王賽，孫婉婷，王猛，董雷超，陳炫宏，南希駿，嵇威，周泉城

（山東理工大學(xué)農(nóng)業(yè)工程與食品科學(xué)學(xué)院食品科學(xué)系，農(nóng)產(chǎn)品功能化技術(shù)山東省高校重點實驗室，山東淄博255049）

2型糖尿病是一種慢性代謝疾病，因胰島素分泌不足，導(dǎo)致糖代謝異常及相關(guān)代謝紊亂。近年來，糖尿病已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅人們健康的疾病之一，2017年國際糖尿病聯(lián)盟公布結(jié)果顯示，我國糖尿病人數(shù)高為1.14億，其中2型糖尿病患者約占其總?cè)藬?shù)的90%[1]。世界衛(wèi)生組織（WHO）預(yù)測，到2030年，糖尿病將成為世界第七大死亡原因。目前，多數(shù)患者靠服用磺脲類、α-糖苷酶抑制劑、雙胍類等藥物來控制血糖[2]，而膳食攝入、營養(yǎng)調(diào)理等在改善2型糖尿病指標(biāo)方面也發(fā)揮著重要的作用[3,4]，飲食干預(yù)也被視為糖尿病醫(yī)療管理的重要組成部分[5]?；?型糖尿病嚴(yán)重的并發(fā)癥及逐年上升的發(fā)病率，尋找有效的功能性食源組分用于調(diào)理2型糖尿病已成為新的熱點之一。

豌豆是世界上第四大豆類作物，富含蛋白質(zhì)、膳食纖維、維生素、礦物質(zhì)等多種物質(zhì)[6,7]，有抗菌消炎、調(diào)和脾胃、防癌治癌等功效。豌豆蛋白的生物價（BV）為47%～63%，功效比（PER）為0.7～1.3，含有人體所需的8種必需氨基酸，且大部分均達(dá)到FAO/WHO推薦值[8]，其高蛋白（233～267 g/kg）的特點也成為各行業(yè)利用發(fā)展的好的候選者[9]。豌豆肽有良好的抗氧化性[10]、乳化性[11]、泡沫穩(wěn)定性[12]、持油性[13]等特性，是食品、醫(yī)藥及新型行業(yè)的主要添加原料[14-16]。崔欣悅等[17]研究發(fā)現(xiàn)，豌豆肽可一定程度上緩解胰島素抵抗，但其具體作用機制還未有詳細(xì)報道。

目前，利用抗氧化劑阻斷氧化應(yīng)激損傷途徑，成為糖尿病的治療中關(guān)注的熱點之一[18]。以本實驗室李慧等[19]研究的抗氧化豌豆肽為原料，經(jīng)進(jìn)一步處理和純化得到豌豆低聚肽。用BALB/C小鼠構(gòu)建2型糖尿病模型，并使用豌豆低聚肽飲食干預(yù)4周，以二甲雙胍藥物為對照組，基于現(xiàn)有的理論知識[20]，選取小鼠肝細(xì)胞PI3K/AKT/FOXO1信號通路為研究機制，觀察各組小鼠肝臟細(xì)胞蛋白表達(dá)及形態(tài)變化情況，旨在為豌豆低聚肽在2型糖尿病的降血糖機制提供一定的數(shù)據(jù)，為后續(xù)降血糖藥物分子設(shè)計提供一定的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 原料

豌豆蛋白（水分4.60%±0.02%，蛋白質(zhì)73.20%±0.23%，粗脂肪0.22%±0.01%，灰分4.62%±0.03%），煙臺雙塔食品股份有限公司；中性蛋白酶（酶活力47362 U/g），濟(jì)寧元素高科生物科技有限公司；BALB/C小鼠，濟(jì)南金豐實驗動物有限公司；三諾血糖儀、三諾試紙條，長沙三諾生物傳感股份有限公司；總膽固醇（TC）試劑盒、甘油三酯（TG）試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）試劑盒，上海酶聯(lián)生物制藥有限公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

