陳飛 張昌泉 周少川 李愛宏 劉巧泉*

（1 揚州大學(xué)農(nóng)學(xué)院/江蘇省作物基因組學(xué)和分子育種重點實驗室/江蘇省糧食作物現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚州225009；2 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所，廣州510640；3 江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇 揚州225009；

*通訊作者：qqliu@yzu.edu.cn）

我國水稻單產(chǎn)已獲得了較大進步，但稻米品質(zhì)總體偏差，尤其是一些高產(chǎn)秈稻品種，稻米品質(zhì)往往較差。胚乳是稻米的主要食用部分，其干質(zhì)量的90%左右是淀粉[1-2]。一般認為，直鏈淀粉和支鏈淀粉構(gòu)成了淀粉的半晶體結(jié)構(gòu)，兩者的組成和結(jié)構(gòu)對稻米品質(zhì)特別是蒸煮食味品質(zhì)的優(yōu)劣起到?jīng)Q定性的作用[3-4]。直鏈淀粉含量是影響稻米食味品質(zhì)最重要的因素，也是最重要的評價指標。通常直鏈淀粉含量高的米飯質(zhì)地偏硬，直鏈淀粉含量低的米飯比較松軟。除直鏈淀粉含量外，直鏈淀粉的精細結(jié)構(gòu)差異也顯著影響米飯的口感[5]。此外，支鏈淀粉的鏈長分布差異是一些具有相似直鏈淀粉含量水稻品種間食味品質(zhì)差異的重要原因[3,6]。

我國水稻種植區(qū)域廣泛，亞種和品種間的品質(zhì)差異較大。從秈稻品種的稻米品質(zhì)上來看，秈稻品種的整精米率、堊白粒率、堊白度和直鏈淀粉含量的優(yōu)質(zhì)達標率往往都不是很高[7]。對長江上游的中秈稻、長江中下游和華南的晚秈稻膠稠度和直鏈淀粉含量的統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，近些年通過審定的品種膠稠度普遍有了提高，同時，稻米直鏈淀粉含量出現(xiàn)下降[7]。此外研究表明，近10 年來通過審定推廣的秈稻品種稻米品質(zhì)有了很大的提高，如黃華占、玉針香、中早35、豐華占、揚稻6 號等[8-9]。揚稻6 號是江蘇里下河地區(qū)農(nóng)科所選育的集優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)和多抗于一體的適應(yīng)性強的中秈稻新品種[10-11]。黃華占是由廣東省農(nóng)科院水稻研究所選育的抗逆性強、生育期短、耐肥抗倒、米質(zhì)特優(yōu)的常規(guī)秈稻品種[12-14]。本研究以黃華占和揚稻6 號為試驗材料，系統(tǒng)分析了這2 個品種的稻米理化品質(zhì)和淀粉精細結(jié)構(gòu)，以期探尋優(yōu)質(zhì)常規(guī)秈稻品質(zhì)形成的理化特性和淀粉結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，為優(yōu)質(zhì)秈稻品質(zhì)的進一步改良提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試品種與種植條件

黃華占（簡寫HHZ）和揚稻6 號（又名9311）于2019 年夏天正季種植于揚州大學(xué)農(nóng)學(xué)院校區(qū)試驗基地。5 月15 日播種，6 月12 日移栽，每個材料種植4行，每行10 株，株行距14 cm×18 cm。10 月5 日收割，按照常規(guī)栽培技術(shù)管理。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品前處理

將收獲的成熟稻谷在自然條件下干燥1 周，用礱谷機出糙獲得糙米，除雜后用精米機（日本Kett 公司）出精獲得精米。部分精米用于淀粉的提取，其他精米利用旋風(fēng)式磨粉機（丹麥FOSS 公司）磨成粉。米粉過100目篩后在40℃烘箱中烘2 d，隨后在室溫條件下放置2 d 用于平衡水分。最后用自封袋密封保存米粉，室溫下存放待用。

