何 青，張齊娟，甘學文，曹庭欣

(湖北六七二中西醫(yī)結(jié)合骨科醫(yī)院，湖北 武漢 430000)

癲癇(Epilepsy)是神經(jīng)系統(tǒng)常見疾病之一，是多種原因引起的反復發(fā)作的腦功能失調(diào)綜合征，以短暫腦神經(jīng)元異常放電引起癇樣發(fā)作為特征，臨床表現(xiàn)為突發(fā)性意識喪失及肢體抽搐。癲癇的發(fā)病率與年齡有關，兒童和青少年發(fā)病率較高，隨著我國人口老齡化，腦血管病、癡呆等神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)病率升高，癲癇在老年人群的發(fā)病率呈上升趨勢。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計，全球大約有5 000萬癲癇患者，國內(nèi)流行病學資料顯示我國目前有癲癇患者約900萬，活動性癲癇600余萬，且每年以45萬新患者數(shù)增長，患病率達5‰～7‰。癲癇屬中醫(yī)學“癇病”范疇，針刺療法是中醫(yī)學特有的治療疾病手段，數(shù)千年大量臨床實例證實針刺可抑制癲癇發(fā)作，但其作用機制至今尚未完全明了。為探究針刺治療癲癇的作用原理，本研究以戊四氮(Pentylenetetrazol,PTZ)致癇的SD大鼠為研究對象，針刺百會、大椎穴觀察對其行為學的影響，檢測癲癇大鼠腦內(nèi)細胞凋亡因子caspase-3、bax和bcl-2的表達變化，為臨床針刺治療癲癇提供科學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和試劑

健康雄性SD大鼠252只，體質(zhì)量180～220 g，由華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心提供。戊四氮(Sigma公司)；兔抗caspase-3抗體(Santa Cruz公司);RT-PCR試劑( Fermentas公司);bcl-2、bax引物(上海生工生物技術有限公司合成);兔抗bcl-2抗體、兔抗bax抗體(博士德公司)。

1.2 分組造模和行為學表現(xiàn)觀察

將實驗動物隨機分成3組:生理鹽水對照組(NS組)、戊四氮致癇組(PTZ組) 、戊四氮致癇組+針刺治療組(針刺組)。癲癇發(fā)作分級參考Racine[1]的標準, 由輕到重分為6級。0級：無行為學改變；Ⅰ級：動物出現(xiàn)須動，咀嚼；Ⅱ級：動物出現(xiàn)頭面部抽搐；Ⅲ級：動物前肢或后肢節(jié)律性抽搐或陣攣；Ⅳ級：四肢節(jié)律性抽搐；Ⅴ級：全身強直性抽搐，并伴有甩尾或翻滾。針刺組于腹腔注射PTZ前半小時予針刺預處理，將該組大鼠固定于腦立體定位儀，參考《實驗針灸學》[2]《大鼠腦立體定位圖譜》[3]選取大鼠百會穴(GV20，頂骨正中)、大椎穴(GV14，定位：第7頸椎與第1胸椎之間，背部正中)，局部碘伏擦拭消毒，持0.25 mm×40 mm針灸針斜刺入百會穴、垂直刺入大椎穴,進針約15 mm深，每隔5 min行針1次。留針30 min后，PTZ組和針刺組大鼠分別予60 mg/kg PTZ 腹腔注射誘導建立癲癇模型，NS組腹腔注射等量生理鹽水，觀察各組大鼠行為學表現(xiàn)。針刺組大鼠腹腔注射0.5 h后再次行針刺治療30 min。

1.3 免疫組化法檢測大腦皮質(zhì)、海馬Caspase-3的免疫反應性

各組大鼠分別于造模后36 h、72 h時間點予10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔麻醉后迅速開胸，經(jīng)左心室插管至升主動脈，快速灌注約37 ℃生理鹽水200 mL置換出血液，再以4%多聚甲醛(pH7.4)緩慢灌流30 min后，斷頭取腦組織塊，于4%多聚甲醛中后固定18～24 h，20%蔗糖中浸泡脫水過夜，冰凍成塊后于冰凍切片機上切片,每片厚25 μm，選取含背側(cè)海馬及大腦皮質(zhì)的切片貼于明膠載玻片上，按照常規(guī)SABC染色操作步驟，滴加一抗兔抗caspase-3(1∶100)于4 ℃冰箱中孵育48 h，滴加二抗生物素化羊抗兔IgG(1∶100)孵育1 h，滴加SABC三抗(1∶100)孵育1 h，滴加DAB顯色5～10 min。各步驟之間用PBS充分漂洗，脫水、透明和中性樹膠封片，于Olympus BX 51顯微鏡下觀察、攝片。免疫染色對照試驗用PBS代替一抗，其余步驟同前。

