曹 丹 王世震 韓 梅

（南京林業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境學(xué)院，南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，南京 210037）

氮（Nitrogen，N）是植物生長和發(fā)育最重要的元素之一［1］。給楊樹施加一定濃度的氮素會促使生物量、光合速率和株高等方面的顯著提高。氮素的多少也直接影響楊樹的材積量與胸徑［2～t4］。楊樹本身對氮需求較大，往往需要施加大量氮肥［5］，氮肥雖然對包括楊樹等在內(nèi)的植物的產(chǎn)量和品質(zhì)起到了一定的促進(jìn)作用，但是氮肥的大量使用也產(chǎn)生了一系列的生態(tài)和環(huán)境問題。比如，由于植物吸收氮的能力有限，過量的氮肥得不到利用，會經(jīng)過揮發(fā)、淋洗、硝化等造成損失，產(chǎn)生富營養(yǎng)化，酸雨，溫室氣體和土壤酸化等環(huán)境污染［6］。氮肥過量使用還會造成植物機(jī)體氮飽和，而其它營養(yǎng)元素相對短缺，導(dǎo)致植物營養(yǎng)不均衡、生長緩慢和產(chǎn)量降低等負(fù)作用［7］。此外，化肥含有多種有毒重金屬，過多施用還會引起植物尤其是農(nóng)產(chǎn)品的污染，引起蔬菜葉硝酸鹽含量增加，影響人體健康［8］。因此，有必要提高植物氮利用效率（Nitrogen use efficiency，NUE），使植物在現(xiàn)有氮肥施用狀況下，生長表現(xiàn)更好；亦或使植物在降低氮肥施用情況下，生長表現(xiàn)不受影響甚至表現(xiàn)更好，從而推進(jìn)農(nóng)林業(yè)經(jīng)濟(jì)效益和環(huán)境友好雙贏的發(fā)展。

聚天冬氨酸（Polyaspartic acid，PASP）是天然存在于軟體動物和蝸牛殼內(nèi)的一種高分子有機(jī)聚合物，是一種對環(huán)境友好的、可生物降解的水溶性多肽，其相對分子量為2 000～10 000［9］。PASP 分子含有豐富的酰胺鍵和羧基等極性基團(tuán)，賦予其很好的親水性和水溶性。PASP 可作為土壤保水劑，幫助植物在干旱和半干旱條件下生長［10］。PASP 還具有吸附、螯合和分散等功能［10～12］。對土壤施加PASP 以后，土壤N、P、k、Ca、Mg 等營養(yǎng)元素及B、Mo、Mn 等微量元素的有效性明顯提高。此外，PASP 還可以抑制土壤中的銨態(tài)氮氮肥的揮發(fā)，減少磷肥在土壤中的固定與沉積［13］。PASP 本身雖然不是肥料，但它可以促進(jìn)植物對養(yǎng)分肥料的吸收，延長肥料利用率來提高植物的養(yǎng)分水平，促進(jìn)植物生長［9］。研究發(fā)現(xiàn)，添加PASP 能夠延長肥料釋放時間，抑制肥料分解和流失，提高肥料利用效率［14］，提高植物根系活力［15～16］，改善葉片生理形態(tài)［13］，增加光合速率［17］，調(diào)節(jié)氮生理代謝相關(guān)酶活［17～20］，延緩植物衰老［19］，促進(jìn)作物產(chǎn)量［13～17，21～22］。此外，PASP 還有很強(qiáng)的機(jī)械強(qiáng)度和粘性，能將沙土凝聚起來，可作為化學(xué)固沙劑，提高植物的適應(yīng)性和成活率，在生態(tài)修復(fù)中發(fā)揮重要作用［23］。然而目前這些研究多以農(nóng)作物為材料，PASP 作為增效劑對木本植物氮素生理代謝的影響以及作用機(jī)制方面的報道卻比較少見。為探究PASP 對楊樹生長和肥料利用的影響，本研究以“南林895楊”為植物材料，利用Long Ashton（LA）營養(yǎng)液進(jìn)行水培處理，設(shè)置不同濃度氮和PASP 處理，分析不同氮濃度下不同PASP 對楊樹生長及氮素利用的調(diào)控效應(yīng)，以期揭示PASP 在楊樹氮素利用過程中的作用及相關(guān)調(diào)控機(jī)制，為提高“南林895楊”氮利用效率，實現(xiàn)減氮增效提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與設(shè)計

