楊 霞，湯山松，謝仲梅，張 群

（四川省資陽(yáng)市人民醫(yī)院腫瘤科，資陽(yáng) 641300）

乳腺癌是常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤，放療是其治療手段之一，癌細(xì)胞對(duì)射線的敏感性是影響放療效果的重要因素，但放療抵抗性的出現(xiàn)使得乳腺癌治療效果不佳，預(yù)后差，易復(fù)發(fā)[1-2]。miRNA 是一類(lèi)內(nèi)源性非編碼RNA，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，不僅參與細(xì)胞多數(shù)生物學(xué)過(guò)程，也參與細(xì)胞耐藥和治療抵抗[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-216a 與多種類(lèi)型的惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，HOTTIP 通過(guò)上調(diào)miR-216a-5p 抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[5]。miR-216a-5p 在膀胱癌細(xì)胞系中低表達(dá)，體外靶向抑制PAK2 基因抑制膀胱癌細(xì)胞系5637 和J82 的增殖能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[6]。miR-216a 通過(guò)抑制beclin-1 介導(dǎo)的自噬增強(qiáng)了胰腺癌細(xì)胞的放射敏感性[7]。然而，miR-216a-5p 對(duì)乳腺癌細(xì)胞放射敏感性的影響尚未可知。甲狀腺激素受體相互作用蛋白4（TRIP4）是TRIP 家族成員之一，有報(bào)道發(fā)現(xiàn)TRIP4 在人黑素瘤細(xì)胞和組織中高表達(dá)，促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，抑制細(xì)胞凋亡；下調(diào)TRIP4增加細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性[8]。但TRIP4 在乳腺癌的作用尚不清楚。本文旨在研究miR-216a-5p 對(duì)乳腺癌細(xì)胞放射敏感性的影響及其機(jī)制是否與TRIP4有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

正常乳腺上皮細(xì)胞MCF10A 和乳腺癌細(xì)胞MCF7、MDA-MB-231、SK-BR-3 購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。胎牛血清、DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)自上海博湖生物科技有限公司；RNA 提取試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）試劑盒購(gòu)自廈門(mén)慧嘉生物科技有限公司；MTT 試劑盒、Annexin V-FITC/PI 試劑盒購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)AAT Bioquest 公司；二甲基亞砜（DMSO）、BCA 試劑盒、RIPA 蛋白裂解液、SDSPAGE試劑盒購(gòu)自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 正常乳腺上皮細(xì)胞MCF10A 和乳腺癌細(xì)胞MCF7、MDA-MB-231、SKBR-3 用含10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期乳腺癌細(xì)胞MCF7，將si-con、si-TRIP4、miRcon、miR-216a-5p、anti-miR-con、anti-miR-216a-5p 質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到MCF7 細(xì)胞，作為si-con 組、si-TRIP4組、miR-con組、miR-216a-5p組、anti-miR-con組、an‐ti-miR-216a-5p組，轉(zhuǎn)染6 h后更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞備用；si-TRIP4 分別與anti-miR-con、anti-miR-216a-5p 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至MCF7 細(xì)胞中，記為si-TRIP4+anti-miR-con 組、si-TRIP4+anti-miR-216a-5p 組，轉(zhuǎn)染6 h 后更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞備用；以未經(jīng)任何處理的MCF7 細(xì)胞作為空白對(duì)照（Control）組，細(xì)胞培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞備用。

