陳邦蘭 翟夢倩 龍濤 趙順程 劉娟 尹茂靈 萬心言 王治杰 劉繼愷

摘要?自然抗性相關(guān)巨噬細(xì)胞蛋白（natural?resistance?associated?macrophage?proteins，NRAMPs）是一類高度保守的二價金屬跨膜轉(zhuǎn)運蛋白，在調(diào)控生物體內(nèi)重金屬穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用。為了探究煙草NRAMP基因的多樣性，該研究根據(jù)煙草基因組數(shù)據(jù)信息，利用生物信息學(xué)方法對煙草NRAMP基因家族成員進行了鑒定，對其基本信息、結(jié)構(gòu)特點、蛋白理化性質(zhì)及保守序列、啟動子元件和組織表達(dá)模式等進行了分析。結(jié)果表明：煙草基因組含有9個NtNRAMP基因，分別命名為NtNRAMP1.1～6.2，其編碼氨基酸長度為500～542?aa，蛋白分子量為54.31～59.11?kD，等電點為5.09～8.73，總平均親水性為0.475～0.604;除了NRAMP6.1和6.2不含有motif4外，其余NRAMP蛋白都含有motif1～motif10。順式作用元件分析表明所有NtNRAMP基因啟動子中均含有參與基因轉(zhuǎn)錄、非生物脅迫、植物激素響應(yīng)和光應(yīng)答途徑的元件，部分基因含有生物脅迫、次生代謝、組織表達(dá)和結(jié)合位點的元件。染色體定位發(fā)現(xiàn)，6個NtNRAMP基因分別分布在5條煙草染色體上。表達(dá)分析表明：NtNRAMP基因組織表達(dá)模式差異較大，其中NtNRAMP6.1和NtNRAMP6.2基因表達(dá)具有組織特異性。該研究結(jié)果為進一步研究煙草NtNRAMP基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞?自然抗性相關(guān)巨噬細(xì)胞蛋白;煙草;基因家族;表達(dá)分析

中圖分類號?S572?文獻標(biāo)識碼?A?文章編號?0517-6611（2021）03-0100-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.03.027

Abstract?Natural?resistance?associated?macrophage?proteins?（NRAMPs）?are?highly?conserved?bivalent?metal?transporters?that?play?an?important?role?in?regulating?heavy?metal?homeostasis.?In?order?to?explore?the?diversity?of?the?NRAMP?gene?in?tobacco，?this?study?identified?the?members?of?the?NRAMP?gene?family?of?tobacco?by?using?bioinformatics?methods?based?on?the?genome?data?of?N.?tabacum，?and?analyzed?the?basic?information，?structural?features，?physicochemical?parameters，?conserved?motifs，?cisacting?elements，?tissue?expression?pattern?of?these?NtNRAMP?genes.?The?results?showed?that?N.?tabacum?genome?contained?9?NtNRAMP?genes?which?were?designated?as?NtNRAMP1.16.2.?The?length?of?NtNRAMP?proteins?ranged?from?500?to?542?amino?acid;the?relative?molecular?weight?ranged?from?54.31?to?59.11?kD;the?predicted?pI?ranged?from?5.09?to?8.73，?and?the?predicted?GRAVY?ranged?from?0.475?to?0.604.?Except?for?NRAMP6.1?and?NRAMP?6.2，?which?did?not?contained?motif4，?all?NtNRAMP?proteins?contained?motif1motif10.?Cisacting?regulatory?element?prediction?showed?that?all?NtNRAMP?genes?contained?elements?involved?in?gene?transcription，?abiotic?stress，?plant?hormone?response?and?light?response?pathways，?however，?some?genes?contained?elements?involved?in?biological?stress，?secondary?metabolism，?tissue?expression?and?binding?sites.?Chromosomal?localization?revealed?that?6?of?9?NtNRAMP?genes?were?located?in?5?tobacco?chromosomes.?The?tissue?expression?profile?analysis?showed?diverse?tissue?expression?patterns?of?NtNRAMPs，?and?NtNRAMP6.1?and?NtNRAMP6.2?showed?tissue?specific?expression?patterns.?These?results?laid?a?foundation?for?further?functional?characterization?of?NtNRAMP?genes.