1.4 半定量RT-PCR檢測海馬bcl-2、bax mRNA含量

按設定時間點對各組大鼠斷頭取出海馬組織，加入Trizol提取總RNA，將其溶解在DEPC水里，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄得cDNA， bcl-2、bax引物序列根據(jù)bcl-2 cDNA序( GenBank AF218388)，利用Primer5軟件設計，Bcl-2上游引物：5′-TATGATAACCGGGAGATCGTGATC-3′，下游引物：5′-GTGCAGATGCCGGTTCAGGTACTC-3′,Bcl-2的擴增參數(shù)為：94 ℃變性45 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，33個循環(huán)，擴增產(chǎn)物的長度為525 bp；Bax上游引物：5′-GCTAATGGAGGAGAAGAAGT-3′，下游引物：5′-CTGACCTGTTGGACCTTGTG-3′，Bax的擴增參數(shù)為：94 ℃變性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個循環(huán)，擴增產(chǎn)物的長度為298 bp；內(nèi)參β-actin上游引物：5′-TGAGACCTTCAACACCCCAG-3′，下游引物：5′-GCCATCTCTTGCTCGAAGTC-3′，產(chǎn)物擴增長度為316 bp，β-actin的擴增參數(shù)為：95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環(huán),擴增產(chǎn)物的長度為316 bp，最后72 ℃延伸10 min后，再放4 ℃。將PCR產(chǎn)物置于0.2%瓊脂糖凝膠于50～60 V電泳槽里電泳2 h后于透視紫外燈下觀察、攝片，經(jīng)凝膠掃描儀處理分析條帶吸光度值(OD值)。每個樣本表達水平以其與β-actin吸光度的比值來表示。

1.5 顯微圖像分析和統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠行為學表現(xiàn)

根據(jù)Racine癲癇發(fā)作分級標準,本實驗中，PTZ組有須動、四肢節(jié)律性抽搐及全身強直陣攣發(fā)作，5 min左右達高峰，持續(xù)約10 min，以后逐漸減輕，發(fā)作為Ⅲ～Ⅴ級；針刺組抽搐發(fā)作的程度、持續(xù)時間及頻率明顯減低，I～Ⅲ級；NS組未見明顯行為異常。

2.2 各組caspase-3免疫組化結(jié)果

從神經(jīng)元的caspase-3免疫組化染色照片可見，在36 h及72 h時間點，NS組大腦皮質(zhì)及海馬均有caspase-3免疫染色陽性細胞,見圖1中A、D、G、J;36 h時間點PTZ組大鼠大腦皮質(zhì)及海馬錐體細胞層免疫染色較NS組顯著增強,見圖1中B、H;免疫染色陽性細胞數(shù)明顯增多;針刺組免疫染色及陽性細胞數(shù)較PTZ組降低,見圖1中C、I，但強于NS組(P<0.05);72 h時間點趨勢更為明顯，見圖1中E、K、F、L。各組平均吸光度(A)值的差異具有統(tǒng)計學意義，見表1。

注:A、G為36 h NS組，B、H為36 h PTZ組，C、I為36 h 針刺組，D、J為72 h NS組，E、K為72 h PTZ組，F(xiàn)、L為72 h針刺組。圖1 caspase-3免疫組化染色圖

分組n大腦皮質(zhì)(36 h)海馬(36 h)大腦皮質(zhì)(72 h)海馬(72 h)NS組420.378 8±0.019 30.196 0±0.013 60.390 1±0.025 50.175 6±0.019 3PTZ組420.620 9±0.028 1﹡0.381 0±0.091 5﹡0.841 2±0.031 7﹡0.538 5±0.024 2﹡ 針刺組420.485 0±0.037 4#0.277 1±0.019 6#0.579 0±0.031 7#0.367 4±0.021 6#

2.3 各組RT-PCR檢測bcl-2、bax表達結(jié)果

在36 h和72 h時間點，PTZ組bcl-2 mRNA的表達較NS組明顯減少(P<0.05)，針刺組bcl-2 mRNA的表達較NS組明顯減少、較PTZ組增加(P<0.05)，72 h點趨勢更為明顯。bax蛋白與bcl-2的表達水平呈負相關。RT-PCR電泳條帶掃描圖像及分析結(jié)果見表2、圖2。

圖2 各組海馬bcl-2、bax蛋白表達水平

3 討論

癲癇的發(fā)病機制十分復雜,目前尚未完全闡明，研究表明，其發(fā)生發(fā)展與炎性因子釋放、神經(jīng)細胞凋亡、突觸重構和膠質(zhì)細胞功能異常等因素密切相關[4]，幾大因素之間可能存在著相互促進、互為因果的關系，干預這些病理過程，或許能夠在一定程度阻斷癲癇的發(fā)生、發(fā)展。戊四氮(PTZ)是一種經(jīng)典的致癇劑，戊四氮致癇模型被認為是一種較理想的急性全身強直-陣攣發(fā)作模型，其作用機制為PTZ競爭性地識別抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA位點, 從而阻遏由GABA介導的興奮抑制作用，引起癲癇發(fā)作[5]。癲癇引起大腦皮質(zhì)和海馬結(jié)構神經(jīng)元凋亡，癲癇動物模型研究發(fā)現(xiàn)，癲癇所誘導的神經(jīng)元死亡在細胞化學和形態(tài)學上有細胞凋亡的特征[6]。

