高超，劉杰，胡峰霞

（1.南方醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院藥劑科，廣東廣州 510000）

（2.深圳大學醫(yī)學部，廣東深圳 518000）（3.東營市人民醫(yī)院科教科，山東東營 257000）

哮喘是一種常見的慢性疾病，在世界范圍內，其發(fā)病率在過去幾十年中持續(xù)升高，對社會的經濟造成很大的負擔。研究顯示，環(huán)境因素對哮喘的發(fā)病率具有很大的影響，其中大氣污染是造成兒童及成人哮喘、鼻炎和支氣管炎的重要原因[1]。苯并芘（Bap）是一種常見的環(huán)境污染物，化石燃料和香煙的燃燒、燒烤食物等都會產生大量的苯并芘[2]，長期暴露于具有較高濃度的苯并芘的空氣中會引起哮喘、鼻炎和支氣管炎等呼吸道疾病，進而導致肺功能下降[3,4]。

中國傳統(tǒng)醫(yī)學在中、西方醫(yī)療保健中均發(fā)揮了重要作用，多項科學證據(jù)支持使用中藥治療哮喘的有效性。如美國食品和藥物管理局所研究的抗哮喘草藥干預包括靈芝、苦參和甘草三種中草藥的提取物，現(xiàn)已進入臨床試驗階段[5]；而食物過敏草藥配方-2（FAHF-2）已獲得FDA研究新藥（IND）批準并進入臨床試驗階段[6]。

對于天然產物的深入研究是發(fā)現(xiàn)新藥物的重要方式。陳皮（Pericarpium citri reticulatae）為蕓香科植物橘（Citrus reticulateBlanco）及其栽培變種的干燥成熟果皮。陳皮味辛、苦，性溫，入脾、肺經，具有“理氣健脾，燥濕化痰”的功效，主要用于治療消化系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)疾病，為食管、胃十二指腸等消化道病癥最常用的藥物，可治療脘腹脹滿、噯氣泛酸、惡心嘔吐、便秘或腹瀉等[7]。近年國內外研究人員在橘皮（orange peel）中發(fā)現(xiàn)了一些橘類特有的生物類黃酮成分，同時不斷改進了黃酮提取的工藝[8]，這些橘類黃酮具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等功能[9-11]。但陳皮中的酚類生物成分的抗炎的作用卻鮮有報道。因此，本文將對陳皮的酚類生物成分進行分離鑒定，并對其抗Bap誘導的肺上皮細胞炎性損傷活性進行評價。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

陳皮購于二天堂大藥房（廣州市，石牌區(qū)），由暨南大學藥學院陳教授鑒定。文中使用的檢測試劑盒、RIPA緩沖液和RNase購于上海碧云天生物科技有限公司?？贵w均購自Cell Signaling Technology（CST，USA），其它化學品均購于Sigma或Adamas。

1.2 實驗方法

1.2.1 陳皮有效成分的提取、細胞培養(yǎng)及細胞活性檢測

通過超聲提取法對陳皮（620 g）酚類活性成分進行提取，并通過旋轉蒸發(fā)儀對提取藥液進行濃縮，獲得陳皮提取物（37 g），于水/二氯甲烷體系萃取。將二氯甲烷組分（8.25 g）硅膠柱層析，用乙酸乙酯-甲醇梯度體系（100:1、10:1、1:1、0:100）洗脫，得到4個組分。將Fr.1（1.24 g）置于硅膠柱上，用二氯甲烷/甲醇梯度溶劑體系（100:5、20:1、1:1、0:100）洗脫，得到5個亞組分。組分1（0.31 g）采用半制備型高效液相色譜法（甲醇-水，40:60；流速：1 mL/min），得到化合物-1（tR 5.2 min）、化合物-2（tR 7.8 min）和化合物-3（tR 11.3 min）。組分2（0.61 g）采用半制備型高效液相色譜法（甲醇-水，30:70；流速：1 mL/min），得到化合物-4（tR 12.2 min），化合物-5（tR 15.5 min）和化合物-6（tR 19.4 min）。通過1H-NMR、13C-NMR和ESI-MS分析，鑒定其結構。

