符清瑤 施力光 周漢林 曹 婷 馬中華 姜宏正 荀文娟,*

(1.海南大學(xué)動物科技學(xué)院，?？?570228；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所，儋州 571737)

氧化應(yīng)激被認為是體內(nèi)所釋放的氧化自由基超過機體本身的抗氧化水平，引發(fā)機體發(fā)生不同的生理或病理現(xiàn)象。當仔豬發(fā)生氧化應(yīng)激時會破壞自由基代謝和抗氧化系統(tǒng)[1]，從而發(fā)生嚴重的氧化應(yīng)激反應(yīng)，由此使機體免疫系統(tǒng)損壞，引發(fā)炎癥反應(yīng)[2]，同時還與腸道健康有關(guān)，可導(dǎo)致腸黏膜屏障功能受損[3]。Li等[4]研究表明，敵草快(Diquat)誘導(dǎo)的仔豬氧化應(yīng)激會顯著降低回腸黏膜結(jié)構(gòu)的絨毛高度/隱窩深度(V/C)，導(dǎo)致腸絨毛形態(tài)發(fā)育不完整。Zheng等[5]研究發(fā)現(xiàn)，仔豬腹腔注射Diquat顯著提高血清中皮質(zhì)醇和丙二醛(MDA)的含量，造成仔豬抗氧化能力下降，導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)的吸收減少。因此，尋找一種緩解仔豬腸道氧化應(yīng)激的飼料添加劑對于仔豬的生產(chǎn)具有實際意義。

白藜蘆醇(Res)是一種植物多酚，屬于植物抗毒素類的二苯乙烯家族[6]，在體內(nèi)外均表現(xiàn)出強大的抗氧化活性[7-8]。因其具備廣泛的生物活性而備受關(guān)注，其中還包括抗炎、抗癌、抗衰老、保護心血管和調(diào)控脂肪沉積等作用[9-13]。Meng等[14]研究發(fā)現(xiàn)，Res能夠通過上調(diào)核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)蛋白表達水平，下調(diào)Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1(Keap1)蛋白表達水平，從而激活Nrf2信號通路；并上調(diào)Nrf2調(diào)節(jié)的抗氧化防御系統(tǒng)相關(guān)基因表達，包括過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物1型酶(GPX1)和血紅素加氧酶1(HO1)，提高了母豬妊娠期胎盤的抗氧化能力。另有研究表明，Res可以調(diào)節(jié)斷奶仔豬腸道微生物群，抑制Toll樣受體4(TLR4)信號通路，減輕腸道炎癥，增強腸道免疫功能[15]。目前，對于Res的研究主要集中在其對動物的生產(chǎn)性能、脂質(zhì)合成和緩解腸道炎癥等方面的影響，然而其對腸黏膜的保護作用以及具體機制鮮有報道。因此，本試驗擬通過建立Diquat誘導(dǎo)的斷奶仔豬氧化應(yīng)激模型，比較Res對氧化應(yīng)激仔豬腸道黏膜結(jié)構(gòu)、抗氧化能力、緊密連接蛋白及炎性因子mRNA表達的影響，明確其對腸黏膜的保護作用，以期為仔豬綠色飼料添加劑的研發(fā)提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

Res購于上海某生物科技有限公司，純度為98%；Diquat溶液購于Sigma公司；熒光定量PCR試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒與RNAiso Plus購于南京諾唯贊生物有限公司；抗氧化試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

1.2 試驗設(shè)計及飼糧

選擇健康狀況良好、胎次相近的28日齡三元雜交(杜×長×大)斷奶仔豬30頭，隨機分為5組，對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗組在基礎(chǔ)飼糧中分別添加0、10、30、90 mg/kg Res，每組6個重復(fù)，每個重復(fù)1頭仔豬。試驗期21 d。于試驗第15天清晨給試驗組(Diquat組、Diquat+10 mg/kg Res組、Diquat+30 mg/kg Res組、Diquat+90 mg/kg Res組)仔豬按照10 mg/kg BW的劑量腹腔注射Diquat建立氧化應(yīng)激模型，對照組只注射相同劑量滅菌生理鹽水為參照，誘導(dǎo)產(chǎn)生氧化應(yīng)激后再繼續(xù)飼喂7 d，屠宰采集腸道樣品?；A(chǔ)飼糧參考NRC(2012)營養(yǎng)需要配制，其組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.3 飼養(yǎng)管理

