林俊濤，劉俊，徐紫丹，吳澤承，楊安平，陳鑫，劉靖

（佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院，廣東佛山 528000）

齲病是口腔常見病，已被世界衛(wèi)生組織列入人類三大重點(diǎn)防治疾病之一[1]。在政府“預(yù)防為主、防治結(jié)合、中西醫(yī)并重”的方針政策下，口腔疾病防治體系逐步健全。變異鏈球菌為常見的致齲菌，因其具有極強(qiáng)的產(chǎn)酸能力[2]，可以腐蝕牙釉質(zhì)，破壞牙齒結(jié)構(gòu)。因此，抑制變異鏈球菌生長繁殖對口腔齲齒的預(yù)防和治療將有重要意義。唾液鏈球菌在牙菌斑厭氧鏈球菌中占比大[3]，其菌量減少會(huì)導(dǎo)致口臭，過多也會(huì)破壞口腔內(nèi)正常的生態(tài)系統(tǒng)[4]。

降真香，又名沙柑木、山油柑、沙塘木等，為蕓香科山油柑屬植物降真香，以根、果、葉入藥，為我國廣東、云南、廣西、海南等地區(qū)的地道藥材[5]。Lesueur等[6]研究發(fā)現(xiàn)，降真香揮發(fā)油具有廣譜抗菌活性。降真香所含的山油柑等化學(xué)成分對人體多種細(xì)菌均具有抑制作用，但未見其對變異鏈球菌（Streptococcus mutans，Sm）、唾液鏈球菌（Streptococcus saliva，Ssa）生長抑制作用的研究報(bào)道。本研究探究降真香乙醇提取物的氯仿萃取物與乙酸乙酯萃取物對變異鏈球菌和唾液鏈球菌的抑菌效果，為降真香在口腔領(lǐng)域的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與儀器

氯仿、乙酸乙酯，分析純，廣州試劑廠；氨芐西林（AMP），北京唯尚立德公司；BHI培養(yǎng)基，Oxoid公司；

MK3&4MK2酶標(biāo)儀，Bio Tek公司；Thermo 3111/8038二氧化碳培養(yǎng)箱，Thermo Fisher Scientific公司。

1.2.1 試驗(yàn)材料

降真香乙醇提取物的氯仿萃取物（0.47 g/mL）、乙酸乙酯萃取物（0.40 g/mL），由佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院楊安平課題組提供，10% DMSO溶解；變異鏈球菌ATCC 25175和唾液鏈球菌ATCC 7073由佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院微生物研究室提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 藥液的制備

取20 μL氯仿萃取物加入BHI培養(yǎng)基1 260 μL配成兩管體積為1 280 μL、濃度為7.34 mg/mL的藥液；取40 μL乙酸乙酯萃取物加入BHI培養(yǎng)基1 240 μL配成兩管體積為1 280 μL、濃度為12.5 mg/mL的藥液。取氨芐西林1 μL加入BHI培養(yǎng)基999 μL配成1 000 μL濃度為1 μg/mL的藥液作陽性對照。

1.2.2 菌液制備

將復(fù)蘇48 h后的變異鏈球菌菌種和唾液鏈球菌菌種接種到含BHI培養(yǎng)基的平板中，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜（37 ℃、5% CO2）培養(yǎng)16～18 h，用移液槍刮取適量菌種，配制0.5麥?zhǔn)蠞岫龋?×108）菌液1 mL梯度稀釋至106（1.5 mL），直接打入平板（做標(biāo)記），取106管1.5 mL+BHI培養(yǎng)基13.5 mL各配置成15 mL終濃度為1×105菌液。

1.2.3 倍比稀釋法

將“1.2.1”中配備的氯仿萃取物藥液按2倍稀釋法溶于BHI液體培養(yǎng)基中，將菌懸液與含藥液的培養(yǎng)基按1∶1的體積比加入96孔板中；使各孔終質(zhì)量濃度分別為3.670 mg/mL、1.835 mg/mL、0.918 mg/mL、0.459 mg/mL、0.229 mg/mL、0.115 mg/mL、0.057 mg/mL、0.029 mg/mL；將乙酸乙酯萃取物同上方法處理，使其各孔終質(zhì)量濃度分別為6.25 mg/mL、3.125 mg/mL、1.563 mg/mL、0.781 mg/mL、0.391 mg/mL、0.195 mg/mL、0.098 mg/mL、0.049 mg/mL；另選兩孔作陽性對照與陰性對照，陽性對照藥物為1 μL/mL氨芐西林。每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h、20 h，觀察結(jié)果。

