劉龍桀 吳可心 刁云飛 李中躍 穆立薔*

（1. 東北林業(yè)大學林學院，哈爾濱 150040；2. 黑龍江牡丹江森林生態(tài)系統(tǒng)定位研究站，哈爾濱 150081）

東北紅豆杉（Taxus cuspidataSieb.et Zucc.）又名紫杉，是紅豆杉科（Taxaceae）紅豆杉屬（Taxus）植物［1］。主要分布我國黑龍江和吉林等地區(qū)，朝鮮、日本也有少量分布。東北紅豆杉是第三紀冰川時期孑遺植物［2］，是東北地區(qū)唯一的極小種群，東北紅豆杉存在生境狹?。?］、分布地不連接等問題，屬于國家Ⅰ級珍稀保護植物［4］。東北紅豆杉幼苗在第一年生長較慢，之后生長增速，每年可達20～30 cm［5］。因為野生幼苗容易遭受外界破壞導致死亡率高［6］，進而東北紅豆杉野生種群更新率低。從東北紅豆杉樹皮、枝、葉中所提取的紫杉醇［7］是目前世界上公認對治療乳腺癌、皮膚癌、卵巢癌和肺癌具有特殊的療效的藥品［8］。隨著對東北紅豆杉的進一步研究，在東北紅豆杉提取液中提取出次級代謝產(chǎn)物倍半萜類、木質(zhì)素類、黃酮類、生物堿化合物和揮發(fā)性油脂類更具有醫(yī)療前景［9］。次級代謝產(chǎn)物黃酮類化合物具有多種藥理作用，如抗氧化、抗病毒、降血壓、降血脂、抗炎、保護心臟和抗疲勞等作用［10～13］。還可以當作保健品的主要成分具備良好的保健功效［13］。近年來國家對東北紅豆杉的保護力度加大，市場對紫杉醇抗癌類藥物的需求量也在增大，在進一步的研究中發(fā)現(xiàn)東北紅豆杉的嫩枝中也存在紫杉醇、三尖杉寧堿、紫杉堿和黃酮類化合物［14］。雖然人工栽培東北紅豆杉也逐漸規(guī)?；I(yè)化［15］，但對其的研究還比較少，不具體。

代謝組學主要是將動植物體內(nèi)的代謝產(chǎn)物進行定量、定性分析，是通過高通量檢測和統(tǒng)計學數(shù)據(jù)分析的方法來進行對動植物體內(nèi)代謝規(guī)律探索的一門學科。通常的檢測手段有核磁共振、GCMS、LC-MS 和穩(wěn)定性同位素等方法。代謝組學在研究紅豆杉方向應(yīng)用也比較廣泛，像在代謝層次上來分析紅豆杉中紫杉醇的合成途徑［16］，代謝組學還可以鑒定紫杉烷類化合物［17］。陳一鳴［18］通過利用LC-MS 研究了南方紅豆杉（Taxus wallichianavar.mairei）野生種和觀賞栽培種金錫杉代謝差異，發(fā)現(xiàn)野生種和栽培種在糖類和黃酮類化合物代謝上差異顯著。李影影［19］通過測定光照對南方紅豆杉對初生代謝產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)光照對南方紅豆杉初生代謝產(chǎn)物有明顯的影響。張春椿［20］通過利用GCMS 對南方紅豆杉種皮抑制物進行鑒定分析，主要成分有十六烷酸、十八烷酸、9-十八碳烯酸、9，12-十八碳二烯酸等。初生代謝產(chǎn)物不僅對植物生理活動有重要的影響，對植物組織和細胞也有明顯的作用。東北紅豆杉作為抗癌藥物的原材料，國內(nèi)主要對次級代謝物質(zhì)研究較為深入，但通過GCMS 技術(shù)對東北紅豆杉野生種與栽培種的初級代謝產(chǎn)物進行分析的報道較少，本實驗通過非靶向代謝組學來探究東北紅豆杉野生種與栽培種的樹皮，來獲取差異代謝物和相關(guān)代謝通路的信息，來揭示野生東北紅豆杉與栽培種的代謝差異，為今后東北紅豆杉進一步開發(fā)和東北紅豆杉野生種的保護提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物樣本于2019 年9 月采自黑龍江省穆棱市東北紅豆杉國家級自然保護區(qū)和東北林業(yè)大學樹木園，選擇相同徑級生長情況相同的雌性東北紅豆杉各3 棵，每個植物分別采集3 個生物學重復(fù)，經(jīng)東北林業(yè)大學穆立薔教授鑒定均為東北紅豆杉，將其洗凈后自然晾干，備用。甲醇（色譜級，CNW Technologies），吡啶（分析純，Adamas），甲氧銨鹽（TCI），核糖醇（純度≥99%，SIGMA），BSTFA（with 1% TMCS，v/v），衍生試劑（REGIS Technologies），飽和脂肪酸甲酯（Dr.Ehrenstorfer）純水。