本研究使用楊樹雜交無性系“南林895 楊”（Populus deltoides × P. euramericanacv‘Nanlin 895’）組培幼苗為植物材料，選取大小一致的組培苗（約5 cm高）進(jìn)行營養(yǎng)液水培處理。水培基礎(chǔ)營養(yǎng)液為無氮Long Ashton（LA）營養(yǎng)液（pH 為5.8），主要成分包括：0.5mmo·lL-1KCl，0.9 mmo·lL-1CaCl2，0.3 mmo·lL-1MgSO4，0.6mmo·lL-1KH2PO4，42μmo·lL-1K2HPO4，10 μmol·L-1EDTA·Fe·Na，2μmol·L-1Mn-SO4，10μmol·L-1H3BO3，7μmol·L-1Na2MoO4，0.05 μmol·L-1CoSO4，0.2μmol·L-1ZnSO4和0.2μmol·L-1CuSO4。

通過在LA營養(yǎng)液中施加不同濃度氮（硝酸鉀作為唯一氮源）和PASP共設(shè)立12個梯度，氮濃度分別為無氮（0 mmol·L-1N）、低氮（0.2 mmol·L-1N）、正常氮（2 mmol·L-1N）和高氮（10 mmol·L-1N），PASP濃度分別為0、100 和200 mg·L-1。每隔6 天換1 次營養(yǎng)液。每個處理水平5重復(fù)。每株植株供氮量如表1所示。培養(yǎng)條件為：24℃光照/22℃黑暗，光照強(qiáng)度為5 000 lx，光照時間為16 h，濕度為40%～60%。

1.2 材料采集

不同濃度氮和PASP 組合處理兩個月后，記錄每株植株的株高、根長、地上部分鮮重、根鮮重、葉片數(shù)等，根冠比=根鮮重/地上部分鮮重。選擇形態(tài)學(xué)上端完全展開的葉片（從頂端數(shù)第3～4 片葉子），記錄葉面積。隨后，將楊樹分為幼葉（YL）、成熟葉（ML）、莖（S）和根（R）4個組織分別采樣，記錄各組織鮮重，在液氮中冷凍研磨成細(xì)粉后，保存于-80℃冰箱備用。

1.3 光合作用的測定

使用Li-6400（Li-cor，USA）便攜式光合儀對“南林895楊”水培苗的凈光合速率（Pn，μmol CO2·m-2·s-1）、氣孔導(dǎo)度（Gs，mol H2O·m-2·s-1）、胞間二氧化碳濃度（Ci，μmol·mol-1）和蒸騰速率（Tr，mmol H2O·m-2·s-1）進(jìn)行測定。

1.4 氮代謝相關(guān)酶活性測定

硝酸還原酶（NR）活性采用磺胺比色法測定［24］。谷氨酰胺合成酶（GS）參照鄒琦［25］的方法測定。谷氨酸合成酶（GOGAT）和谷氨酸脫氫酶（GDH）參考Lin等［26］及Gan等［27］的方法測定。天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AspAT）參考唐會會等［28］方法測定。

1.5 硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量

硝態(tài)氮含量測定參考Patterson 等［29］的方法。銨態(tài)氮含量采用改良的茚三酮比色法［30］。

1.6 葉片氮素利用效率（NUtE）

將楊樹葉片在180℃殺青15 min 后，于65℃的烘箱中干燥至恒重，記錄干重-鮮重質(zhì)量百分比，用于計算葉片生物量干重（g）。NUtE 根據(jù)Good 等人的公式計算［31］。楊樹幼苗成熟葉的氮素利用率（NUtE）=（處理后成熟葉葉片生物量干重（g）-處理前成熟葉葉片生物量干重（g））/植株的總供氮量（g/株））。本實驗中，0 N 所有梯度供氮量為0 g，不做計算，0.2 N 為供氮量0.2 mmol·L-1，2 N 為供氮量2 mmol·L-1，10 N為供氮量10 mmol·L-1，。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