Key?words?Natural?resistance?associated?macrophage?proteins;Nicotiana?tabacum;Gene?family;Expression?analysis

Cu、Fe、Mn和Zn等過渡金屬是生物體重要的微量元素，在植物生長發(fā)育和新陳代謝中起著關(guān)鍵作用[1]。但同時，這些金屬含量又必須保持在合理水平，一旦過量則會對細(xì)胞產(chǎn)生毒害。還有一些金屬，如Cd、Pd和Hg等，它們雖然不是必需元素，但也可以被植物吸收，對植物造成負(fù)面影響[2]。為了適應(yīng)環(huán)境變化，植物在長期進化過程中形成了一套復(fù)雜且精密的調(diào)控過程以保證體內(nèi)重金屬的穩(wěn)態(tài)，而重金屬轉(zhuǎn)運蛋白在這一調(diào)控過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[3]。

自然抗性相關(guān)巨噬細(xì)胞蛋白（natural?resistance?associated?macrophage?proteins，NRAMPs）是一類高度保守的二價金屬跨膜轉(zhuǎn)運蛋白，廣泛存在于細(xì)菌、酵母、果蠅、人類和植物中[4]。NRAMP基因最早在老鼠中被克隆，該基因在老鼠抵御分枝桿菌過程中起到重要作用[5]。目前，科學(xué)家們已克隆到多個植物NRAMP基因，并對部分NRAMP基因進行了功能研究。模式植物擬南芥有6個NRAMP基因（AtNRAMP1～6）。已有研究發(fā)現(xiàn)，AtNRAMP1是定位于擬南芥根細(xì)胞質(zhì)膜上的高親和性Mn轉(zhuǎn)運蛋白，該蛋白負(fù)責(zé)擬南芥在低Mn環(huán)境對Mn的吸收[6]。AtNRAMP2是一種定位于反面高爾基網(wǎng)絡(luò)（TransGolgi?Network）的Mn轉(zhuǎn)運蛋白，該蛋白在維持細(xì)胞內(nèi)Mn的正常分布以及Mn缺乏條件下根的生長中發(fā)揮重要作用[7-8]。與AtNRAMP1和AtNRAMP2不同，AtNRAMP3和AtNRAMP4蛋白定位于液泡膜上，是Fe和Mn的轉(zhuǎn)運蛋白，調(diào)控Fe缺乏下的種子萌發(fā)以及Mn缺乏下植物的光合作用和生長[9-11]。AtNRAMP6定位于擬南芥?zhèn)雀陀啄廴~片細(xì)胞的高爾基體或反面高爾基網(wǎng)絡(luò)上，是Cd和Fe的轉(zhuǎn)運蛋白[12-13]。

煙草是我國重要的非食品性經(jīng)濟作物，易吸收和富集重金屬，這些重金屬可通過吸煙進入人體，危害人體健康[14]。對煙草金屬轉(zhuǎn)運蛋白進行鑒定和功能研究對于進一步闡明煙草對重金屬的吸收富集機制，保證煙葉安全性是十分必要的。之前在煙草中鑒定到26個金屬耐受蛋白（metal?tolerance?protein，MTP）編碼基因，并發(fā)現(xiàn)NtMTP?8.1、NtMTP8.4和NtMTP11.1可以在酵母中轉(zhuǎn)運Mn[15]。該研究采用生物信息學(xué)手段對煙草NRAMP基因家族進行鑒定，并對它們的基因特征和組織表達(dá)模式進行分析，旨在為煙草NRAMP基因的功能研究奠定基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1?煙草NRAMP基因的鑒定

以擬南芥中6個NRAMP蛋白氨基酸序列作為查詢序列，在煙草基因組數(shù)據(jù)庫（Nitab?v4.5?cDNA?Edwards，2017，https：∥solgenomics.net/）中進行TBLASTN比對搜索。去除冗余序列后，將得到的序列用InterProScan（http：∥www.ebi.ac.uk/interpro/）工具驗證是否屬于NRAMP家族（IPR001046）[16]。經(jīng)驗證后的序列為煙草NtNRAMP蛋白序列，下載對應(yīng)的基因號、基因組位置等信息。將獲得的NtNRAMP蛋白序列在NCBI中分別與擬南芥6個AtNRAMP蛋白序列作比對，綜合序列一致性和覆蓋度結(jié)果對NtNRAMP基因進行命名。

1.2?煙草NRAMP蛋白生化參數(shù)和結(jié)構(gòu)特征

利用ProParam工具預(yù)測煙草NRAMP蛋白的分子量、等電點和親水性[17]，利用PlantmPloc預(yù)測亞細(xì)胞定位[18]，利用TMHMM?Server?V.2.0預(yù)測跨膜結(jié)構(gòu)域[19-20]，利用MEME程序預(yù)測保守基序（motif）[21]。

1.3?煙草NRAMP基因結(jié)構(gòu)和染色體定位分析

利用Sol?Genomics?Network（SGN）網(wǎng)站（https：∥solgenomics.net/）煙草基因組注釋信息分析煙草NRAMP基因結(jié)構(gòu)和染色體定位。最后，運用TBtools軟件進行外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)、蛋白結(jié)構(gòu)和染色體定位作圖[22]。