1.2 儀器與設(shè)備

7890A 氣相色譜（安捷倫公司，美國），PEGASUSHT 質(zhì)譜儀（LECO，美國），Heraeus Fresco17 高速離心機（賽默飛世爾科技公司，美國），F(xiàn)orma 900 series 超低溫冰箱（賽默飛世爾科技公司，美國），BSA124S-CW 分析天平（賽多利斯公司，德國），JXFSTPRP-24 研磨儀（上海凈信科技有限公司），YM-080S 超聲儀（深圳市方奧微電子有限公司），DHG-9023A 烘箱（上海一恒科學儀器有限公司），LNG-T98 真空干燥儀（太倉市華美生化儀器廠）。

1.3 樣品的制備

稱取東北紅豆杉野生種和栽培種樣本50±1 mg 于2 mL 離心管中，加入500 μL 預(yù)冷提取液（甲醇水體積比=3∶1），再加入10 μL 核糖醇，渦旋30 s；加入瓷珠，放入45 Hz 研磨儀處理4 min，取出后繼續(xù)超聲5 min（冰水?。?；將樣本4℃下12 000 r·min-1離心15 min；小心移取30 μL 上清液于1.5 mL EP 管中，每個樣本各取20 μL 混合成QC樣本；將樣本放在真空濃縮器中干燥提取物；向干燥后的代謝物加入100 μL 甲氧胺鹽試劑（甲氧胺鹽酸鹽，溶于吡啶20 mg·mL-1），輕輕混勻后，放入烘箱中80℃孵育30 min；向每個樣品中加入100 μL BSTFA（含有1% TMCS，v/v），將混合物70℃孵育1.5 h；冷卻至室溫，向混合的樣本中加入5 μL FAMEs（溶于氯仿）；進行GC-MS代謝組學分析。

1.4 GC-MS分析條件

使用安捷倫7890氣相色譜儀和飛行時間質(zhì)譜儀進行GC-MS 分析。系統(tǒng)采用DB-5MS 毛細管柱，以無分流模式注入1 μL 小份樣品。使用氦氣作為載氣，前部入口吹掃流量為3 mL·min-1，通過色譜柱的氣體流速為1 mL·min-1。初始溫度50℃保 持1 min，然 后 以10℃·min-1的 速 率 升 高 至310℃，然后在310℃保持8 min。注入、傳輸線和離子源溫度分別為280、280和250℃。在電子碰撞模式下，能量為-70 ev。在溶劑延遲6.35 min 后，以每秒12.5 個光譜的速率，在m/z 范圍為50～500 的全掃描模式下獲得質(zhì)譜數(shù)據(jù)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

將原始數(shù)據(jù)使用ChromaTOF 軟件（V4.3x，LECO）對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行了峰提取、基線矯正、解卷積、峰積分、峰對齊等分析［21］。對物質(zhì)定性工作中，使用了LECO-FiehnRtx5數(shù)據(jù)庫，包括質(zhì)譜匹配及保留時間指數(shù)匹配。最后，將QC 樣本中檢出率50%以下或RSD＞30%的峰去除［22］。導出數(shù)據(jù)至Excel 進行后續(xù)整理，使用SIMCA 軟件（V16.0.2，Sartorius Stedim Data Analytics AB，Umea，Sweden），對數(shù)據(jù)進行對數(shù)（LOG）轉(zhuǎn)換加中心化（CTR）格式化處理，然后進行自動建模分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 主成分分析

為了將東北紅豆杉野生種和栽培種在代謝物積累上的差異科學的辨別出來，首先使用統(tǒng)計學上的主成分分析法進行分析，PCA 可以揭示數(shù)據(jù)的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，從而更好的解釋數(shù)據(jù)變量［23］。使用SIMCA 軟件（V16.0.2，Sartorius Stedim Data Analytics AB，Umea，Sweden）進行分析［24］，得到了一組擬合了兩個主成分的PCA 模型，累計R2X=0.741，模型參數(shù)數(shù)值均大于0.5，且二者的數(shù)值都在置信區(qū)，在合理可以接受范圍內(nèi)，說明根據(jù)實驗建立PCA 模型穩(wěn)定，可以用于代謝組學實驗說明以及進行代謝差異分析。從圖1 中可以得到東北紅豆杉野生種都在坐標軸的負方向，而栽培種在坐標軸的正方向上，二者分別位于坐標軸的兩側(cè)被分開，說明東北紅豆杉野生種和栽培種之間的代謝物存在明顯的不同。但PCA 分析法存在缺點，首先主成分分析中的主成分是模糊的，并不能很好的解釋主成分內(nèi)容之間的關(guān)系，其次小成分也可能起到特殊作用，用于區(qū)分樣本之間的差異性，而且主成分分析法沒有監(jiān)督性。