用Microsoft Excel 2016 對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行初步匯總和整理，在進(jìn)行統(tǒng)計分析之前，對數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗。使用IBM SPSS Statistics 21 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的方差分析和多重比較，采用單因素方差分析檢驗不同氮濃度和PASP 組合對楊樹幼苗生物量、株高和根長等的影響。P值小于0.05 時，認(rèn)為均值之間差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度氮和PASP 組合處理對“南林895楊”幼苗生長發(fā)育指標(biāo)的影響

在持續(xù)兩個月的處理之后，各個梯度下的楊樹水培幼苗表型發(fā)生了明顯的變化。多重分析表明，除了根鮮重和葉面積，不同濃度氮顯著（P＜0.01）影響實驗期間楊樹幼苗大部分生長發(fā)育指標(biāo)。然而，除了根冠比和葉面積，不同濃度PASP幾乎沒有顯著（P＜0.05）影響楊樹幼苗生長發(fā)育。不同的氮和PASP 組合處理對楊樹發(fā)育指標(biāo)（除根長外）均有顯著影響（P＜0.05），其中對根冠比的影響尤為顯著（P＜0.001）（見表2）。

表2 不同濃度氮和PASP組合處理下“南林895楊”幼苗生長發(fā)育指標(biāo)的多重分析Table 2 Multiple analysis of growth index of poplar hybrid‘Nanlin895’under different N and PASP concentrations

氮本身對楊樹生長有顯著影響，如表3 所示，隨著氮濃度的增加，楊樹根冠比降低，楊樹葉片數(shù)和株高等有明顯提高。以無氮為對照，低氮、正常氮和高氮處理下株高增幅分別達(dá)到38.56%、43.28%和41.04%，地上部分鮮重增幅分別達(dá)到128.67%、260.48%和434.14%，根冠比下降幅度分別達(dá)到37.21%、64.51%和56.86%。添加PASP 在無氮和低氮條件下促進(jìn)了株高和葉片數(shù)增加，以及地上部分鮮重積累，但卻顯著降低了根冠比，以0 N 為對照，0 N+100 mg·L-1PASP、0 N+200 mg·L-1PASP、0.2 N+100 mg·L-1PASP 和0.2 N+200 mg·L-1PASP 植株的根冠比下降幅度分別達(dá)到了43.21%、65.25%、55.25%和61.16%。在正常氮供應(yīng)條件下添加100 mg·L-1PASP增加了植物株高、葉片數(shù)、根鮮重和地上鮮重，而在高氮條件下，無論是添加100還是200 mg·L-1PASP均降低。

表3 不同濃度氮和PASP組合處理下“南林895楊”的生長發(fā)育指標(biāo)Table 3 Growth index of poplar hybrid‘Nanlin895’under different N and PASP concentrations

2.2 不同濃度氮和PASP 組合處理對“南林895楊”幼苗光合特性的影響

由圖1 可以看出，在一定氮濃度下施加PASP明顯提高了凈光合速率，其中以2 N+100 mg·L-1PASP的凈光合速率最高，10 N+100 mg·L-1PASP的凈光合速率最低。在無氮條件下施加100 mg·L-1PASP使凈光合速率增加了62.27%，施加200 mg·L-1PASP 使凈光合速率增加了82.20%；在低氮條件下施加100 和200 mg·L-1PASP 分別使凈光合速率增加了27.04%和39.09%；在正常氮條件下施加100 mg·L-1PASP 使凈光合速率上升4.64%，施加200 mg·L-1PASP 則使凈光合速率降低7.04%；然而高氮的各個處理組凈光合速率均較低，施加PASP 加重了對凈光合速率的抑制，施加100 和200 mg·L-1PASP 分別使凈光合速率下降了37.03% 和35.43%。在無氮條件下施加PASP 使氣孔導(dǎo)度增加，添加100 和200 mg·L-1PASP 分別使氣孔導(dǎo)度增加144.19%和162.79%；在低氮和正常氮條件下，隨著PASP 濃度升高氣孔導(dǎo)度先增加后下降，在高氮條件下施加不同濃度PASP 使氣孔導(dǎo)度下降，降幅達(dá)到25%～31.67%?？傮w上，胞間二氧化碳濃度在低氮和正常氮處理下保持較低的濃度水平，而在高氮處理下濃度較高，與凈光合速率無明顯相關(guān)性。蒸騰速率的變化與氣孔導(dǎo)度正相關(guān)。