A549細胞培養(yǎng)于10% FBS、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素、2 mM L-谷氨酰胺等配置的DMEM培養(yǎng)基中（37 ℃，5% CO2）。

CCK8法測定陳皮酚類化合物對A549細胞的保護作用：將A549細胞（5×103細胞/孔）接種到含有200 μL培養(yǎng)基的96孔培養(yǎng)板中，過夜。細胞經Bap（1.0 μM）處理1.0 h，再經10 μg/mL陳皮酚類化合物孵育12 h，與對照組進行比較，用CCK8試劑盒檢測細胞活力。

1.2.2 活性氧（ROS）和促炎細胞因子檢測

根據(jù)檢測試劑盒使用要求，對ROS及相關促炎細胞因子進行檢測。將細胞5×105細胞/孔接種在6孔板中，孵育過夜后，Bap（1.0 μM）處理1.0 h，然后用aspidin BB和陳皮提取物（10 μg/mL）培養(yǎng)12 h。測量ROS和炎性細胞因子含量。

1.2.3 線粒體跨膜電位(ΔΨm)及細胞凋亡檢測

將細胞5×105細胞/孔接種在6孔板中，孵育24 h，然后Bap（1.0 μM）處理1.0 h，然后用aspidin BB、陳皮提取物（10 μg/mL）培養(yǎng)12 h，收集細胞，冷PBS洗滌，37 ℃下用1 μg/mL JC-1孵育30 min。去除上清液，使用流式細胞儀檢測。

將細胞5×105細胞/孔接種在6孔板中，孵育24 h，然后Bap（1.0 μM）處理1.0 h，然后用aspidin BB、陳皮提取物（10 μg/mL）培養(yǎng)12 h，收集細胞Annexin V-FITC/PI孵育，流式細胞儀檢測分析細胞狀態(tài)。

1.2.4 Western blotting實驗

細胞（2×106/皿）接種于10.0 cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)過夜。Bap（1.0 μM）處理1.0 h，然后用aspidin BB和陳皮提取物（10 μg/mL）培養(yǎng)12 h，收集細胞，采集總蛋白，用Bradford蛋白測定法測定蛋白質含量。參考文獻進行Western blotting蛋白分析[12]。利用Image J軟件對蛋白密度進行分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Graphpad Prism 5（San Diego，USA）進行數(shù)據(jù)分析。通過Student'st-檢驗進行對照和治療之間的統(tǒng)計學比較。所有實驗至少進行3次。數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差（ˉx±sd）。p＜0.05被認為具有統(tǒng)計學意義。

圖1 化合物-1～6結構式Fig.1 Structures of compound-1～6

表1 化合物1～6 1H、13C NMR數(shù)據(jù)[δ/(×10-6)，J/Hz]Table 1 Compound 1～6 1H, 13C NMR data [δ/(×10-6)，J/Hz]

2 結果與分析

2.1 陳皮酚類化合物的分離及鑒定

本實驗中我們共分離獲得6個陳皮酚類化合物，分別是化合物-1～aspidin BB[13]，化合物-2～aspidin PB[14]，化合物-3～aspidin AB[15]，化合物-4～aspidin AA[16]，化合物-5～phloropyron BB[17]及化合物-6～desaspidin BB，此6個酚類化合物均為首次從陳皮中分離獲得（圖1）?；衔?H、13C NMR數(shù)據(jù)總結于表1中。

2.2 陳皮酚類化合物物抗炎活性檢測

為避免陳皮酚類化合物對細胞的毒性損傷，我們用不同濃度的陳皮酚類化合物（0.005～5.0 mg/mL）處理A549細胞24 h，并通過CCK8測定細胞活力。結果表明，低于1.40 mg/mL，陳皮酚類化合物對細胞活力無影響（結果未展示）。

在本實驗中，對照組細胞存活率設為100%；與對照組相比，Bap組細胞存活率降低17.7%（p＜0.05），而陳皮酚類化合物發(fā)揮了較好的保護作用。與Bap組相比，經10 μg/mL的陳皮酚類化合物處理12 h后，A549細胞存活率分別提高了13.90%，3.90%，7.65%，8.12%，7.92%及4.31%（圖2a）。我們推測，陳皮酚類化合物可減輕Bap引起的損傷?；诨衔?1具有最佳抗Bap誘導的損傷活性，接下來我們將以化合物-1為代表，繼續(xù)進行深入的研究。