冷凍干燥機，F(xiàn)D-1A-50杭州聚同電子有限公司；精密分析天平，AL-1D4托利多儀器有限公司；離心機，TGL-16B上海安亭科學(xué)儀器廠；pH指示計，PHS-25上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；酶標(biāo)儀，1510賽默飛世爾（上海）儀器有限公司；SDS-PAGE凝膠電泳儀，BIO-RAD公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 豌豆低聚肽的制備

采用李慧等[19]的實驗方法，將豌豆蛋白中添加一定量的中性蛋白酶，在40.3 ℃水浴鍋中震蕩酶解3 h，反應(yīng)結(jié)束后，沸水浴滅酶10 min。離心后取上清酶解液于1 ku透析袋進(jìn)行分離，得到分子量為1 ku的豌豆小分子肽。由蘇州強耀生物科技有限公司對豌豆小分子肽進(jìn)一步進(jìn)行采集和冷凍干燥，主要采用固相合成和反相C18柱高效液相色譜方法，用安捷倫1100柱和C18柱進(jìn)行檢測。得到純度為98%，氨基酸序列為：Val-Glu-Pro-Gln的低聚肽，以此為原料進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.3.2 糖尿病小鼠模型的建立

100只雄性BALB/C小鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，斷食不斷水16 h，然后給予STZ（100 mg/kg，用0.1 mol/L檸檬酸緩沖液配制成1%溶液，pH 4.4）一次性腹腔注射，正常對照組腹腔注射等體積檸檬酸緩沖液。3 d后小鼠斷尾取血，測定血糖，以空腹血糖大于11.1 mmol/L判定糖尿病小鼠模型造模成功。

1.3.3 小鼠分組及飼養(yǎng)

將建模成功的糖尿病小鼠按正常組、模型組、藥物組（二甲雙胍組100 mg/(kg·d)）、豌豆低聚肽高劑量組（肽高組，500 mg/(kg·d)）、豌豆低聚肽低劑量組（肽低組，250 mg/(kg·d)）進(jìn)行分組，每籠5只，用苦味酸溶液進(jìn)行標(biāo)記。分組完成后，進(jìn)行正常喂食，并對小鼠進(jìn)行為期4周的灌胃實驗，正常組與模型組灌取同等體積的生理鹽水。

1.3.4 小鼠體重及血糖的測定

每隔7 d對小鼠進(jìn)行12 h斷食，采用小鼠尾部靜脈取血，用穩(wěn)定血糖儀測定各組小鼠的空腹血糖，同時稱量并記錄體重。

1.3.5 小鼠解剖指標(biāo)的測定

4周灌胃處理結(jié)束后，先對小鼠進(jìn)行眼框取血，放入1.5 mL離心管中靜置30 min后。用6000 r/min離心機離心15 min，取上清液于-40 ℃的冰箱中備用，用試劑盒測定血液指標(biāo)。再解剖取出小鼠的心臟、脾臟和腎臟稱取重量，計算其器官指數(shù)。

1.3.6 Western blot檢測

將小鼠肝臟組織切開，處理后的樣品加入適量濃縮SDS-PAGE蛋白緩沖液進(jìn)行蛋白分離，使用電壓為80～100 V的恒壓標(biāo)準(zhǔn)電泳設(shè)備，120 V的高電壓。然后用PVDF膜進(jìn)行膜轉(zhuǎn)化，完成后清洗1～2次，4 ℃密封過夜。在原稀釋液中孵育1 h，洗滌5 min，洗滌三次，第二次抗體孵育步驟同上，最終曝光顯影。

1.3.7 小鼠肝臟細(xì)胞HE染色

取小鼠胰腺組織用10%福爾馬林溶液浸泡，用酒精梯度脫水，并用石蠟包埋，切片成5 μm碎片備用。將處理后的碎片用蘇木精和伊紅染色，染色切片置于中性膠中，在上面覆蓋玻片，在400倍倒置顯微鏡下觀察肝臟組織細(xì)胞形態(tài)變化。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每組做3個平行。利用SPSS 19數(shù)據(jù)分析，Origin 8.5作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 豌豆低聚肽對糖尿病小鼠血糖及體重的影響

糖尿病小鼠建模成功后，其小鼠各項基本指標(biāo)發(fā)生了一定的變化。正常組小鼠毛色順滑鮮亮，眼睛有神，日便尿排出量正常。而其余組小鼠精神萎靡，排尿排便增多，體型消瘦。并在觀察的同時記錄小鼠四周的血糖及體重變化情況，以便進(jìn)一步分析。