2.3 不同濃度氮和PASP 組合處理對“南林895楊”幼苗氮代謝相關(guān)酶活性的影響

為了進(jìn)一步研究PASP 影響氮同化作用的生理機(jī)制，對氮代謝相關(guān)的酶，包括硝酸還原酶（NR）、谷氨酰胺合成酶（GS）、谷氨酸合成酶（GOGAT）、谷氨酸脫氫酶（GDH）和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AspAT）等的活性進(jìn)行了測定。多重分析表明，氮濃度極顯著（P＜0.001）的影響實驗中五種酶的活性，NR、GS、GDH 和AspAT 受PASP 影響顯著（P＜0.05），不同濃度氮和PASP 組合處理顯著（P＜0.01）影響了NR、GS、GOGAT 和AspAT，而GDH活性沒有顯著差異（見表4）。

表4 不同濃度氮和PASP 組合處理下“南林895 楊”幼苗氮代謝相關(guān)酶活性多重分析Table 4 Multiple analysis of nitrogen metabolism-related enzyme activities of poplar hybrid‘Nanlin 895’under different N and PASP concentrations

由圖2 可見，不同濃度氮和PASP 處理對NR酶活性的影響較大。首先，氮濃度對NR 有較大影響，與無氮相比，低氮、正常氮和高氮處理的NR 活性分別上升108.25%，376.52%和55.28%。在無氮和低氮條件下，施加100 mg·L-1PASP使NR活性上升，施加200 mg·L-1PASP 使NR 活性下降；在正常氮和高氮條件下，施加PASP 使NR 活性均降低。GS 活性變化趨勢和NR 相反，在無氮和低氮條件下，施加100 mg·L-1PASP 使GS 活性下降，施加200 mg·L-1PASP 使GS 活性上升，在正常氮和高氮條件下，GS 活性隨著PASP 濃度升高而上升。GOGAT 活 性 在0.2 N+100 mg·L-1PASP 處 達(dá) 到 最 大值，在無氮和高氮條件下隨著PASP 濃度升高而上升；在低氮條件下，施加100 mg·L-1PASP 時GOGAT 活性上升，而施加200 mg·L-1PASP 時GOGAT活性下降；正常氮條件下，GOGAT 活性變化正好與低氮的相反。AspAT 活性在無氮和低氮條件下，隨著PASP 濃度升高而上升，尤其在無氮條件下增幅明顯，添加100 和200 mg·L-1PASP 時AspAT 活性增幅分別達(dá)到855.15%和2055.30%；除10 N+200 mg·L-1PASP 相 比10 N 活 性 上 升 了39.44%以外，AspAT 活性在正常氮和高氮條件下隨著PASP 濃度升高而下降。GDH 活性在無氮和正常氮條件下，隨著PASP 濃度升高而上升，在低氮和高氮條件下，施加100 mg·L-1PASP 使GDH 活性下降，施加200 mg·L-1PASP 使GDH 活性上升。總體上，酶活性大多在無氮和低氮條件下變化較明顯。

2.4 不同濃度氮和PASP 組合處理對“南林895楊”幼苗硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量的影響

在本實驗所有處理條件下，施加PASP 幾乎使硝態(tài)氮含量都降低，特別是在無氮和低氮條件下降低幅度更明顯（見圖3）。以不添加PASP相應(yīng)氮濃度作對照，在無氮條件下施加100 和200 mg·L-1PASP 使硝態(tài)氮含量分別降低49.19%和56.56%；在低氮條件下分別降低40.19%和30.44%。而銨態(tài)氮的變化則不同，銨態(tài)氮的含量與供氮量正相關(guān)（見圖3），以無氮處理組為對照，低氮、正常氮和高氮處理組銨態(tài)氮含量增幅分別為60.93%、176.46%和262.17%。施加PASP 在無氮和低氮條件下，對銨態(tài)氮含量有一定影響，100 mg·L-1PASP使銨態(tài)氮含量升高，而其他條件下PASP 對銨態(tài)氮含量影響不顯著。

