌群中黃色瘤胃球菌、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌和溶纖維丁酸弧菌之間的相對密度均差異顯著(P<0.05)，而白色瘤胃球菌、嗜淀粉瘤胃桿菌和產(chǎn)甲烷菌之間相對密度差異不顯著(P>0.05)；冷季瘤胃微生物菌群中黃色瘤胃球菌和產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌的相對密度差異顯著(P<0.05)，而白色瘤胃球菌、嗜淀粉瘤胃桿菌、溶纖維丁酸弧菌和產(chǎn)甲烷菌之間相對密度差異不顯著(P>0.05)。

Rf：黃色瘤胃球菌 Ruminococcus flavefaciens；Fs：產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌 Fibrobacter succinogenes；Ra：白色瘤胃球菌 Ruminococcus albus；Ram：嗜淀粉瘤胃桿菌 Ruminobacter amylophilus；Bf：溶纖維丁酸弧菌 Butyrivibrio fibrisolvens；MB：產(chǎn)甲烷菌 Methanogenic bacteria。

2.3 藏綿羊暖、冷季瘤胃SCFA濃度與其菌群密度的相關(guān)性分析

由表4可知，6種SCFA濃度之間存在相關(guān)性，其中，乙酸、丙酸與異戊酸、戊酸濃度呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，而乙酸與異丁酸濃度呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，相關(guān)性系數(shù)均大于0.900；反之，異丁酸與異戊酸、戊酸濃度呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，相關(guān)系數(shù)均在0.950以上；其中丁酸與其他5種SCFA濃度之間無顯著相關(guān)性(P>0.05)。

表4 藏綿羊暖、冷季瘤胃SCFA濃度間相關(guān)性分析

由表5可知，SCFA濃度與微生物菌群相對密度之間存在相關(guān)性，其中，乙酸濃度與黃色瘤胃球菌相對密度呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，相關(guān)系數(shù)大于0.950，與產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌、嗜淀粉瘤胃桿菌、溶纖維丁酸弧菌、產(chǎn)甲烷菌相對密度呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)；丙酸濃度與白色瘤胃球菌相對密度呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，相關(guān)系數(shù)大于0.900，與產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌相對密度呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)；異戊酸、戊酸濃度與黃色瘤胃球菌相對密度呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，相關(guān)系數(shù)均在0.950以上；異戊酸、戊酸濃度與白色瘤胃球菌相對密度呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，相關(guān)系數(shù)均在0.850以上；反之，異丁酸、異戊酸、戊酸濃度與黃色瘤胃球菌、溶纖維丁酸弧菌、產(chǎn)甲烷菌相對密度呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。另外，丙酸濃度與黃色瘤胃球菌、嗜淀粉瘤胃桿菌、溶纖維丁酸弧菌、產(chǎn)甲烷菌相對密度之間無顯著相關(guān)性(P>0.05)，而丁酸濃度與6種微生物菌種相對密度均無顯著相關(guān)性(P>0.05)。