圖2 Aspidin BB減少Bap誘導的A549細胞凋亡Fig.2 Aspidin BB reduces Bap-induced apoptosis in A549 cells

細胞凋亡是一種程序性細胞死亡形式，在細胞凋亡過程中細胞形態(tài)會發(fā)生顯著的變化，如細胞收縮、核碎裂和染色質凝聚等；本實驗中，與對照組相比，Bap組細胞凋亡率為5.62%。而與Bap組相比，陳皮提取物組及化合物-1（aspidin BB）治療組細胞凋亡率分別降低1.78%和3.74%（圖2b～f）；caspase蛋白是細胞凋亡過程中重要的終末剪切酶，cleaved-caspase則為caspase蛋白的活化形式，在細胞凋亡過程中起到重要作用。因此，本實驗中檢測了陳皮酚類化合物對Bap誘導的caspase蛋白激活抑制活性。實驗結果顯示，Bap誘導的caspase-3,8蛋白激活被aspidin BB抑制（圖2g、h）?？梢?，細胞凋亡實驗為陳皮提取物及aspidin BB減弱Bap誘導的A549細胞損傷提供了直觀的證據(jù)。

2.3 aspidin BB抗Bap誘導的氧化應激活性評價

自由基產生過?；蚩寡趸芰ο陆禃е录毎鸇NA損傷及細胞凋亡[18]。在炎癥發(fā)展過程中，減少ROS的生成是減輕炎性損傷的一種潛在策略。將對照組的ROS含量設為1，結果如圖3a所示。與對照組相比，Bap組的ROS含量升高2.73倍（p＜0.05）。而Bap誘導的ROS含量升高被aspidin BB、陳皮提取物明顯抑制。aspidin BB、陳皮提取物處理后，ROS含量分別降低20.23%（p＜0.05）和45.61%（p＜0.05）。

線粒體依賴性途徑在細胞氧化應激過程中起著重要作用[18]。為了研究aspidin BB、陳皮提取物抗Bap誘導的A549細胞氧化損傷的機制，我們檢測了細胞ΔΨm的變化情況。如圖3b所示，Bap處理使ΔΨm顯著下降[3.39%（對照組）下降到15.30%（p＜0.05）]。經aspidin BB處理后，ΔΨm下降被顯著抑制。綜上所述，aspidin BB降低了細胞內ROS的積累，抑制了A549細胞的ΔΨm下降。進一步證實，aspidin BB可通過清除ROS，保護A549細胞免受氧化應激損傷。

圖3 Aspidin BB抑制Bap誘導的ROS生成及ΔΨm降低Fig.3 Aspidin BB inhibits Bap-induced ROS production and decreases ΔΨm

線粒體功能紊亂會導致細胞色素c（Cyt c）從線粒體釋放到胞質中，進而導致細胞抗氧化能力降低。本實驗結果顯示，Bap刺激導致細胞質Cyt c顯著升高，線粒體Cyt c降低（圖3）。然而，aspidin BB扭轉了Bap誘導的細胞質和線粒體Cyt c含量的變化。

2.4 aspidin BB對Bap誘導的細胞炎癥因子分泌的影響

圖4 Aspidin BB抑制Bap誘導的炎性因子分泌及iNOS表達Fig.4 Aspidin BB inhibits Bap-induced inflammatory factor secretion and iNOS expression

炎癥介質如炎性細胞因子、基質金屬蛋白酶（MMPS）、TNF-α和NO的表達可反映炎癥的變化情況。研究顯示Bap誘導的細胞損傷可能是由NO的過度產生引起的。過量的NO可以通過破壞線粒體電子傳遞鏈的功能來誘導細胞損傷[19]。為了研究aspidin BB在Bap誘導的A549細胞中是否具有抗炎能力，我們檢測了培養(yǎng)基中的NO含量。