1.2.4 抑菌率的測定

將藥液與菌懸液加入96孔板十字混勻后，置于酶標(biāo)儀上測定0 h的初始OD600值，于12 h、20 h再次測定OD600值，按照公式（1）計(jì)算抑菌率。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

各實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。按照α=0.05的檢驗(yàn)水準(zhǔn)，相關(guān)數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)。P＜0.05，表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 降真香萃取物對口腔常見菌生長12 h的影響

如表1和表2所示，降真香乙醇提取物的氯仿萃取物與乙酸乙酯萃取物對變異鏈球菌生長12h的影響隨著氯仿萃取物與乙酸乙酯萃取物濃度增高，OD值逐漸減小，抑菌率上升，對變異鏈球菌的抑制作用越明顯。經(jīng)秩和檢驗(yàn)，各濃度組OD值總體均數(shù)不全相等，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。

表2 乙酸乙酯萃取物濃度對變異鏈球菌和唾液鏈球菌生長12 h的抑制作用

表1 氯仿萃取物濃度對變異鏈球菌和唾液鏈球菌生長12 h的抑制作用

2.2 降真香萃取物對口腔常見菌生長20 h的影響

隨著降真香乙醇提取物的氯仿萃取物與乙酸乙酯萃取物濃度增高，其對應(yīng)OD值逐漸減少，抑菌率上升，對變異鏈球菌的抑制效果越明顯。經(jīng)秩和檢驗(yàn)，各濃度組OD值總體均數(shù)不全相等，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），結(jié)果見表3和表4。

表4 乙酸乙酯萃取物濃度對變異鏈球菌和唾液鏈球菌生長20 h的抑制作用

表3 氯仿萃取物濃度對變異鏈球菌和唾液鏈球菌生長20 h的抑制作用

其中當(dāng)降真香乙醇提取物的氯仿萃取物的濃度為3.670 mg/mL時(shí)，其對唾液鏈球菌的生長完全抑制，12 h與20 h均無菌生長。

如表1～4所示，對于變異鏈球菌，在較低藥物濃度時(shí)，兩種萃取物OD均值相差不大；當(dāng)藥物濃度較高時(shí)，氯仿萃取物的抑菌效果明顯優(yōu)于乙酸乙酯萃取物。對于唾液鏈球菌，也可明顯看出氯仿萃取物的抑菌效果明顯優(yōu)于乙酸乙酯萃取物。

藥物治療如早期采用青霉素等是齲病防治的方法之一，雖然有防齲效果，但是長期使用廣譜抗生素可能會(huì)引起口腔和腸道正常菌群失調(diào)。氟化物是目前研究最多的防齲藥之一，但氟本身卻具有毒副作用和氟釋放不穩(wěn)定、持久性差等缺點(diǎn)。

近年來，通過對口腔致病菌耐藥性的深入研究，發(fā)現(xiàn)其耐藥性在不斷增強(qiáng)[7]。傳統(tǒng)中草藥中有不少具有清熱解毒、抑菌殺菌作用且毒副作用小的藥物[8]。使用中草藥防齲是目前的研究熱點(diǎn)，而其防齲的機(jī)制主要分為兩個(gè)方面：（1）抑制致齲菌的黏附，改變牙菌斑生物膜的結(jié)構(gòu)；（2）對牙體組織起到再礦化作用[9]。隨著中草藥在抗菌領(lǐng)域的發(fā)展，單體江等人[10]研究發(fā)現(xiàn)降真香的提取物山油柑對大腸桿菌、樹青枯病菌等6種菌均有抑制作用，但對口腔常見致病菌的作用研究尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過研究降真香乙醇提取物的氯仿萃取物與乙酸乙酯萃取物對變異鏈球菌和唾液鏈球菌的抗菌效果，發(fā)現(xiàn)這兩種不同溶劑萃取降真香乙醇提取物均對兩種菌群有一定的抑制效果。降真香的提取物為紫黑色，初始濃度狀態(tài)下酶標(biāo)儀無法準(zhǔn)確測量其OD值，故本實(shí)驗(yàn)將其進(jìn)行稀釋處理。其中，氯仿萃取物的抑菌效果整體優(yōu)于乙酸乙酯萃取物，氯仿萃取物在濃度為3.670 mg/mL時(shí)甚至有殺菌作用。

4 結(jié)論

降真香萃取物對變異鏈球菌和唾液鏈球菌的生長有很好的抑制作用，為降真香作為口腔疾病預(yù)防藥物或材料的開發(fā)提供了一定的依據(jù)，但其防齲機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。