2.2 OPLS-DA模型的分析結(jié)果

2.2.1 OPLS-DA

OPLS 又叫正交偏最小二乘法判別分析，它是多因變量對多自變量的回歸建模方法，其特點是可以除去自變量X 中與分類變量Y 無關(guān)的數(shù)據(jù)因素，并可以對正交變量和非正交變量進行分別解讀和分析，可以更加準確的分析代謝產(chǎn)物在不同樣本的差異和關(guān)聯(lián)。OPLS-DA 分析以變量的重要性為主要依據(jù)，對代謝化合物進行選擇和甄別，更能把握多位數(shù)據(jù)整體特征和變異規(guī)律［25］，使用SIMCA 軟件（V16.0.2，Sartorius Stedim Data Analytics AB，Umea，Sweden）對數(shù)據(jù)進行對數(shù)（LOG）轉(zhuǎn)換加UV 格式化處理，首先對第一主成分進行OPLS-DA 建模分析，然后用交叉驗證后得到的R2Y 和Q2對模型有效性進行評判［26］，如圖2所示東北紅豆杉野生種在置信區(qū)左側(cè)，而栽培種在置信區(qū)的右側(cè)，說明該OPLS-DA 模型能夠有效的區(qū)分兩種東北紅豆杉植物組織樣品。建立的OPLS-DA模型擁有兩個主成分，RX2=0.65，RY2=0.999，Q2=0.925，這三個模型參數(shù)指數(shù)均大于0.5，符合我們對實驗數(shù)據(jù)模型的預(yù)期，說明本研究所建立的OPLS-DA 模型可以有效的說明東北紅豆杉野生種和栽培種的代謝產(chǎn)物的差異和區(qū)別。

2.2.2 OPLS-DA置換檢驗

OPLS-DA 模型分析是有監(jiān)督分類的模型，可能會出現(xiàn)擬合現(xiàn)象。模型可以將樣本很好的進行區(qū)分，但用來預(yù)測新的樣本時，效果卻很差，無法達到我們的預(yù)期結(jié)果。可以用置換驗證這種模型評判方式來驗證模型的可靠性。通過將每個樣本的分組標記隨機打亂，多次建立與之相對應(yīng)的OPLS-DA 模型，以獲取多次建立模型的Q2，一個可靠模型的Q2應(yīng)該遠大于隨機建立模型的Q2。對OPLS-DA模型的置換驗證如圖3所示，右側(cè)原始OPLSDA模型的Q2遠遠大于左側(cè)隨機模型的Q2，說明該OPLS-DA模型不存在過擬合現(xiàn)象，可靠性良好。

2.2.3 兩種東北紅豆杉樣品差異代謝物的確定

以O(shè)PLS-DA 模型中VIP 值（VIP≥1），同時與t檢驗的結(jié)果P值（P≤0.05）綜合分析來確定兩份東北紅豆杉樣品的標志性差異代謝產(chǎn)物。由表1 可知，兩份東北紅豆杉樣品共篩選出共45 種差異代謝產(chǎn)物。這些差異代謝物主要是4 種氨基酸包括鳥氨酸，瓜氨酸，天冬氨酸和O-乙酰絲氨酸，10 種有機酸包括棕櫚酸，硬脂酸，4-羥基苯甲酸，阿魏酸，花生油酸，3-苯基乳酸等和一些多酚，糖醇等。其中有23種代謝物log2FC＞0表示為下調(diào)，包括棕櫚酸，4-羥基苯甲醛，花生油酸，二氫香豆素，瓜氨酸，鳥氨酸，2，4-二氨基丁酸，環(huán)己基甲酰胺。其他22種差異代謝物質(zhì)log2FC＜0表示為上調(diào)，包括龍膽二糖，D-阿拉伯糖醇，來蘇糖，表兒茶素，核糖等。大多數(shù)的氨基酸和有機酸表示為下調(diào)，氨基酸和有機酸均為主要抗逆調(diào)節(jié)物質(zhì)，緩解植物在逆境的影響。說明不同生長方式下的東北紅豆杉，初級代謝產(chǎn)物積累存在差異。