2.5 不同濃度氮和PASP 組合處理對“南林895楊”幼苗成熟葉NUtE的影響

氮素利用效率（NUtE）表示了在不同處理下，植物利用氮素合成生物量的能力。由表5可知，在低氮處理下，施加PASP 明顯比未施加PASP 提高了楊樹成熟葉NUtE，施加100 和200 mg·L-1PASP使NUtE 分別提高53.7%和43.7%。在正常氮處理下，也有類似效果，施加100 mg·L-1PASP尤為顯著（41.64%）。然而在高氮處理下，施加PASP 抑制了楊樹利用氮素的能力，使NUtE均下降，施加100和200 mg·L-1PASP 時NUtE 下降幅度分別為60.99%和53.11%。

表5 不同濃度氮和PASP 組合處理下“南林895 楊”成熟葉NUtE的變化Table 5 NUtE of mature leaves in poplar hybrid‘Nanlin 895’under different N and PASP concentrations

3 討論

氮的可利用性對楊樹生長起著決定性的作用［32］。在有限的氮條件下，使楊樹能充分利用氮，促進(jìn)其生長發(fā)育，提高楊樹胸徑和品質(zhì)，對提高楊樹的經(jīng)濟(jì)價值和生態(tài)效益有重大意義。前人研究認(rèn)為，PASP 作為肥料增效劑，能夠顯著促進(jìn)農(nóng)作物對氮的吸收和利用［9，14，16～17，33］。本研究也發(fā)現(xiàn)，施加PASP 可以有效緩解無氮和低氮對楊樹幼苗生長的抑制作用，添加PASP 能明顯提高楊樹幼苗株高、葉片數(shù)、地上部分鮮重和NUtE，降低楊樹幼苗根冠比和硝態(tài)氮含量。氮供應(yīng)不足時，楊樹地上生物量積累的增加可能與添加PASP 后植物凈光合速率增加有關(guān)。PASP 在氮供應(yīng)不足的情況下促進(jìn)植物生物量積累更明顯，這一點與Wang 等人觀點是一致的［28］。在高氮條件下，施加PASP 明顯降低了楊樹生物量、葉片數(shù)和根長，根冠比略有升高，這可能與高氮條件下施加PASP 加重了高氮脅迫有關(guān)。這些實驗結(jié)果表明，低氮條件生長的“南林895 楊”通過添加一定量的PASP 有望實現(xiàn)減氮不減產(chǎn)，即減肥增效的目的。本實驗條件下，與不加PASP 的氮處理相比，以2 N+100 mg·L-1PASP 處理“南林895 楊”生長表現(xiàn)最好，以0.2 N+100 mg·L-1PASP 處理對“南林895 楊”氮的吸收利用的促進(jìn)效果最好。

前人研究發(fā)現(xiàn)營養(yǎng)液中添加一定量的PASP可以很好的降低水培蔬菜中硝酸鹽的含量［16］。本研究也發(fā)現(xiàn)，施加PASP 能夠降低楊樹幼苗硝態(tài)氮含量，這在無氮和低氮條件下尤為明顯，同期NR和AspAT 酶活性增高，表明PASP 能夠促進(jìn)植物體內(nèi)硝態(tài)氮的同化，增加N 代謝流向天冬氨酸的合成和代謝通路。與此同時，施加PASP 使楊樹幼苗體內(nèi)銨態(tài)氮含量增加，同期GS 酶活性降低，GOGAT 酶活性增高，由于營養(yǎng)液中沒有銨態(tài)氮，因此增加的銨態(tài)氮主要由N 在植物體內(nèi)的代謝產(chǎn)生，表明施加PASP 促進(jìn)了植物體內(nèi)N 的同化和轉(zhuǎn)化。此外，本研究中NUtE 隨著氮濃度的增加而明顯降低，低氮時施加PASP 顯著的提高了NUtE，然而高氮時施加PASP 卻顯著的降低了NUtE。分析原因可能是低氮時，PASP 的施加能夠螯合和富集營養(yǎng)液中的氮，因而有利于植物吸收和利用有限的氮源。達(dá)到正常供氮水平（2 N）的氮濃度后，過多的氮不能被楊樹完全吸收，導(dǎo)致了氮在根部積累，PASP 的施加可能進(jìn)一步增加了氮的積累，局部過多的氮對植物產(chǎn)生毒害，影響植物對氮的吸收和利用，從而抑制植物生長。