1.2.2 稻米理化品質(zhì)測定

表觀直鏈淀粉含量（Apparent amylose content,AAC）和膠稠度（Gel consistency, GC）分別按照NY147-88 和GB 17891- 1999 標準進行測定。堿消值（Alkali spreading value, ASV）的測定依照NY147-88 標準和LITTLE 等[15]方案進行。參照ZHANG 等[16]的方法利用快速黏度分析儀（Rapid visco-analyzer, RVA）測定稻米淀粉黏滯性，利用差示掃描量熱儀（Difference Scan Calculation, DSC200F3, 德國耐馳公司）測定淀粉熱力學(xué)特性。

1.2.3 淀粉的提取

參照ZHANG 等[16]的方法利用堿性蛋白酶去除米粉中的蛋白獲得淀粉。此外，利用氯仿和甲醇混合液（1∶1，v/v）在40℃條件下抽提淀粉2 次，去除淀粉中的脂類。淀粉用90%酒精洗2 次后用冷凍干燥機干燥，將干燥了的淀粉過200 目篩，從而獲得純化淀粉。

1.2.4 淀粉粒形態(tài)和粒徑分析

取2～3 粒成熟的精米，用鑷子掰斷獲得橫斷面，用刀片切割獲得平整的另一斷面并用導(dǎo)電膠固定在樣品上。樣品噴金處理后直接在掃描電子顯微鏡（S4800II，日立公司）進行斷面觀察。對于純化的淀粉，直接用鑷子挑取微量淀粉分散在導(dǎo)電膠上，噴金處理后直接進行掃描電鏡觀察。為比較淀粉粒徑分布，拍取相同放大倍數(shù)下的淀粉粒，用Nano Measurer 1.2 軟件測定淀粉粒直徑，每個品種測量300 粒，最后繪制淀粉粒徑分布圖。

1.2.5 淀粉鏈長分布分析

參照ZHANG 等[16]的方法用異淀粉酶（E-ISAMY，Megazyme，愛爾蘭）脫去淀粉分支，隨后用高溫凝膠排阻色譜儀（GPC, PL-GPC 220，美國）測定淀粉的相對分子量分布。此外，利用高效液相陰離子色譜儀（HPAEC, Thermo ICS-5000，美國）分析支鏈淀粉的鏈長分布。

1.2.6 淀粉的晶體結(jié)構(gòu)分析

參照CAI 等[17]的方法，利用多晶X-射線衍射儀（D8-ADVANCE，德國）分析淀粉的相對結(jié)晶度；利用傅里葉紅外光譜儀（Varian 7000 FTIR，美國）分析淀粉的短程有序結(jié)構(gòu)；利用小角X-射線散射儀分析淀粉的晶體片層強度和厚度。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析

本研究中各個實驗的每個樣品至少進行2 次重復(fù)，并利用統(tǒng)計分析軟件SPSS 21.0 以及Excel 進行數(shù)據(jù)處理，樣本間比較采用單因素T-測驗。試驗中的數(shù)據(jù)為“平均值±標準差”。

2 結(jié)果與分析

2.1 稻米主要理化品質(zhì)的比較

相對于揚稻6 號而言，黃華占千粒重（20.56 g）顯著低于揚稻6 號（32.59 g）。從外觀看，黃華占和揚稻6號稻米堊白粒率分別為11.2%和13.5%，差異不顯著，兩者均為低堊白粒率品種。黃華占成熟稻米的表觀直鏈淀粉含量為16.22%，顯著高于揚稻6 號（15.00%）；總淀粉含量（7.89 mmol/L）與揚稻6 號（7.83 mmol/L）無顯著差異；但是，黃華占稻米中的粗蛋白含量（8.28%）要明顯低于揚稻6 號（8.73%）。由表1 可知，2 個稻米樣品的水分、總淀粉含量和膠稠度無顯著差異。堿消值（ASV）測定結(jié)果顯示，2 個品種稻米均屬于中低糊化類型，但黃華占的堿消值要低于揚稻6 號，說明黃華占稻米糊化溫度要高于揚稻6 號。圖1A 是2 個品種米粉熱糊化特性（DSC 吸熱曲線）的比較分析，較揚稻6 號而言，黃華占的吸熱峰提前，起始、峰值和最終糊化溫度都略高（表1），完成糊化所用的溫度跨度也縮短，也就是說通過熱糊化過程所需要的時間變短；此外，黃華占米粉糊化需要較高的焓值，即需吸收更多的熱量。