1.2.2 qPCR分析miR-216a-5p和TRIP4表達(dá)水平 提取MCF10A、MCF7、MDA-MB-231、SK-BR-3細(xì)胞以各組細(xì)胞的總RNA，合成cDNA 后進(jìn)行qP‐CR。反應(yīng)體系：2 μL cDNA、10 μL SYBR Green Mix、上、下游引物各0.5 μL，7 μL 無(wú)菌水；循環(huán)條件：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40 個(gè)循環(huán)；融解曲線：95 ℃15 s，60 ℃15 s，95 ℃15 s。miR-216a-5p 和TRIP4分別以U6 和β-actin 為內(nèi)參，相對(duì)表達(dá)量采用2-△△Ct法計(jì)算。miR-216a-5p 上游引物：5’-GGGTAATCT‐CAGCTGGCAA-3’，下游：5’-CAGTGCGTGTCGT‐GGAGT-3’；TRIP4 上游引物：5’-CTGGGCTGTGT‐GGACCTAAT-3’，下游：5’-TCTCCTGGGTCAGA‐CAGCTT-3’；U6 上游引物：5’-GCTTCGGCAGCA‐CATATACTAAAAT-3’，下游：5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’；β-actin上游引物：5’-ATCAC‐CATTGGCAATGAGCG-3’，下游：5’-TTGAAGGTAGTTTCGTGGAT-3’。

1.2.3 Western blotting 檢測(cè)蛋白表達(dá)MCF10A、MCF7、MDA-MB-231、SK-BR-3 細(xì)胞以及各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h 后，收集細(xì)胞，用RIPA 蛋白裂解液提取總蛋白，BCA 法進(jìn)行定量；然后進(jìn)行SDS-PAGE，電壓80V，時(shí)間2.5 h，然后在轉(zhuǎn)膜液中通過(guò)電泳進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)至PVDF 上后用5%脫脂奶粉將PVDF 膜封閉1 h，加入一抗TRIP4、細(xì)胞周期蛋白D1（Cyclin D1）和半胱氨酸蛋白酶3（Caspase-3），稀釋倍數(shù)為1∶1 000，置于4 ℃冰箱孵育過(guò)夜；加入二抗山羊抗兔IgG-HRP（1∶2 000），室溫孵育2 h，暗室曝光，顯影，顯影結(jié)束后，馬上把X 光片浸入定影液中，定影時(shí)間一般為5～10 min，以膠片透明為止；用自來(lái)水沖去殘留的定影液后，室溫下晾干。以β-actin 為內(nèi)參，檢測(cè)目的蛋白條帶相對(duì)灰度值，即為蛋白表達(dá)相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.4 MTT 檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h，然后按照MMT 試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，先加入MTT 溶液20 μL，孵育4 h 后棄去上清液，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩反應(yīng)10 min，最后用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm 處吸光度（OD）值。細(xì)胞增殖抑制率(%)=1?實(shí)驗(yàn)組OD值/空白對(duì)照組OD值×100%。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，PBS 漂洗，結(jié)合緩沖液重懸，加入10 μL 的Annexin V-FITC，輕輕混勻后加入5 μL 的PI，混勻，避光反應(yīng)15 min；上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.6 細(xì)胞克隆集落形成實(shí)驗(yàn) 取各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按照照射劑量大小分別接種100個(gè)、200個(gè)、500個(gè)、1 000個(gè)、2 000個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)貼壁后分別給予0 Gy、2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy 射線的照射；繼續(xù)培養(yǎng)2 周左右，用PBS 洗滌細(xì)胞2 次，然后用甲醇和吉姆薩進(jìn)行固定、染色，低倍光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)＞50個(gè)細(xì)胞的集落。

1.2.7 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 構(gòu)建TRIP4 野生型（TRIP4-WT）和突變型（TRIP4-MT）熒光素酶表達(dá)載體，分別與miR-con 和miR-216a-5p 轉(zhuǎn)染至MCF7細(xì)胞中，依據(jù)說(shuō)明書(shū)要求，檢測(cè)熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraghPad Prism5 擬合細(xì)胞存活曲線，SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-216a-5p和TRIP4在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)

與正常乳腺上皮細(xì)胞MCF10A 相比，乳腺癌細(xì)胞MCF7、MDA-MB-231、SK-BR-3 中TRIP4 mRNA及其蛋白表達(dá)水平升高，miR-216a-5p 表達(dá)水平降低（P＜0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 miR-216a-5p和TRIP4在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)情況