1.4?煙草NRAMP基因順式作用元件及組織表達(dá)特性分析

在上述SGN網(wǎng)站的煙草基因組數(shù)據(jù)庫（Nitab?v4.5?Genome?Scaffolds?Edwards，2017）中搜索獲得煙草NRAMP基因上游1?500?bp序列，利用在線網(wǎng)站PlantCARE對獲得的序列進行順式作用元件的預(yù)測[23]。為了研究煙草NRAMP基因的組織表達(dá)模式，從GenBank?Sequence?Read?Archive（SRA）上下載煙草TN90的RNA轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（登記號SRP029183），分析目的基因在8個不同煙草組織中的相對表達(dá)量并用TBtools軟件作圖。

2?結(jié)果與分析

2.1?煙草NRAMP基因的鑒定及蛋白理化性質(zhì)分析

利用生物信息學(xué)方法在煙草基因組數(shù)據(jù)庫中進行檢索，共鑒定出9個NtNRAMP基因，綜合這9個基因編碼蛋白序列與擬南芥AtNRAMP序列的比對結(jié)果，分別將它們命名為NtNRAMP1.1、1.2、2.1、2.2、2.3、3.1、3.2、6.1、6.2（表1）。

利用在線軟件對NtNRAMP基因及其編碼蛋白進行理化特性分析，結(jié)果表明（表2），NtNRAMP基因蛋白質(zhì)編碼區(qū)（coding?sequence，CDS）長度在1?503?bp（NtNRAMP6.2）～2?024?bp（NtNRAMP3.1），平均為1?691?bp;氨基酸個數(shù)在500?aa（NtNRAMP6.2）～542?aa（NtNRAMP2.2）;相對分子質(zhì)量介于54.31～59.11?kD;等電點為5.09～8.73，其中NRAMP1.1、1.2、6.1、6.2為堿性蛋白，其余為酸性蛋白;總平均親水性為0.475～0.604;跨膜結(jié)構(gòu)域（transmembrane?domain，TMD）數(shù)目相近，NRAMP2.1、2.2、6.1、6.2有10個TMD，NRAMP2.3、3.1和3.2有11個TMD，NRAMP1.1和1.2有12個TMD;值得注意的是，9個NtNRAMP蛋白均被預(yù)測定位于細(xì)胞膜。

2.2?煙草NRAMP基因的染色體分布

對NtNRAMP基因的染色體定位進行分析，結(jié)果顯示（圖1），6個NtNRAMP基因分布于5條煙草染色體上（分別是3、4、6、12、17號染色體），其中12號染色體含有2個NtNRAMP基因（NtNRAMP2.1和NtNRAMP6.1），其余4條染色體各含有1個NtNRAMP基因。

2.3?煙草NRAMP基因結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)保守序列分析

利用NtNRAMP基因的注釋信息和TBtools軟件分析煙草NRAMP的基因結(jié)構(gòu)。結(jié)果如圖2所示，NRAMP2.1、2.2、2.3、3.1、3.2基因具有相同的外顯子數(shù)目（4個），NRAMP6.1和6.2基因具有12個外顯子，NRAMP1.1和1.2基因具有13個外顯子，其中NRAMP1.1、1.2、3.1、3.2基因存在上游和下游非翻譯區(qū)（UTR）。蛋白質(zhì)保守序列分析結(jié)果顯示：除了NRAMP6.1和6.2不含有motif4外，所有NRAMP蛋白都含有motif1～motif10。

2.4?煙草NRAMP基因家族順式作用元件分析

通過分別對9個NtNRAMP基因上游1?500?bp序列進行分析，預(yù)測其可能含有的順式作用元件。結(jié)果顯示（表3），所有NtNRAMP基因均含有參與基因轉(zhuǎn)錄、非生物脅迫、植物激素響應(yīng)、光應(yīng)答途徑的元件，其中含有涉及基因轉(zhuǎn)錄的作用元件最多（45～72個）;此外，NRAMP1.1和1.2還各含有1個生物脅迫元件，NRAMP3.2、6.1、6.2各含有1個次生代謝元件，除NRAMP2.3和3.1外，其余基因啟動子中均含有1～2個組織表達(dá)元件，除NRAMP1.1、2.3、3.2外，其余基因啟動子中均含有1～2個結(jié)合位點元件。