評價稻米食味品質(zhì)的另一重要理化指標是由RVA 儀測定的稻米黏滯性。如圖1B 所示，2 個稻米樣品的RVA 曲線較為相近。但是從特征值來看，黃華占米粉的峰值黏度（3288.5±13.4 cP）和崩解值（1263.5±26.2 cP）顯著高于揚稻6 號（3048.0±15.6 cP 和796.0±2.8 cP）。此外，黃華占米粉的熱漿黏度（2025.0±12.7 cP）和消減值（183.0±28.3 cP） 顯著低于揚稻6 號（2253.5±14.8 cP 和415.5±6.4 cP）。兩者的冷膠黏度（CPV）和初始糊化溫度（PaT）比較接近。研究表明，RVA 譜特征值中的崩解值和消減值與稻米的食味品質(zhì)密切相關(guān)，一般崩解值大而消減值小的稻米食味品質(zhì)較好[18]。結(jié)合RVA 譜的特征值分析可知，黃華占米粉表現(xiàn)出較小的消減值和回復(fù)值、以及較高的崩解值，推測出黃華占的稻米食味品質(zhì)可能優(yōu)于揚稻6 號。

表1 黃華占和揚稻6 號稻米的主要理化和熱力學(xué)特性比較

圖1 黃華占和揚稻6 號米粉的DSC 吸熱曲線（A）和RVA 譜（B）

2.2 稻米淀粉粒結(jié)構(gòu)的比較

如圖2A 所示，2 個品種稻米外觀均為透明的長粒形，相對于揚稻6 號而言，黃華占粒長較短、粒寬較窄，但長寬比相似，兩者無顯著差異（圖2B-D）。為明確2個品種稻米內(nèi)部淀粉粒結(jié)構(gòu)是否有差異，利用掃描電鏡分析了籽粒斷面的結(jié)構(gòu)，如圖2E-F 所示，2 個品種籽粒斷面中的淀粉粒排列均較為緊湊且規(guī)則，無顯著差異。同時對從稻米中分離純化的淀粉粒做了觀察比較，2 個品種的淀粉粒均較為規(guī)則，也無顯著差異（圖2G-H）。進一步基于掃描電鏡結(jié)果計算了了2 個樣品的淀粉粒徑分布，2 個樣品淀粉粒徑分布較為相似，平均直徑均在4.5 μm 左右，其中黃華占淀粉粒徑較揚稻6 號稍大，但未達顯著水平（圖2I）。上述結(jié)果說明這2個品種在淀粉粒結(jié)構(gòu)上無顯著差異。

圖2 黃華占和揚稻6 號稻米外觀和淀粉粒掃描電鏡觀察

2.3 稻米淀粉精細結(jié)構(gòu)的比較

為明確淀粉精細結(jié)構(gòu)對稻米品質(zhì)的影響，首先利用高溫凝膠滲排阻色譜儀（GPC）分析這2 個品種稻米淀粉的相對分子量分布。如圖3A 所示，2 個樣品淀粉均被分成了3 個峰，基于已有研究，可知其中峰1 和峰2 分別為支鏈淀粉的短鏈（AP1）和長鏈（AP2）[16]，其中，揚稻6 號淀粉的AP1 組分稍有提高，但并不顯著。研究表明，AP1/AP2 反映的是支鏈淀粉的分支度，其比值越大說明淀粉的分支度越高[17]。通過計算2 個樣品的分支度，發(fā)現(xiàn)黃華占淀粉的AP1/AP2 比值（2.89±0.03）顯著小于揚稻6 號（3.09±0.02）。第3 個峰表示的是直鏈淀粉組分（AM），從中可以看出黃華占淀粉的直鏈淀粉組分顯著多于揚稻6 號，尤其是直鏈淀粉的短鏈組分更為明顯。