2.2 過(guò)表達(dá)miR-216a-5p促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的放療敏感性

與miR-con 組相比，miR-216a-5p 組MCF7 細(xì)胞中miR-216a-5p 表達(dá)水平升高，Cyclin D1 表達(dá)水平降低，Caspase-3 表達(dá)水平升高，細(xì)胞增殖抑制率顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05），見(jiàn)圖2A、圖2C～圖2F。用不同劑量射線照射后，大于4 Gy射線照射的miR-216a-5p 組細(xì)胞存活率低于miRcon 組，細(xì)胞克隆形成數(shù)顯著降低（P＜0.05），圖2B；miR-216a-5p組的放射增敏比（SER）是1.78，見(jiàn)表1。

圖2 過(guò)表達(dá)miR-216a-5p促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的放療敏感性

表1 單擊多靶模型參數(shù)值

2.3 沉默TRIP4 基因促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的放療敏感性

與si-con 組相比，si-TRIP4 組MCF7細(xì)胞中TRIP4 表達(dá)水平顯著降低，Cyclin D1 表達(dá)水平顯著降低，Caspase-3 表達(dá)水平顯著升高，增殖抑制率顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05），見(jiàn)圖3A、圖3B、圖3D～圖3G。不同劑量射線照射后，大于4 Gy 射線照射的si-TRIP4 組細(xì)胞存活率低于si-con組（P＜0.05），見(jiàn)圖3C；si-con 組、si-TRIP4 組的D0值分別是3.22、1.33，si-TRIP4組的SER是2.43，見(jiàn)表2。

圖3 沉默TRIP4基因促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的放療敏感性

表2 單擊多靶模型參數(shù)值

2.4 miR-216a-5p對(duì)TRIP4表達(dá)的調(diào)控作用

TargetScan預(yù)測(cè)顯示TRIP4 與miR-216a-5p 有互補(bǔ)的核苷酸序列（圖4A）。miR-216a-5p與TRIP4-WT 共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05）（圖4B）。與miR-con 組相比，miR-216a-5p 組TRIP4 mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)水平降低，與antimiR-con 組相比，anti-miR-216a-5p 組TRIP4mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)水平升高（P＜0.05）（圖4C、圖4D）。

2.5 沉默TRIP4 可以逆轉(zhuǎn)miR-216a-5p 對(duì)乳腺癌細(xì)胞輻射敏感性的影響

與si-TRIP4+anti-miR-con 組相比，si-TRIP4+an‐ti-miR-216a-5p 組MCF7 細(xì)胞中TRIP4 表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）（圖5A、圖5B）。單擊多靶模型擬合計(jì)算得出，si-TRIP4+anti-miR-216a-5p 組的SER分別是0.48（表3）；細(xì)胞的存活擬合曲線顯示，在同一劑量照射下，si-TRIP4+anti-miR-216a-5p 組細(xì)胞存活率高于si-TRIP4+ant-miR-con 組，存活曲線上移（圖5C）。與si-TRIP4+anti-miR-con 組相比，si-TRIP4+anti-miR-216a-5p組Cyclin D1表達(dá)水平顯著升高，Caspase-3 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）（圖5F、圖5G）；細(xì)胞增殖抑制率顯著降低（P＜0.05）（圖5D）；細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜0.05）（圖5E）。