本試驗在中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所畜牧基地開展，整個動物飼養(yǎng)試驗開展期間所有仔豬自由采食和飲水。每天飼喂3次，以仔豬吃飽后料槽內(nèi)有余料為度。每天打掃保持圈舍清潔，定期消毒。

1.4 樣品采集

飼養(yǎng)試驗結(jié)束前12 h停止對仔豬喂食。試驗第22天清晨所有仔豬頸靜脈放血處死，屠宰后打開腹腔，取出回腸，立即放入盛有冰塊的冰盒中，取回腸中段5～10 cm，用冰浴的生理鹽水洗凈外壁及內(nèi)容物，濾紙吸干，剪開腸管，用載玻片輕輕刮取腸黏膜，取約0.5 g腸黏膜用錫箔紙成粒狀，每個樣品包4～5粒放入2 mL離心管中，編號，放入液氮中暫時保存，采樣結(jié)束后樣品保存于-80 ℃。另取約5 cm回腸中段，用生理鹽水洗去內(nèi)容物后放入4%多聚甲醛固定液固定腸管。

1.5 回腸黏膜形態(tài)測定

將已固定的組織樣修整、沖洗、脫水、透明、浸蠟、包埋、修塊、切片、展片[16]后進行蘇木精-伊紅(HE)染色，光鏡下測定小腸絨毛長度、寬度、隱窩深度和V/C，每張切片選取5個視野拍照，并選取3個走向完整的腸絨毛進行測量取均值。

1.6 抗氧化能力測定

腸黏膜谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和超氧化物歧化酶(SOD)活性、MDA含量采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒測定，檢測過程按照試劑盒的操作說明完成。

1.7 腸黏膜緊密連接蛋白與細胞因子mRNA相對表達量測定

采用實時熒光定量PCR檢測腸黏膜閉鎖小帶蛋白-1(ZO-1)、閉鎖蛋白(Occludin)和跨膜蛋白(Claudin)、白細胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)和白細胞介素-10(IL-10)的mRNA相對表達量。RNAiso Plus試劑盒提取回腸黏膜組織總RNA，利用超微量分光光度計測定儀檢測RNA濃度，吸光度在OD260/OD280=1.8～2.2表示RNA純度較高；采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA品質(zhì)，電泳后可見28s、18s和5s的小分子條帶則說明RNA完整性較好，之后保存于-80 ℃?zhèn)溆?。HiScript Ⅲ RT SuperMix for qPCR試劑盒說明進行cDNA的合成，得到的cDNA于-20 ℃保存?zhèn)溆?。以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板擴增基因，進行實時熒光定量PCR(Vazyme Biotech)檢測。反應(yīng)程序為：95 ℃ 30 s→95 ℃ 10 s→60 ℃ 30 s(40個循環(huán))；熔解曲線95 ℃ 15 s→60 ℃ 60 s→95 ℃ 15 s。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算各組基因的mRNA相對表達量。利用Premier 5.0軟件設(shè)計引物，引物序列見表2[16-17]。

表2 引物序列

1.8 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan氏法進行多重比較，以P<0.05作為差異顯著性判斷標準。