進一步明確支鏈淀粉鏈長分布特點，借助于高效液相陰離子色譜儀（HPAEC）獲得支鏈淀粉的鏈長分布特點的信息。通過計算黃華占與揚稻6 號支鏈淀粉鏈長的差值，發(fā)現(xiàn)黃華占淀粉的支鏈短鏈DP[（6～14）和（16～23）]部分明顯減少，而中長鏈DP（25～34）和長鏈DP（42-70）部分明顯增加。研究表明，淀粉的中長鏈是形成淀粉晶體結(jié)構(gòu)的主要組分，較長的支鏈所形成的雙螺旋結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定而使得熔解淀粉晶體所需要的溫度更高[9]。因此，該結(jié)果能夠較好的解釋黃華占稻米較高的糊化溫度。

圖3 黃華占和揚稻6 號稻米淀粉的相對分子量分布（A）和支鏈淀粉的鏈長分布（B）

圖4 黃華占和揚稻6 號稻米淀粉的X 射線衍射（A）和傅里葉紅外光譜（B）分析

2.4 稻米淀粉晶體結(jié)構(gòu)比較

稻米淀粉粒主要是由其中支鏈淀粉分子所形成的雙螺旋晶體結(jié)構(gòu)和部分支鏈淀粉及直鏈淀粉形成的無定型結(jié)構(gòu)的半晶復(fù)合體，因此淀粉的分子結(jié)構(gòu)對淀粉的晶體類型和結(jié)晶度具有重要的影響[19]。首先利用X-射線衍射（XRD）技術(shù)分析了2 個淀粉樣品的晶體衍射情況。如圖4A 所示，2 個淀粉樣品均在衍射角2θ 角為15°、17°、18°和23°時產(chǎn)生單衍射峰，其中17°和18°附近的衍射峰為相連的雙峰，屬于谷物淀粉典型的A 型衍射類型[20]。但是進一步比較分析淀粉的長程有序結(jié)構(gòu)（相對結(jié)晶度）部分，發(fā)現(xiàn)黃華占淀粉的相對結(jié)晶度（23.41%±0.21%）顯著高于揚稻6 號淀粉（21.58%±0.16%）。該結(jié)果與淀粉的精細結(jié)構(gòu)差異具有很好的一致性。因為淀粉晶體主要是由支鏈淀粉的中長鏈所形成的雙螺旋結(jié)構(gòu)組成，從而推斷出黃華占淀粉中相對較多的支鏈淀粉長鏈是其較高結(jié)晶度的主要原因。此外，這也解釋了黃華占淀粉較高的熱焓值，因為淀粉結(jié)晶度越高，其在糊化過程中所需的熱量也就越多[19]。

傅里葉紅外光譜技術(shù)可以精確的解析淀粉晶體結(jié)構(gòu)的短程有序的結(jié)構(gòu)。如圖4B 所示，黃華占和揚稻6號淀粉的紅外吸收曲線較為一致。通常紅外光譜中1045/cm 和1022/cm 的紅外吸收峰是淀粉結(jié)晶區(qū)和無定形區(qū)的結(jié)構(gòu)特征，兩者的比值（1045/1022）能夠反映淀粉分子的短程有序程度[21]。通過特征值的計算發(fā)現(xiàn)，黃華占淀粉的短程有序度（0.96±0.06）較揚稻6 號淀粉（0.92±0.04）高，但差異不顯著。

3 討論

3.1 稻米理化品質(zhì)與稻米食味品質(zhì)的關(guān)系

黃華占和揚稻6 號已經(jīng)審定并推廣多年，由于其較好的適應(yīng)性、抗逆性和優(yōu)良稻米品質(zhì)特性，目前在國內(nèi)種植面積仍然較大。稻米品質(zhì)涉及多方面，而稻米蒸煮食味品質(zhì)是消費者所重點關(guān)心的性狀，該性狀又涉及多個評價指標[22]。其中，直鏈淀粉含量是稻米重要的品質(zhì)指標，通常優(yōu)質(zhì)稻米直鏈淀粉含量處于中等偏低水平（5%～15%），近些年來選育的優(yōu)良食味軟米類品種直鏈淀粉含量普遍在10%左右[23-24]。本研究中選用了2 個中等直鏈淀粉含量類型的秈稻品種，但黃華占稻米的表觀直鏈淀粉含量和實際直鏈淀粉含量（AM）均高于揚稻6 號。研究表明，稻米直鏈淀粉含量與膠稠度、食味品質(zhì)呈現(xiàn)負相關(guān)性[3，19]，但是通過RVA 特征值的數(shù)據(jù)可以看出黃華占稻米的食味品質(zhì)可能優(yōu)于揚稻6 號。研究發(fā)現(xiàn)，稻米蛋白質(zhì)含量與米飯質(zhì)地呈現(xiàn)明顯的負相關(guān)[25]，此外，直鏈淀粉短鏈和支鏈淀粉的鏈長分布都與米飯的質(zhì)地密切相關(guān)[3]。因而這種差異可能與黃華占稻米具有相對較低的蛋白質(zhì)含量和淀粉精細結(jié)構(gòu)方面的差異有關(guān)。