如圖4a所示，與對照組相比，Bap刺激顯著誘導了NO釋放（1.66倍，p＜0.05）。而陳皮提取物治療組，NO含量顯著降低。陳皮提取物及aspidin BB處理后，NO含量分別下降22.91%（p＜0.05）和49.22%（p＜0.05）。一氧化氮合酶（iNOS）可催化產生一氧化氮，而細胞可通過上調iNOS表達而產生NO。為了進一步探討陳皮提取物對NO的下調機制，我們進一步研究了細胞中iNOS的表達情況。如圖4c所示，Bap刺激顯著增加了iNOS的表達。然而，陳皮提取物及及aspidin BB處理降低了iNOS的表達，這表明陳皮提取物及aspidin BB可以通過抑制iNOS的表達來降低NO的產生。

炎癥還表現(xiàn)為炎癥細胞因子的表達增加，如IL-1β和TNF-α可刺激iNOS和NO的產生。IL-1β、TNF-α和IL-6與自身免疫性疾病有廣泛的關系。此外，過量的細胞因子和iNOS介導的NO產生與炎癥的發(fā)生有著密切的關系。因此，我們進一步檢測了培養(yǎng)基中TNF-α、IL-6和IL-1β的含量。

如圖4d～f所示，與對照組相比，Bap使TNF-α、IL-6和IL-1β含量分別增加了133%、57.9%和74.2%。而與Bap組相比，陳皮提取物及aspidin BB顯著降低了TNF-α、IL-6和IL-1β含量。aspidin BB作用后使TNF-α、IL-6和IL-1β含量降低了（42.94%，p＜0.05）、（26.79%，p＜0.05）和（37.86%，p＜0.05）。以上實驗結果表明，陳皮提取物抑制了Bap誘導的NO產生，下調了iNOS的表達。因此我們推測，陳皮提取物可通過抑制iNOS介導的NO產生，以及TNF-α、IL-6和IL-1β等炎癥因子的產生來發(fā)揮抗炎作用。

2.5 aspidin BB對NF-κB信號通路的影響

NF-κB信號通路在許多慢性炎癥性疾病中被激活，也被稱為促炎介質（如TNF-α和IL-1β）的轉錄因子，控制多種參與炎癥的相關基因的表達。研究顯示巨噬細胞可通過NF-κB信號通路上調iNOS表達，從而產生NO[20]。如圖5a、b所示，與Bap組相比，陳皮提取物及aspidin BB顯著抑制了Bap誘導的p-IκBα、p-IKKα及p-p65表達。aspidin BB處理使Bap誘導的p-IκBα蛋白的表達降低了51.91%（p＜0.05）。此外，aspidin BB處理也顯著抑制Bap誘導的p-IKKα及p-p65的表達（p＜0.05）。

2.6 aspidin BB抑制Bap誘導的芳基烴受體活化

研究表明，AHR信號通路在調節(jié)過敏性哮喘和炎癥性疾病中起著重要作用[21]。為了確定aspidin BB及陳皮提取物是否抑制Bap誘導的AHR活化。我們檢測了AHR及其下游主要蛋白cyp1a1的表達。結果顯示，Bap刺激使AHR及CYP1A1的表達顯著增加。而aspidin BB及陳皮提取物顯著抑制了Bap誘發(fā)的AHR信號激活（圖5c、d）。

圖5 陳皮提取物抑制調控NF-κB、AHR信號通路相關蛋白表達Fig.5 Pericarpium citri reticulatae extract inhibits the expression of proteins associated with NF-κB and AHR signaling pathways

3 結論

本研究發(fā)現(xiàn)環(huán)境污染物Bap暴露會誘發(fā)肺上皮細胞氧化應激及炎性因子分泌，激活NF-κB和AHR信號通路，進而誘發(fā)炎癥反應。我們分離的陳皮提取物及酚類化合物具有極好的抗Bap誘導的氧化損傷及炎性損傷的活性。實驗結果顯示，aspidin BB和陳皮提取物抑制了Bap誘導的iNOS表達及炎性細胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α等的分泌。進一步研究發(fā)現(xiàn)，aspidin BB和陳皮提取物的抗炎活性可能是基于調節(jié)NF-κB和AHR途徑，進而調節(jié)炎性細胞因子的表達、增強細胞的抗炎及抗氧化能力。