2 結(jié)果與分析

2.1 Res對氧化應(yīng)激仔豬回腸黏膜形態(tài)的影響

由圖1可知，對照組回腸絨毛結(jié)構(gòu)完整，排列整齊(圖1-A)，Diquat組腸絨毛結(jié)構(gòu)出現(xiàn)脫落或松散的現(xiàn)象(圖1-B)，經(jīng)過Diquat+Res(10 mg/kg)處理后絨毛結(jié)構(gòu)仍有脫落(圖1-C)，Diquat+30 mg/kg Res組和Diquat+90 mg/kg Res組腸黏膜結(jié)構(gòu)發(fā)育趨于整齊且密集，形狀規(guī)則(圖1-D、圖1-E)。

A:對照組 control group；B：Diquat組 Diquat group；C：Diquat+10 mg/kg Res組Diquat+10 mg/kg Res group；D：Diquat+30 mg/kg Res組 Diquat+30 mg/kg Res group；E:Diquat+90 mg/kg Res組 Diquat+90 mg/kg Res group。

由表3可知，與對照組相比，Diquat組絨毛高度和V/C顯著降低(P<0.05)，隱窩深度顯著升高(P<0.05)。氧化應(yīng)激狀態(tài)下，Diquat+30 mg/kg Res組和Diquat+90 mg/kg Res組絨毛高度均顯著高于Diquat組(P<0.05)，隱窩深度顯著低于Diquat組(P<0.05)。

表3 Res對氧化應(yīng)激仔豬回腸黏膜形態(tài)的影響

2.2 Res對氧化應(yīng)激仔豬回腸黏膜抗氧化能力的影響

由表4可知，與對照組相比，Diquat組腸黏膜MDA含量顯著升高(P<0.05)，GSH-Px和SOD活性顯著下降(P<0.05)。與Diqaut組相比，Diquat+30 mg/kg Res組或Diquat+90 mg/kg Res組中腸黏膜GSH-Px和SOD活性顯著提高(P<0.05)，MDA含量顯著降低(P<0.05)，且Diquat+90 mg/kg Res組中抗氧化酶活性與對照組無顯著差異(P>0.05)。

表4 Res對氧化應(yīng)激仔豬回腸黏膜抗氧化能力的影響

2.3 Res對氧化應(yīng)激仔豬回腸黏膜緊密連接蛋白mRNA相對表達量的影響

由表5可知，與對照組相比，Diquat組中腸黏膜ZO-1、Occludin和Claudin的mRNA相對表達量均顯著降低(P<0.05)。與Diquat組相比，腸黏膜ZO-1、Occludin和Claudin的mRNA相對表達量均顯著提高(P<0.05)，且Diquat+10 mg/kg Res組、Diquat+30 mg/kg Res組和Diquat+90 mg/kg Res組間無顯著差異(P>0.05)。

表5 Res對氧化應(yīng)激仔豬回腸黏膜緊密連接蛋白mRNA相對表達量的影響

2.4 Res對氧化應(yīng)激仔豬回腸黏膜細胞因子mRNA相對表達量的影響

由表6可知，與對照組相比，Diquat組腸黏膜IL-1β、TNF-α和IL-6的mRNA相對表達量顯著降低(P<0.05)，IL-10的mRNA表達量顯著升高(P<0.05)。飼糧中添加30和90 mg/kg Res能顯著降低氧化應(yīng)激仔豬腸黏膜細胞因子IL-1β、TNF-α和IL-6的mRNA相對表達量(P<0.05)，顯著提高IL-10的mRNA相對表達量(P<0.05)。