3.2 淀粉精細結(jié)構(gòu)差異是稻米理化特性變異的重要原因

Wx 基因是稻米食味品質(zhì)的關(guān)鍵基因，而參試的2個品種均攜帶Wxb等位基因，因此通過對兩者稻米理化品質(zhì)和淀粉精細結(jié)構(gòu)分析可以獲得除主效基因外的一些信息。綜合分析結(jié)果表明，黃華占稻米蛋白質(zhì)含量較揚稻6 號低，但表觀直鏈淀粉含量相對較高。此外，盡管利用堿消值法測得的糊化溫度2 個品種間無顯著差異，但通過熱力學(xué)特性分析表明，黃華占稻米的糊化溫度高于揚稻6 號。淀粉結(jié)構(gòu)分析表明，2 個品種在淀粉粒結(jié)構(gòu)層面無顯著差異，但是黃華占稻米淀粉中含有相對較少的支鏈淀粉短鏈以及較多的支鏈淀粉長鏈和較多的直鏈淀粉短鏈。研究表明，較長的支鏈淀粉長鏈能夠形成更加穩(wěn)定且更長的雙螺旋結(jié)構(gòu)。因此，淀粉的長程有序結(jié)構(gòu)明顯較高，而短程有序結(jié)構(gòu)差異不顯著。此外，多數(shù)直鏈淀粉分子在淀粉粒組裝過程中存在于非結(jié)晶區(qū)內(nèi)（無定型區(qū)域），因而直鏈淀粉增加會降低淀粉的結(jié)晶度[19]。本研究表明，盡管黃華占稻米淀粉的直鏈淀粉含量較高，但其相對結(jié)晶度仍然較高，分析可能與其增加的幅度較小有關(guān)。黃華占和揚稻6 號都攜帶相同的Wxb等位基因，直鏈淀粉含量屬中等偏低。上述結(jié)果表明，除直鏈淀粉含量外，品種間也會因支鏈淀粉精細結(jié)構(gòu)方面的差異而造成稻米品質(zhì)的細微區(qū)別。

3.3 微調(diào)直鏈淀粉含量和支鏈淀粉結(jié)構(gòu)的遺傳調(diào)控位點

稻米品質(zhì)性狀的遺傳調(diào)控機制復(fù)雜，盡管Wx 基因是直鏈淀粉含量調(diào)控的主效基因，但近些年來已經(jīng)鑒定了多個直鏈淀粉含量調(diào)控的微效QTL 或基因。如ZHANG 等[26]鑒定的qsAC3 位點能夠穩(wěn)定提高約1%的直鏈淀粉含量。此外，一些直接參與淀粉合成相關(guān)的基因也能影響稻米直鏈淀粉含量，如ALK 基因。攜帶控制高糊化溫度的ALKc 等位基因其稻米直鏈淀粉含量會有一定程度的下降[27]。本實驗中，黃華占稻米的糊化溫度較高，而其直鏈淀粉含量仍然相對較高，因此推測這種差異與ALK 基因等位變異無關(guān)。進而可以推測可能存在一些其他未知位點在微調(diào)直鏈淀粉含量和支鏈淀粉結(jié)構(gòu)。本研究表明蛋白質(zhì)含量和淀粉精細結(jié)構(gòu)等差異可能是稻米食味品質(zhì)差異的主要原因。