圖4 miR-216a-5p靶向TRIP4

圖5 沉默TRIP4可以部分恢復(fù)miR-216a-5p對(duì)乳腺癌細(xì)胞輻射敏感性的影響

表3 單擊多靶模型參數(shù)值

3 討論

放射治療是多種腫瘤治療的重要手段，放療抵抗的出現(xiàn)影響了其治療效果，研究細(xì)胞的輻射敏感性機(jī)制對(duì)于深入了解腫瘤細(xì)胞的放療耐受性以及開(kāi)發(fā)腫瘤放療增敏劑具有重要意義，而miRNA與腫瘤放療敏感性密切相關(guān)[9]。研究報(bào)道，上調(diào)miR-216a-5p 可抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、克隆形成、侵襲和遷移能力[10]。miR-216a-5p 高表達(dá)可抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[11]。miR-216a通過(guò)抑制beclin-1介導(dǎo)的自噬增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞的放射敏感性[12]。為研究miR-216a-5p 在乳腺癌中作用及其對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡及放射敏感性的問(wèn)題，本實(shí)驗(yàn)首先檢測(cè)正常乳腺上皮細(xì)胞MCF10A 和乳腺癌細(xì)胞MCF7、MDA-MB-231、SK-BR-3 中miR-216a-5p 的表達(dá)，結(jié)果顯示miR-216a-5p 表達(dá)水平降低（P＜0.05），說(shuō)明miR-216a-5p 可能與乳腺癌的進(jìn)展有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步過(guò)表達(dá)miR-216a-5p 后，乳腺癌細(xì)胞MCF7 中Cyclin D1 表達(dá)水平降低，Caspase-3 表達(dá)水平升高，細(xì)胞增殖抑制率顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05），說(shuō)明過(guò)表達(dá)miR-216a-5p 可抑制乳腺癌細(xì)胞MCF7增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。過(guò)表達(dá)miR-216a-5p后用不同劑量射線照射細(xì)胞，結(jié)果顯示，克隆形成細(xì)胞數(shù)減少，存活分?jǐn)?shù)降低（P＜0.05），表明過(guò)表達(dá)miR-216a-5p 可增強(qiáng)MCF7 細(xì)胞對(duì)射線的敏感性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-216a-5p 與在其他癌癥中的作用相似，同樣起抑癌作用。

TRIP4 是一個(gè)核轉(zhuǎn)錄共活化因子，有研究顯示TRIP4 在多種腫瘤中均高表達(dá)，可能參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[13]。TRIP4 在宮頸癌細(xì)胞和腫瘤組織中均高表達(dá)，TRIP4 通過(guò)激活MAPK、PI3K/AKT 信號(hào)傳導(dǎo)促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、遷移和侵襲，通過(guò)調(diào)節(jié)hTERT 以降低宮頸癌細(xì)胞的放射敏感性[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，乳腺癌細(xì)胞MCF7、MDA-MB-231、SK-BR-3 中TRIP4 表達(dá)水平升高（P＜0.05）；沉默TRIP4 后，細(xì)胞增殖抑制率顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05），說(shuō)明沉默TRIP4 可抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；沉默TRIP4 后用不同劑量射線照射細(xì)胞，結(jié)果顯示克隆形成細(xì)胞數(shù)減少，存活分?jǐn)?shù)降低（P＜0.05），表明沉默TRIP4 可增加MCF7 細(xì)胞放射敏感性。

Cyclin D1 是細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，研究報(bào)道Cy‐clin D1 過(guò)表達(dá)參與乳腺癌細(xì)胞增殖[15]。Caspase-3是細(xì)胞凋亡關(guān)鍵因子，激活Caspase-3可促進(jìn)細(xì)胞凋亡[16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，沉默TRIP4 和過(guò)表達(dá)miR-216a-5p 可降低Cyclin D1 表達(dá)水平，提高Caspase-3表達(dá)水平（P＜0.05）；說(shuō)明沉默TRIP4 和過(guò)表達(dá)miR-216a-5p 可通過(guò)調(diào)控Cyclin D1、Caspase-3 蛋白抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)miR-216a-5p 可靶向調(diào)控TRIP4，抑制TRIP4 逆轉(zhuǎn)了抑制miR-216a-5p 表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞的放射增敏作用。

綜上所述，過(guò)表達(dá)miR-216a-5p 可能通過(guò)下調(diào)TRIP4抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、促細(xì)胞凋亡，從而增加細(xì)胞放射敏感性。