表6 Res對氧化應(yīng)激仔豬回腸黏膜細胞因子mRNA相對表達量的影響

3 討 論

3.1 Res對氧化應(yīng)激仔豬回腸黏膜形態(tài)的影響

腸道的絨毛結(jié)構(gòu)往往能反映出腸道健康情況，腸道形態(tài)損傷影響營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，增加腸道的通透性，從而降低腸道對疾病的抵抗力[18]。Wen等[19]研究表明，氧化應(yīng)激損害斷奶仔豬十二指腸、空腸和回腸的形態(tài)發(fā)育，縮短絨毛高度，降低V/C，并顯著增加十二指腸的隱窩深度。有研究發(fā)現(xiàn)，在斷奶仔豬的飼糧中補充Res增加了空腸絨毛高度，并有減少空腸凋亡細胞數(shù)量的趨勢[20]。Chen等[21]研究發(fā)現(xiàn)，在飼糧中添加300 mg/kg Res可顯著增加斷奶仔豬空腸的絨毛高度和V/C。在本試驗中，添加Res可以有效地提高氧化應(yīng)激仔豬回腸的絨毛高度和V/C，降低隱窩深度，其中以添加量30、90 mg/kg Res效果較為顯著，說明Res在一定程度上可以改善仔豬的回腸黏膜形態(tài)，緩解腸道應(yīng)激，有利于促進機體對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。

3.2 Res對氧化應(yīng)激仔豬回腸黏膜抗氧化能力的影響

細胞內(nèi)活性氧(ROS)是機體在代謝過程中產(chǎn)生的一系列活性氧簇。機體的抗氧化系統(tǒng)維持著ROS產(chǎn)生與清除的動態(tài)平衡，同時核因子E2相關(guān)因子2/Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1(Nrf2/Keap1)和核因子-κB/核因子-κB抑制蛋白(NF-κB/IκB)也廣泛參與氧化應(yīng)激反應(yīng)[22]。GSH-Px、CAT和總超氧化物歧化酶(T-SOD)等抗氧化酶都具有很強的清除自由基的能力[23]。此外，MDA含量是衡量氧化應(yīng)激水平的標志[24]。Meng等[14]研究表明，在母豬妊娠期和哺乳期補充Res降低了胎盤和乳汁中H2O2和MDA含量，增加其胎盤和乳汁的抗氧化狀態(tài)，從而增加斷奶仔豬的抗氧化能力，同時增加了胎盤中Keap1-Nrf2通路和沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1(Sirt1)抗氧化基因表達。Cao等[25]研究發(fā)現(xiàn)，在Diquat應(yīng)激仔豬飼糧中添加Res減少了空腸線粒體ROS的產(chǎn)生。本試驗研究結(jié)果表明，在氧化應(yīng)激狀態(tài)下添加不同水平Res均顯著降低了回腸黏膜MDA含量，其中以30和90 mg/kg劑量的效果最為理想。此外，隨著Res劑量的增加，腸黏膜GSH-Px和SOD的mRNA相對表達量得到顯著升高，且以Diquat+90 mg/kg Res組的效果最為顯著；這與胡瑤蓮等[26]結(jié)果相似，說明適量的Res可以增強氧化應(yīng)激仔豬的抗氧化能力。

3.3 Res對氧化應(yīng)激仔豬回腸黏膜緊密連接蛋白mRNA相對表達量的影響

黏附連接(AJ)和緊密連接(TJ)是腸道黏膜屏障的關(guān)鍵組成部分，在腸道穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵作用，ZO-1、Occludin和Claudins是TJ的重要成分，鈣黏附蛋白E(E-cadherin)是AJ的主要成分[27]。ZO-1、Occludin、Claudins和E-cadherin的表達量降低會導(dǎo)致腸道通透性增加。研究表明，當仔豬受到氧化應(yīng)激時會下調(diào)緊密連接蛋白的表達[25]。同時Liu等[28]研究發(fā)現(xiàn)，Diquat降低了ZO-1、Occludin和Claudin-1的mRNA表達以及ZO-1和Occludin的蛋白質(zhì)表達，表明腸上皮屏障的緊密連接蛋白受到了氧化應(yīng)激的破壞。多酚通過多種信號途徑調(diào)節(jié)TJ表達，比如可通過絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、Nrf2或血紅素加氧酶-1(HO-1)信號通路來改善屏障功能[29-31]。Res是多酚類化合物，Zhuang等[32]研究發(fā)現(xiàn)，Res通磷脂肌醇3-激酶/蛋白激酶(PI3K/Akt)介導(dǎo)的Nrf2信號通路上調(diào)H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激下TJ蛋白的表達來減輕腸屏障的功能障礙，提高豬小腸上皮(IPEC-J2)細胞活力，降低凋亡率。本試驗研究結(jié)果表明，Diquat組仔豬回腸黏膜ZO-1、Occludin和Claudin的mRNA相對表達量均顯著降低，但在氧化應(yīng)激狀態(tài)下補充90 mg/kg Res可以有效地增加ZO-1、Occludin和Claudin的mRNA相對表達量，其中以Claudin的mRNA相對表達量的增加最為明顯。該結(jié)果與Cao等[33]的研究結(jié)果相似，在注射Diquat的仔豬飼糧中添加100 mg/kg的Res顯著提高回腸黏膜Occludin、Claudin-1和ZO-1的蛋白表達水平，說明飼糧中添加Res可以有效促進緊密連接蛋白表達，降低腸道通透性，緩解仔豬回腸黏膜氧化應(yīng)激損傷，達到保護仔豬腸道健康的作用。