表1 篩選的差異代謝物Table 1 Screening of differential metabolites

2.3 差異代謝物分析

2.3.1 差異代謝物通路分析

通過查找KEGG 數(shù)據(jù)庫可以得到差異代謝化合物的ID，將獲得到的差異代謝物ID 輸入到KEGG 代謝通路數(shù)據(jù)庫，進行代謝富集分析［27］，將兩者可能存在的差異代謝途徑甄選出來，對這些代謝途徑和差異代謝物再進行相關(guān)性分析［28］，總共檢測到22 條代謝通路。將結(jié)果繪制成氣泡圖，見圖4，氣泡大小與impact 值有關(guān)，氣泡越大impact 值越大，氣泡越小，impact 值越小。紅色的顏色越深代表-ln（p）的值越大，藍色越深表示-ln（p）的值越小，最后通過impact 值和-ln（p）值綜合分析得到與代謝物差異最相關(guān)的代謝途徑。如圖4 所示，代謝物差異的代謝途徑共有7 條比較顯著，分別為硫代謝，精氨酸和脯氨酸代謝，磷酸戊糖途徑，不飽和脂肪酸的生物合成，半乳糖代謝，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝以及苯丙烷類生物合成。其中影響最明顯的是硫代謝，在該代謝通路檢測到的差異代謝物O-乙酰絲氨酸，該通路與蛋白質(zhì)的合成密切相關(guān)。其次是精氨酸和脯氨酸代謝與丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，兩條都是氨基酸代謝，參與的氨基酸與有機酸可以減輕逆境對植物的有害影響，對維護植物相對穩(wěn)定的狀態(tài)起到一定作用，說明東北紅豆杉通過氨基酸和有機酸的增加和代謝通路的調(diào)節(jié)來降低環(huán)境脅迫對植物細胞和組織的影響，提高對環(huán)境的適應(yīng)性和抵抗性。東北紅豆杉野生種除天冬氨酸表達上調(diào)外，代謝通路所涉及的其他三種氨基酸均表達下調(diào)，所以東北紅豆杉的野生種和栽培種相比，栽培種的氨基酸和有機酸呈上調(diào)，栽培種的適應(yīng)性和抵抗性更強。

2.3.2 差異化合物通路分析

7 種差異代謝途徑大體上分成三種。第一種類型氨基酸和有機酸代謝途徑，包括硫代謝，精氨酸和脯氨酸代謝，不飽和脂肪酸的生物合成，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝。這些代謝途徑都是與蛋白質(zhì)，有機酸合成有關(guān)。脯氨酸，鳥氨酸可以在干旱逆境對植物細胞起到滲透調(diào)節(jié)作用［29］，對植物抵抗外界環(huán)境變化起到一定作用。東北紅豆杉栽培種比野生種更加依賴，通過合成蛋白質(zhì)和氨基酸來緩解逆境所帶來的影響和傷害。第二種類型磷酸戊糖途徑和半乳糖代謝均是糖代謝。這兩種代謝途徑中的差異代謝物呈上調(diào)，說明在能量代謝方向，野生的東北紅豆杉是優(yōu)于栽培種的。第三種代謝途徑是苯丙烷類生物合成，苯丙烷類化合物影響植物體內(nèi)細胞的分化、著色色素的形成及木質(zhì)素的合成，與黃酮類化合物合成有關(guān)。

3 討論

本研究通過使用GC-MS技術(shù)和非靶向代謝組學的研究方法，研究了東北紅豆杉野生種和栽培種在初級代謝方面的差異。從樣品中檢測出45種差異代謝物，代謝物的種類有氨基酸類、糖類、有機酸類化合物和脂肪酸類化合物等。其中氨基酸有4 種包括鳥氨酸、天冬氨酸、瓜氨酸和O-乙酰絲氨酸，糖類有半乳糖、木糖醇等，有機酸有10 種包括棕櫚酸、硬脂酸、阿魏酸等。有23種差異代謝物表示為下調(diào)，其余22 種代謝物表示為上調(diào)。將差異代謝物通過代謝通路富集分析，得到22 條代謝通路。其中有7 條通路比較顯著，分別為硫代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、磷酸戊糖途徑、不飽和脂肪酸的生物合成、半乳糖代謝、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝以及苯丙烷類生物合成。