由表1可知，正常組鼠的體重一直增加，模型組鼠體重(18.55±1.35 g)相較正常組鼠體重(23.36±1.20 g)明顯下降(p＜0.05)，符合糖尿病患者多飲多尿、多食消瘦等特征，間接客觀的證明了實驗建模成功。與模型組相比，藥物組鼠體重增長了7.87%，肽高組、肽低組小鼠體重分別增加了12.24%、9.11%，與豌豆低聚肽的劑量成正比關(guān)系，對糖尿病小鼠體重有一定的改善作用，但差異不明顯。另一方面，豌豆低聚肽對糖尿病小鼠的血糖也有一定調(diào)節(jié)作用，如圖1。正常組鼠的空腹血糖在6.0以下，而模型組鼠的空腹血糖在16.0以上，證明實驗糖尿病模型建造成功，且正常組與模型組血糖四周變化穩(wěn)定，排除了飲食、灌胃、環(huán)境等因素的影響。藥物干預(yù)后，小鼠血糖降低了46.74% (p＜0.01)，肽高組和肽低組血糖分別降低了23.97%、13.01%(p＜0.05)，且與添加劑量正相關(guān)，這與崔欣悅等[17]研究結(jié)果相符，豌豆肽能增加葡萄糖的消耗量，有效緩解胰島素抵抗的形成，對糖尿病癥狀起到一定調(diào)節(jié)作用。而本研究中的結(jié)果可能與豌豆低聚肽氨基酸組成有一定關(guān)系，豌豆低聚肽中的纈氨酸為必需氨基酸，可與體內(nèi)異亮氨酸和亮氨酸協(xié)同作用，促進(jìn)身體正常生長，修復(fù)組織，調(diào)節(jié)血糖，并提供所需能量。而谷氨酸、谷氨酰胺可為機體提供必需的氮源，促使肌細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成，為糖尿病小鼠補充了一定氨基酸成分，因此可在一定程度上調(diào)節(jié)糖尿病小鼠的消瘦、血糖等指標(biāo)。

圖1 各組小鼠4周血糖變化情況Fig.1 The changes of blood glucose in each group at 4 weeks

表1 各組小鼠4周體重變化情況Table 1 The weight change of mice in each group at 4 weeks (n=5, ˉ±s)

表1 各組小鼠4周體重變化情況Table 1 The weight change of mice in each group at 4 weeks (n=5, ˉ±s)

組別 初始體重/g 第一周/g 第二周/g 第三周/g 第四周/g正常組 20.03±1.21 20.31±1.30 20.99±1.22 22.01±1.14 23.36±1.20模型組 20.12±1.03 19.78±1.42 19.54±1.20 18.93±1.34 18.55±1.35藥物組 19.98±1.15 19.83±1.24 19.68±1.32 19.85±1.41 20.01±1.29肽低組 20.06±1.07 19.73±1.38 19.55±1.25 19.82±1.23 20.24±1.31肽高組 20.10±1.11 19.93±1.33 19.78±1.24 20.14±1.32 20.83±1.27

表2 各組小鼠血脂四項變化情況Table 2 The four changes of blood lipid in mice of each group (n=5, ˉx±s)

2.2 豌豆低聚肽對糖尿病小鼠血液生化指標(biāo)的影響

糖脂代謝紊亂是糖尿病的主要生理變化之一，能直接或間接的參與著動脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展，成為糖尿病心腦血管疾病的主要高危因素[21]。近年來，血脂檢測已成為糖尿病及其并發(fā)癥篩查、診斷的一項重要指標(biāo)，在觀測血清脂質(zhì)代謝中發(fā)揮著重要作用。