表5 藏綿羊暖、冷季瘤胃SCFA濃度與微生物菌群相對密度的相關(guān)分析

3 討 論

3.1 藏綿羊暖、冷季瘤胃SCFA濃度變化特征

SCFA濃度是衡量瘤胃發(fā)酵方式與能力的關(guān)鍵參數(shù)，也是藏綿羊瘤胃微生物合成的重要能量來源[18]。瘤胃SCFA濃度和組成差異主要是由于飼糧的差異(即中性洗滌纖維)，導(dǎo)致瘤胃微生物活性和比例的不同，最終影響瘤胃SCFA濃度和組成[19]。在本試驗中，藏綿羊冷季瘤胃中乙酸、丙酸濃度顯著高于暖季，可能與暖季牧草營養(yǎng)豐富、個體采食量大、瘤胃易發(fā)酵、體內(nèi)碳水化合物充足有關(guān)，為瘤胃微生物生長提供充足養(yǎng)分，從而為產(chǎn)乙酸菌生長增殖提供充足的氮源。瘤胃內(nèi)纖維分解菌生長速度快，分解纖維能力顯著增加，為甲烷菌生長增殖提供充足的氫源，產(chǎn)乙酸菌與甲烷菌通過氫氣和二氧化碳反應(yīng)生產(chǎn)甲烷與乙酸，且甲烷含量高于乙酸。因此，暖季甲烷含量升高導(dǎo)致乙酸含量降低[20]。從各種SCFA所占比例進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)異丁酸比例在暖、冷季間無顯著差異，冷季乙酸比例顯著高于暖季，而丁酸和其他SCFA比例則是暖季顯著高于冷季。另外，乙酸/丙酸在冷季顯著高于暖季，這與魏德泳等[21]研究結(jié)果一致。在枯草期，牧草中結(jié)構(gòu)性碳水化合物含量較高，中性洗滌纖維含量高于青草期和返青期，纖維含量較高，乙酸發(fā)酵為主，使得瘤胃乙酸/丙酸升高。SCFA濃度是瘤胃發(fā)酵的主要指標(biāo)之一[22]，SCFA為反芻動物提供70%～80%的能量，其中，乙酸、丙酸和丁酸是SCFA的主要組成，占SCFA的95%，與能量的利用率有著很大的關(guān)聯(lián)[23]，而本研究中，藏綿羊冷季瘤胃中乙酸、丙酸濃度顯著高于暖季，可能與藏綿羊特殊的冷季適應(yīng)性有關(guān)，為應(yīng)對嚴(yán)酷的冷季環(huán)境，表現(xiàn)出高效的能量利用效率。王月[24]研究表明，季節(jié)變化對內(nèi)蒙古白絨山羊瘤胃發(fā)酵特性及其微生物區(qū)系有一定的影響，阿爾巴斯型和二狼山型絨山羊冷季瘤胃中乙酸濃度顯著高于暖季；暖季阿拉善型羊瘤胃SCFA濃度顯著高于其他2個類型，而冷季則顯著低于其他2個類型，前者與本試驗結(jié)果一致；后者與本試驗結(jié)果相反，可能由于地域的差異及環(huán)境不同造成。

3.2 藏綿羊暖、冷季瘤胃微生物菌群密度變化特征

反芻動物出生時，瘤胃內(nèi)并無微生物，隨著出生1 d后，通過母畜的哺乳及周邊環(huán)境的影響，在體內(nèi)形成了瘤胃微生物區(qū)系并逐漸完善，進(jìn)而達(dá)到一個相對穩(wěn)定及平衡的狀態(tài)，瘤胃微生物包括細(xì)菌、原蟲和真菌三大類，瘤胃微生物的組成及結(jié)構(gòu)不僅對維持瘤胃吸收與健康具有重要作用，還是調(diào)控瘤胃微生物區(qū)系的重要組成[25-26]。李長青等[27]對放牧綿羊不同季節(jié)瘤胃細(xì)菌多樣性動態(tài)變化特征研究發(fā)現(xiàn)，牧草的營養(yǎng)狀況能顯著影響瘤胃的細(xì)菌分布，導(dǎo)致不同季節(jié)瘤胃消化不同；研究表明，依靠瘤胃降解的纖維細(xì)菌主要有3種，分別為黃色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌和產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌[28]。同時，瘤胃中還有大量產(chǎn)甲烷菌，可將其他微生物發(fā)酵產(chǎn)生甲烷，通過打嗝排出體外，雖不利于環(huán)境保護(hù)，但在瘤胃中能維持正常的氫氣分壓及瘤胃的發(fā)酵并起著重要的作用[29]。本試驗中，藏綿羊暖、冷季瘤胃微生物菌群中黃色瘤胃球菌、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌、白色瘤胃球菌、嗜淀粉瘤胃桿菌、產(chǎn)甲烷菌、溶纖維丁酸弧菌的相對密度為暖季顯著高于冷季?？赡芘c暖季個體采食量大、牧草營養(yǎng)豐富易發(fā)酵產(chǎn)生充足的碳水化合物有關(guān)，為瘤胃微生物生長提供充足養(yǎng)分，瘤胃中纖維素含量增加的同時纖維分解菌的數(shù)量也相應(yīng)增加，能夠向瘤胃微生物提供更多易消化的細(xì)胞壁物質(zhì)、蛋白質(zhì)和營養(yǎng)底物，有利于刺激纖維分解菌的生長和繁殖，與劉大程等[30]的研究結(jié)果一致。阿拉善型絨山羊產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌、黃色瘤胃球菌相對密度暖季顯著高于冷季，白色瘤胃球菌相對密度暖、冷季間差異不顯著[31]，與本試驗結(jié)果一致。本試驗中，冷季瘤胃微生物菌群中黃色瘤胃球菌和產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌的相對密度差異顯著，而白色瘤胃球菌、嗜淀粉瘤胃桿菌、溶纖維丁酸弧菌和產(chǎn)甲烷菌相對密度差異不顯著，與靳繼鵬等[32]的研究結(jié)果一致；另外，本試驗中，暖、冷季瘤胃微生物菌群中產(chǎn)甲烷菌相對密度差異不顯著，與淡瑞芳等[33]的研究結(jié)果一致。同時，高海拔的藏綿羊相比低海拔藏綿羊產(chǎn)甲烷菌含量低[34]。所以，飼草質(zhì)量、SCFA濃度、海拔等都會影響瘤胃微生物菌群多樣性及密度，因而，對動物瘤胃的菌群密度進(jìn)行研究，將有助于揭示動物的適應(yīng)性機制，從而為動物的飼養(yǎng)管理提供參考。