大量研究顯示，bcl-2家族和caspase家族在細胞凋亡轉(zhuǎn)導通路尤其是線粒體途徑中發(fā)揮了極為重要的調(diào)控作用,是近年來凋亡研究的熱點。caspase是一類存在于胞質(zhì)中的半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶,caspase-3蛋白酶位于凋亡級聯(lián)反應下游，被稱為“死亡執(zhí)行蛋白酶”，執(zhí)行剪切細胞結(jié)構蛋白的作用，直接使細胞發(fā)生凋亡[7]。bcl-2家族中bcl-2和bax基因是目前已知的在凋亡調(diào)控過程中功能相互對立的一對最重要的調(diào)控基因,通常情況下bcl-2和bax兩種蛋白的表達量相對穩(wěn)定，當bax在細胞內(nèi)超表達時，bax/bax同源二聚體的數(shù)量明顯增多，細胞對死亡信號的反應性增強，啟動凋亡；而當bcl-2高表達時，則bax/bax二聚體大量解離，生成更為穩(wěn)定的bcl-2/bax異源二聚體，對抗其誘導凋亡的作用，使細胞存活期延長[8]。研究發(fā)現(xiàn)[9]bcl-2、bax不但可作為caspase-3的上游調(diào)控機制，參與對caspase-3活性的調(diào)節(jié)，還可作為caspase-3的直接底物作用于caspase-3的下游，二者在細胞凋亡傳導過程中既相互聯(lián)系又相互制約。大量實驗證明，在caspase-3激活之前進行干預，可以有效抑制凋亡發(fā)生。

“百會”穴位于兩側(cè)三叉神經(jīng)第一支額神經(jīng)與枕大神經(jīng)的重疊支配區(qū)域，針刺“大椎”穴可刺激第8頸神經(jīng)和脊髓，有研究[10-11]表明電針刺激癲癇大鼠百會、大椎穴，腦電圖癇波出現(xiàn)明顯的潛伏期延長、波幅降低及癇波密度減小，擬認為電針刺激癲癇大鼠百會、大椎穴產(chǎn)生的神經(jīng)沖動傳入腦干三叉神經(jīng)感覺核后，經(jīng)網(wǎng)狀結(jié)構投射到腦內(nèi)多個區(qū)域，產(chǎn)生抑癇信號抑制受損神經(jīng)元的異常放電。

本研究以凋亡相關因子caspase-3、bcl-2和bax作為觀察指標，以PTZ致癇大鼠并予以針刺百會、大椎穴,觀察各組大鼠的行為學表現(xiàn)，并分別于造模后36 h和72 h時間點取材，采用免疫組織化學法檢察各組大鼠大腦皮質(zhì)及海馬神經(jīng)元caspase-3的免疫反應性，采用半定量RT-PCR法檢測大鼠海馬bcl-2、bax 蛋白的表達情況，探討針刺對癲癇發(fā)作后神經(jīng)元凋亡的影響。觀察發(fā)現(xiàn)，大鼠腹腔注射PTZ數(shù)分鐘后PTZ組大鼠即出現(xiàn)明顯抽搐，針刺組大鼠抽搐發(fā)作的程度、持續(xù)時間及頻率明顯減低；在36 h時間點，PTZ組大腦皮質(zhì)及海馬神經(jīng)元caspase-3的免疫反應明顯強于對照組，bcl-2 mRNA表達較對照組減弱而bax表達明顯增強，針刺組caspase-3的免疫反應弱于PTZ組,bcl-2表達較PTZ組增強，bax則相對減弱，72 h時間點各組更為顯著, bcl-2與bax蛋白的表達水平均呈負相關。實驗結(jié)果表明針刺PTZ致癇大鼠百會、大椎穴可減輕癲癇發(fā)作程度，抑制癲癇大鼠大腦皮質(zhì)及海馬神經(jīng)元caspase-3的免疫反應性，拮抗bcl-2、bax蛋白的表達失衡。

本研究進一步證實PTZ致癇誘導大鼠海馬神經(jīng)元凋亡，針刺可一定程度拮抗凋亡發(fā)生、減輕癲癇發(fā)作程度，其作用機制可能是通過干預凋亡相關因子的表達、調(diào)控神經(jīng)細胞凋亡途徑從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用，為臨床針刺治療癲癇提供了新的科學依據(jù)。