從表2中可以看出，糖尿病小鼠的血脂四項較正常組而言，均有所升高，這與之前的研究資料[22]相符，印證了糖尿病模型的建立成功。進(jìn)行藥物和豌豆低聚肽干預(yù)后，血脂四項均有不同程度的降低，與模型組相比，其中藥物組TC水平（2.61 mmol/L）、TG水平（1.60 mmol/L）及LDL-C水平（0.78 mmol/L）三項血脂指標(biāo)改善效果最為顯著（p＜0.01），且最接近正常組，此結(jié)果與參考文獻(xiàn)結(jié)果一致，也間接保證了藥物劑量干預(yù)的合理性[23]。豌豆低聚肽樣品組的血脂調(diào)節(jié)結(jié)果與干預(yù)劑量成正比關(guān)系，與模型組相比，豌豆低聚肽高劑量組降血脂效果顯著（p＜0.05），TC含量降低了20.75%，TG含量降低了24.11%，HDL-C含量降低了9.49%，LDL-C含量降低了35.44%。其中，模型組與肽低組TG水平處于中度危害水平，肽高組可調(diào)節(jié)至輕度危害水平，藥物組TG水平則與正常組無顯著性差異（p＞0.05）。劉憶梅等[24]研究發(fā)現(xiàn)，灌胃5～15 mg/(kg·d)時，大豆蛋白肽的降血脂作用顯著，這與本文中豌豆低聚肽一定濃度時可以改善糖尿病血脂相符。

2.3 豌豆低聚肽對糖尿病小鼠肝臟PI3K/AKT/FOXO1蛋白表達(dá)的影響

肝臟是主要的胰島素靶器官，在維持葡萄糖穩(wěn)態(tài)中具有重要地位，而PI3K/AKT信號通路是體內(nèi)重要的細(xì)胞信號通路。之前的研究發(fā)現(xiàn)[25,26]，肝臟中胰島素信號的傳導(dǎo)與PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)，在葡萄糖轉(zhuǎn)運、糖原合成、糖酵解和糖異生的調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮一定的作用。

圖2 各組小鼠肝臟PI3K、FOXO1、AKT的表達(dá)結(jié)果Fig.2 The expression results of PI3K, FOXO1 and AKT in liver of mice in each group (n=5,ˉx±s)

小鼠肝臟組織Western blot檢測結(jié)果如圖2所示。與正常組相比，模型組小鼠肝臟的PI3K和AKT表達(dá)顯著降低。使用藥物和樣品干預(yù)后，蛋白表達(dá)較模型組而言均有不同程度改善，藥物組改善效果最為顯著，肝臟中PI3K、AKT、FOXO1蛋白表達(dá)分別升高了259.09%、18.34%、112.92%，而肽高組的蛋白表達(dá)結(jié)果好于肽低組，肽高組中肝臟中PI3K、AKT、FOXO1蛋白表達(dá)分別升高了278.49%、21.78%、80.41%，其中，藥物組和肽高組在PI3K及FOXO1蛋白表達(dá)上升高結(jié)果都極顯著（p＜0.01）。PI3K的蛋白表達(dá)在一定程度上會影響AKT蛋白表達(dá)結(jié)果，而肽低組肝臟中AKT蛋白表達(dá)結(jié)果降低，這可能與Mora等[27]人研究發(fā)現(xiàn)的肝臟胰島素受體活性低影響AKT活性有關(guān)，此推論還需要進(jìn)一步證實。FOXO1是PI3K/AKT蛋白的下游信號因子，當(dāng)上游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子AKT的表達(dá)升高后，F(xiàn)OXO1的表達(dá)也有所改善，并參與細(xì)胞生長發(fā)育、代謝和細(xì)胞凋亡等活動。

2.4 豌豆低聚肽對糖尿病小鼠肝臟細(xì)胞形態(tài)變化的影響

肝細(xì)胞作為肝臟的主要功能細(xì)胞，能影響肝臟正常的生理功能，如調(diào)節(jié)多種營養(yǎng)物質(zhì)、分泌和儲存膽汁、解毒和排泄代謝產(chǎn)物等。取各組小鼠的肝細(xì)胞進(jìn)行HE染色，在400倍光學(xué)顯微鏡下觀察其細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞間隙等病理結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖3所示。

圖3 各組小鼠肝臟HE染色結(jié)果（×400）Fig.3 The HE staining results of mice liver in each group (×400)