3.3 藏綿羊瘤胃SCFA濃度與微生物菌群密度的相關(guān)性

瘤胃SCFA濃度與反芻動物瘤胃營養(yǎng)以及瘤胃微生物之間存在著密切的關(guān)系，通過對養(yǎng)分的消化吸收產(chǎn)生大量的SCFA，且不同種類SCFA對反芻動物生理作用不同，瘤胃微生物是有機物質(zhì)在瘤胃中發(fā)酵的主要產(chǎn)物，其中的一部分被其他微生物所利用。瘤胃中產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌和黃色瘤胃球菌通過分解纖維素主要產(chǎn)生乙酸和琥珀酸鹽，而白色瘤胃球菌的主要發(fā)酵產(chǎn)物是乙酸，嗜淀粉瘤胃桿菌、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌、黃色瘤胃球菌及其他細(xì)菌等也產(chǎn)生琥珀酸鹽，琥珀酸鹽是丙酸產(chǎn)生的中間產(chǎn)物，黃色瘤胃球菌的最終代謝產(chǎn)物主要是氫、乙酸和甲酸，以及少量的乙醇和乳酸[35]。本試驗發(fā)現(xiàn)，藏綿羊瘤胃乙酸和丙酸濃度與產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌相對密度呈顯著負(fù)相關(guān)，乙酸濃度與黃色瘤胃球菌相對密度呈顯著正相關(guān)，說明黃色瘤胃球菌是藏綿羊乙酸產(chǎn)生的重要分解菌群，也是藏綿羊瘤胃能量供給的重要SCFA。鐘書[36]通過對溫濕度指數(shù)(THI)介導(dǎo)山羊瘤胃細(xì)菌群落的變化研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌相對密度與丙酸濃度呈負(fù)相關(guān)，與乙酸濃度呈正相關(guān)，前者與本試驗結(jié)果一致，后者與本試驗結(jié)果相反，可能隨著暖、冷季的變化，瘤胃發(fā)酵類型趨于乙酸型，緩解纖維素分解菌的抑制，使瘤胃內(nèi)氫的濃度升高，從而促進(jìn)甲烷菌生長，增加了甲烷的產(chǎn)量；另外，Yang等[37]研究結(jié)果表明，乙酸濃度與產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌相對密度呈顯著正相關(guān)，與本試驗結(jié)果一致。

4 結(jié) 論

暖、冷季瘤胃微生物菌群密度與SCFA濃度存在顯著性差異；進(jìn)一步相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，SCFA濃度與菌群密度之間存在一定的相關(guān)性，這種互作機制可能在藏綿羊應(yīng)對暖、冷季的適應(yīng)性方面發(fā)揮著重要作用，研究結(jié)果將為藏綿羊產(chǎn)業(yè)發(fā)展及種質(zhì)資源保護(hù)利用提供參考。