在精氨酸和脯氨酸代謝途徑中，有3種差異性代謝物參與其中，分別是鳥氨酸、瓜氨酸和天冬氨酸。除天冬氨酸外，其他兩種代謝物的積累，野生東北紅豆杉低于栽培種。根據(jù)劉建兵［30］研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫下馬尾松（Pinus massonianaLamb.）苗木的脯氨酸及游離氨基酸顯著增加，使得苗木能在干旱環(huán)境下生長。鳥氨酸是脯氨酸的前體物質(zhì)［31］，脯氨酸可以對植物細胞起到滲透調(diào)節(jié)作用，在一些逆境脅迫條件下如干旱脅迫，脯氨酸可以增強植物細胞的保水和吸水能力來解決因水分匱乏而引起的滲透問題，脯氨酸對植物在重金屬脅迫下起到一定的緩解作用［32］，脯氨酸還有一定的抗氧化性，可以緩解重金屬脅迫導致的氧化脅迫。鳥氨酸的顯著積累可以促進脯氨酸的合成與積累，東北紅豆杉栽培種鳥氨酸相對含量高于野生種，東北紅豆杉野生種在干旱和重金屬脅迫下比栽培種的抗逆性弱一些。糖代謝也是植物代謝的重要途徑之一，糖代謝與植物在一些環(huán)境下的抗逆性應(yīng)答以及植物體生長有關(guān)。包雨卓［33］采用GC-MS 技術(shù)分析冬小麥（Triticum aestivumL.）在低溫脅迫下的代謝物質(zhì)變化，發(fā)現(xiàn)大部分糖類、氨基酸和有機酸顯著增加，且隨著溫度降低而升高，說明冬小麥通過大部分糖類、氨基酸和有機酸的顯著增加來抵御低溫脅迫，通過富集得到的差異糖代謝途徑是半乳糖代謝和戊糖磷酸途徑，其中戊糖磷酸途徑［34］是植物體內(nèi)重要的葡萄糖代謝途徑之一。檢測到戊糖磷酸途徑中的核糖和6-磷酸葡萄糖-D-內(nèi)酯的積累，東北紅豆杉野生種高于栽培種。在半乳糖代謝的差異代謝產(chǎn)物蜜二糖積累也是東北紅豆杉野生種高于栽培種，說明野生東北紅豆杉在能量供應(yīng)上也是強于栽培種。這可能和野生東北紅豆杉所處的保護區(qū)地理環(huán)境氣溫急劇變化有關(guān)。穆棱保護區(qū)年平均氣溫-2℃極端最低氣溫-44.1℃，最高氣溫35.7℃，晝伏溫差大［35］。野生東北紅豆杉需要大量的能量來抵御低溫脅迫。檢測到的苯丙烷類代謝途徑中差異代謝化合物阿魏酸，阿魏酸是苯丙烷類代謝的中間產(chǎn)物，與多糖，木質(zhì)素構(gòu)成植物細胞壁的一部分。阿魏酸具有強抗氧化性和抗菌性，可以清除植物體內(nèi)的自由基和過氧化物［36］。根據(jù)方紫雯［37］的研究，阿魏酸對鳳丹（Paeonia ostiiT.）干旱脅迫有一定的緩解效應(yīng)，東北紅豆杉栽培種比野生種有更強的抗氧化性和抗菌能力，對干旱脅迫形成氧自由基有良好的清除效果。

4 結(jié)論

本實驗基于GC-MS的代謝組學技術(shù)對東北紅豆杉野生種和栽培種樣品進行代謝組學分析。實驗共鑒定出45 種差異代謝物，發(fā)現(xiàn)東北紅豆杉栽培種中大部分氨基酸和有機酸的積累比例高于野生種，東北紅豆杉栽培種擁有更多抗氧化性物質(zhì)和緩解逆境脅迫的調(diào)節(jié)物質(zhì)，可以更快的緩解和消除如干旱，重金屬等逆境脅迫所帶來的傷害和影響，更好地保護植物組織和細胞，東北紅豆杉栽培種對脅迫逆境下具有更強抗性和適應(yīng)性。東北紅豆杉野生種的糖類積累高于栽培種，在應(yīng)對低溫脅迫時有更好的抗性，并且能夠更及時的緩解脅迫環(huán)境帶來的有害影響，這可能和東北紅豆杉野生種所處的特殊地理環(huán)境穆棱保護區(qū)年平均氣溫較低有關(guān)。但鑒于GC-MS的代謝組學技術(shù)仍有一定的局限性，實驗對一些物質(zhì)的檢測存在不足，如萜類化合物沒有檢測到。對接下來的研究，應(yīng)該運用其他檢測方法如LC-MS，進行更全面，多角度的實驗與探究。東北紅豆杉野生種亟需更多的保護，本研究為進一步研究東北紅豆杉的抗逆性及保護野生東北紅豆杉奠定了理論基礎(chǔ)。