3.4 Res對氧化應(yīng)激仔豬回腸黏膜炎性因子mRNA相對表達量的影響

Res常被用于治療炎癥，如結(jié)腸炎[34]、乳腺炎[35]等。NF-κB是氧化應(yīng)激和炎癥相關(guān)組織損傷中氧化還原敏感的轉(zhuǎn)錄因子，在小鼠巨噬細胞中[36]，發(fā)現(xiàn)Res通過分別降低和增加ac-NF-κB和IκB-α水平來調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。在小鼠糖尿病模型中，Wang等[37]研究結(jié)果顯示，Res顯著增加Nrf2下游抗氧化基因NADPH醌脫氫酶-1(NQO-1)、HO-1的mRNA表達，且顯著降低了IL-1β和TNF-α的蛋白表達水平，這說明它可能通過上調(diào)Nrf2和下游抗氧化劑的表達控制炎癥發(fā)生。IL-1β、TNF-α屬于炎癥關(guān)鍵細胞因子，兩者會導(dǎo)致腸黏膜緊密連接蛋白表達和分布發(fā)生變化，引起腸道通透性增加[38]。Cheng等[39]在小鼠熱應(yīng)激模型中發(fā)現(xiàn)Res可以使TNF-α含量降低，TLR4和細胞因子mRNA表達下調(diào)，通過抑制氧化應(yīng)激和炎癥來保護腸功能。本試驗研究結(jié)果表明，當斷奶仔豬受到氧化應(yīng)激時，腸道黏膜炎癥因子IL-1β和TNF-α的mRNA相對表達量顯著增加，可能參與了Jun激酶(JNK)或NF-κB介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活；結(jié)合IL-6表達豐度的增加和IL-10的mRNA表達量的降低，推測Res可能通過IL-6刺激T細胞增殖、IL-10抑制炎癥因子進而實現(xiàn)抑制腸道炎癥的發(fā)生。此外，與Diquat組相比，Diquat+30 mg/kg Res組或Diquat+90 mg/kg Res組腸黏膜IL-1β、TNF-α和IL-6的mRNA相對表達量均顯著降低，而IL-10的mRNA相對表達量則顯著升高，且與對照組無顯著差異，與Gan等[15]在斷奶仔豬添加300 mg/kg Res能降低空腸中IL-1β和TNF-α mRNA表達水平、提高IL-10的mRNA表達水平結(jié)果一致。這說明Res對于腸道炎癥具有一定的抑制作用，但其具體的信號機制還需再進行深一步探討。

4 結(jié) 論

當斷奶仔豬遭受氧化應(yīng)激時，其回腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)遭到破壞，緊密連接蛋白表達顯著降低，抗氧化及抗炎性能均顯著降低。添加Res可以有效改善回腸黏膜形態(tài)，顯著增強仔豬抗氧化能力，并抑制腸道炎癥的發(fā)生，其中添加90 mg/kg Res效果較好。