正常組的肝細(xì)胞排列整齊、緊密，細(xì)胞形態(tài)飽滿，肝小葉形態(tài)完整，而模型組肝細(xì)胞的胞間隙變大，細(xì)胞核大小不均，胞質(zhì)間有少量的紫紅色糖原顆粒，形態(tài)有所改變，這與劉仕琦等[28]建立的肝臟糖尿病模型相符。干預(yù)后，藥物組肝臟細(xì)胞間隙較模型組明顯變小，細(xì)胞形態(tài)也有所改善，肽高組和肽低組細(xì)胞改善情況成劑量依賴性，肽高組肝細(xì)胞排列整齊，糖原沉積情況有所緩和，但仍有少量細(xì)胞間隙。結(jié)合肝細(xì)胞信號通路表達(dá)結(jié)果來看，上游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子PI3KAKT表達(dá)受影響后，無法正常的磷酸化下游轉(zhuǎn)錄因子FOXO1，導(dǎo)致肝糖代謝的異常，進(jìn)一步影響肝細(xì)胞的衰老、凋亡[29]。而藥物和豌豆低聚肽干預(yù)后，能改善蛋白表達(dá)結(jié)果，進(jìn)而減緩肝細(xì)胞損傷，這與肝臟細(xì)胞HE染色后形態(tài)呈現(xiàn)結(jié)果一致。

2.5 豌豆低聚肽對糖尿病小鼠重要器官的影響

各組小鼠解剖后各個重要器官指數(shù)計算結(jié)果見表3，正常組相比，模型組小鼠心臟器官指數(shù)增加了9.25%，脾臟器官指數(shù)增加了30.26%，腎臟器官指數(shù)增加了24.32%，其中脾臟、腎臟器官指數(shù)顯著增加（p＜0.05），此結(jié)果可能是糖尿病小鼠體型消瘦、部分器官受損所導(dǎo)致。與模型組相比，小鼠器官指數(shù)在飲食干預(yù)后得到了一定的調(diào)節(jié)，其中脾臟改善效果最為顯著（p＜0.05），藥物組升高了21.05%，肽高組升高了13.13%，此結(jié)果與張敏佳等[30]研究結(jié)果一致，豌豆低聚肽中的谷氨酸和谷氨酰胺都具有很好的免疫調(diào)節(jié)功能，對免疫器官起到一定的保護(hù)作用，從而調(diào)節(jié)了肽高組小鼠器官指數(shù)的變化。另一方面，各組小鼠的器官指數(shù)變化且變化均在合理范圍內(nèi)，這樣側(cè)面反映了實驗所用的劑量合理，未對各組重要器官產(chǎn)生影響，心臟、脾臟和腎臟均無異常變化，不影響其正常生活及活性。

表3 各組小鼠重要器官指數(shù)的結(jié)果Table 3 The changes of important organ index of mice in each group (n=5,ˉx±s)

3 結(jié)論

豌豆低聚肽作為飲食干預(yù)2型糖尿病的原料，可以有效的調(diào)節(jié)血糖、體重等指標(biāo)特征，改善對2型糖尿病小鼠肝臟PI3K/AKT/FOXO1蛋白表達(dá)情況。由實驗數(shù)據(jù)可知，二甲雙胍作為常規(guī)性治療2型糖尿病的藥物，其治療后各項指標(biāo)均變化顯著，其中藥物組血糖降低了46.74%，體重增長了7.87%，血脂四項也均趨于正常組，肝臟中PI3K、AKT、FOXO1蛋白表達(dá)分別升高了259.09%、18.34%、112.92%，細(xì)胞學(xué)形態(tài)排列整齊、糖原積累減少；而豌豆低聚肽干預(yù)劑量與2型糖尿病指標(biāo)的改善效果成正比關(guān)系，高劑量組的小鼠體重、血糖、血脂四項均有所改善，肝臟中PI3K/AKT/FOXO1信號通路表達(dá)升高，肝細(xì)胞狀況有所緩和。且藥物組與豌豆低聚肽高、低劑量組均未對小鼠心臟、脾臟、腎臟的器官指數(shù)產(chǎn)生異常影響。為豌豆蛋白的高值化利用提供了實踐參考，擴(kuò)寬了豌豆低聚肽在糖尿病領(lǐng)域的應(yīng)用。