2.5?煙草NRAMP基因組織表達(dá)模式分析

利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析煙草NRAMP基因分別在幼嫩/成熟的花、幼嫩/成熟/衰老的葉、干燥的蒴果、根、莖8個組織中的表達(dá)情況。結(jié)果如圖3所示，NRAMP1.1基因的表達(dá)在整體上均高于NRAMP1.2，NRAMP1.1基因在根中的表達(dá)量最高，而NRAMP1.2基因在莖中表達(dá)量最高，在干燥的蒴果里幾乎不表達(dá);NRAMP2.1和2.2在煙草各組織中均有表達(dá)，具有相似的組成型表達(dá)模式;NRAMP2.3與NRAMP2.1和2.2相比，在各組織中的表達(dá)量相對較低，特別在根、干燥的蒴果、成熟/衰老的葉中表達(dá)量很低;NRAMP3.1和3.2基因的組織表達(dá)模式相似，在煙草各組織中均有表達(dá)，且在幼嫩的葉中表達(dá)量最高;NRAMP6.1和NRAMP6.2基因的表達(dá)具有組織特異性，NRAMP6.1基因只在根和成熟的花中表達(dá)，而NRAMP6.2基因還在幼嫩的花中表達(dá)，這2個基因在其余組織中均無表達(dá)或表達(dá)量極低。

3?討論

金屬轉(zhuǎn)運蛋白，比如NRAMP，是生物體金屬特異轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的主要組成部分，在維持細(xì)胞及其細(xì)胞器內(nèi)重金屬穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著重要作用。近年來，隨著植物基因組學(xué)研究的不斷深入，研究者們利用比較基因組學(xué)等方法成功對水稻、大豆和可可中的NRAMP基因家族進行了鑒定分析[24-26]。該研究利用同樣的方法在煙草基因組中鑒定到9個NtNRAMP基因，同時運用生物信息學(xué)方法對這些基因的基本信息、結(jié)構(gòu)特點、蛋白理化性質(zhì)及保守序列、啟動子元件和組織表達(dá)模式等進行了分析預(yù)測，這些結(jié)果將為煙草NRAMP基因家族功能研究以及其分子調(diào)控機制的闡明提供理論依據(jù)。

水稻含有7個NRAMP基因，這些基因編碼蛋白的分子量在55.81～59.71?kD，含有10～12個跨膜結(jié)構(gòu)域，且全部定位于質(zhì)膜上[25]。大豆基因組包含13個NRAMP，它們的分子量在55.44～64.39?kD，GmNRAMP1a～GmNRAMP4b定位于液泡膜，GmNRAMP5a～GMNRAMP7定位于質(zhì)膜[24]。擬南芥有6個NRAMP，它們分別在質(zhì)膜、液泡膜和高爾基體上發(fā)揮作用。研究中，煙草NtNRAMP的分子量為54.31～59.11?kD，跨膜結(jié)構(gòu)域為10～12，定位于細(xì)胞膜。通過比較這些結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，不同植物中NRAMP蛋白的分子量大小和跨膜結(jié)構(gòu)域數(shù)目比較相似，但在亞細(xì)胞定位方面卻存在差異。亞細(xì)胞定位是闡釋金屬轉(zhuǎn)運蛋白生物學(xué)功能的重要數(shù)據(jù)，因此下一步有必要利用試驗技術(shù)，如熒光蛋白表達(dá)結(jié)合共聚焦顯微鏡觀察、免疫印跡等，對煙草NRAMP各成員的亞細(xì)胞定位進行深入研究。

為了探索調(diào)控NtNRAMP基因表達(dá)的潛在機制，該研究對煙草NtNRAMP基因上游的順式作用元件進行了分析，共鑒定到656個順式作用元件。其中，所有NtNRAMP基因啟動子中都含有參與非生物脅迫、植物激素響應(yīng)、光應(yīng)答途徑的順式作用元件，表明NtNRAMP基因廣泛參與到這些生物過程中。值得注意的是，和其他NRAMP基因相比，僅NRAMP1.1和1.2各含有1個生物脅迫元件，NRAMP3.2、6.1、6.2各含有1個次生代謝元件，說明這些基因還可能特異性地在生物脅迫響應(yīng)和次生代謝途徑中發(fā)揮作用。

煙草NRAMP基因在幼嫩/成熟的花、幼嫩/成熟/衰老的葉、干燥的蒴果、根、莖8個組織中有不同程度的表達(dá)，但組織表達(dá)模式差異較大，其中NtNRAMP6.1和NtNRAMP6.2基因只在根和花中表達(dá)，其表達(dá)具有組織特異性。最近的研究發(fā)現(xiàn)擬南芥AtNRAMP6基因能夠調(diào)控Fe缺乏情況下擬南芥?zhèn)雀纳L，而對主根沒有影響[13]。因此，NtNRAMP6.1和NtNRAMP6.2可能會通過調(diào)控根和花細(xì)胞中金屬穩(wěn)態(tài)從而影響煙草根和花的生長發(fā)育。

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