郭慧芳，李 寧，王白玉，喬麒龍，黃 慶，李永濤，王 增，趙 軍

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，鄭州 450046)

禽腺病毒血清4型(fowl adenovirus serotype 4，F(xiàn)AdV-4)是屬于禽腺病毒科、禽腺病毒屬的雙鏈DNA病毒，是引起肝炎-心包積液綜合征(hepatitis-hydropericardium syndrome，HHS)的主要病原[1]。HHS于1987年最早發(fā)生于巴基斯坦，隨后在印度、科威特、伊拉克、日本、韓國、墨西哥等國家以及中美洲、南美洲等地區(qū)發(fā)生。自2015年5月份以來，由FAdV-4新基因型導(dǎo)致的HHS在我國主要養(yǎng)禽地區(qū)流行，給我國養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大損失[2-4]。目前，F(xiàn)AdV-4的致病機(jī)制尚不明了?，F(xiàn)有的研究顯示，致病性FAdV-4感染后誘導(dǎo)雞天然免疫應(yīng)答，肝中白介素1β(IL-1β)的表達(dá)量顯著升高[5-6]。

IL-1β的表達(dá)和分泌與NLRP3炎癥小體密切相關(guān)。多種刺激原可以激活胞質(zhì)天然免疫信號受體NLRP3，激活后的NLRP3使NLRP3炎性小體組裝活化，從而引發(fā)IL-1β的分泌[7-9]。NLRP3是宿主細(xì)胞的核苷酸結(jié)合寡聚結(jié)構(gòu)域(nucleotide binding oligomerization domain, NOD)樣受體(NLRs)病原模式識別受體(pattern recognition receptors, PRRS)識別病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPS)或危險相關(guān)分子模式(danger associated molecular patterns, DAMPS)后，再與凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis associated speck-like protein containing a C-terminal caspase recruitment domain, ASC)及 Caspase-1(cysteine requiring aspartate protease-1, Caspase-1)共同組成的多聚蛋白復(fù)合體[10-13]。NLRP3炎性小體是天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分，可響應(yīng)病原刺激和細(xì)胞損傷，介導(dǎo)Caspase-1激活和促炎細(xì)胞因子IL-1β和IL-18等炎性因子的成熟和分泌，從而引發(fā)炎癥反應(yīng)[14-16]。

鑒于NLRP3炎癥小體的活化與IL-1β的表達(dá)和分泌密切相關(guān)，本研究嘗試建立檢測雞NLRP3的實(shí)時熒光定量PCR方法，對FAdV-4感染雞組織中NLRP3基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行分析，以期為解析NLRP3在FAdV-4致病機(jī)制中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

致病性禽腺病毒4型(FAdV-4)毒株CH/HNJZ/2015(GenBank登錄號：KU558760)由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)傳染病實(shí)驗(yàn)室保存；總RNA提取試劑盒購自TIANGEN；反轉(zhuǎn)錄試劑購自TOYOBO；質(zhì)粒提取和DNA膠回收試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司；常規(guī)PCR試劑、pMD-18T vector、SYBR Green Ⅰ 染料和DNA Marker均購自TaKaRa。

1.2 方法

1.2.1 雞NLRP3基因的RT-PCR擴(kuò)增和標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的制備 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中雞NLRP3基因序列(GenBank登錄號：KF318520.1)，設(shè)計雞NLRP3熒光定量特異性引物，qNLRP3-F：5′-TGAGGATTTGGACACCTTCCACCT-3′和qNLRP3-R：5′-TGCTTGATGCAGAAGCAAAGAGCC-3′。利用總RNA提取試劑盒，提取4周齡SPF雞肝總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用特異性引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增180 bp的NLRP3基因片段。將擴(kuò)增片段連接到pMD-18T載體，構(gòu)建pMD-18T-NLRP3重組質(zhì)粒，測定質(zhì)粒濃度并根據(jù)換算公式計算出重組質(zhì)粒的拷貝數(shù)：拷貝數(shù)(copies·μL-1)=[6.02×1023×(質(zhì)粒濃度ng·μL-1×10-9)]/[DNA長度(bp)×660]。

1.2.2 雞NLRP3熒光定量PCR的建立 以標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pMD-18T-NLRP3為模板，利用SYBR Green Ⅰ 染料和雞NLRP3熒光定量PCR特異性引物，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。以出現(xiàn)熒光的Cq值最小和相對熒光強(qiáng)度(RFU)最大及熔解曲線不出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增峰為標(biāo)準(zhǔn)，分別對引物終濃度、退火溫度和循環(huán)數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pMD-18T-NLRP3進(jìn)行10倍倍比稀釋，取1.0×103～1.0×107copies·μL-1稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒作為模板，以最佳反應(yīng)條件建立雞NLRP3實(shí)時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 致病性禽腺病毒4型(FAdV-4)感染雞不同組織中NLRP3基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測 60只4周齡SPF雞(購自山東昊泰實(shí)驗(yàn)動物繁育有限公司)被隨機(jī)平均分成2組，F(xiàn)AdV-4感染組雞用105TCID50致病性FAdV-4毒株CH/HNJZ/2015經(jīng)口服途徑感染，對照組口服PBS。FAdV-4感染雞在感染后4～6 d，相繼發(fā)病死亡。分別取發(fā)病/死亡雞和對照雞的心、肝、肺、脾、腎、腺胃和盲腸扁桃體等組織樣品，立即凍存于-80 ℃。利用RNA提取試劑盒提取各組織的總RNA，定量1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板，利用建立的NLRP3熒光定量PCR檢測雞組織中NLRP3基因的轉(zhuǎn)錄水平。再利用GraphPad Prism5.0軟件進(jìn)行單因子方差(One-way ANOVA)分析和t檢驗(yàn)統(tǒng)計分析。**表示差異顯著(P<0.01)，***表示差異極顯著(P<0.001)。

2 結(jié) 果

2.1 雞NLRP3基因擴(kuò)增和標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的制備

以雞肝總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，使用常規(guī)PCR擴(kuò)增NLRP3目的基因。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測，可觀察到180 bp目的條帶，大小與預(yù)期相符合(圖1)。將PCR產(chǎn)物膠回收純化后連接至pMD-18T載體，經(jīng)測序鑒定成功得到pMD-18T-NLRP3重組質(zhì)粒。測定pMD-18T-NLRP3標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度為233 ng·μL-1，利用計算公式計算出該標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)約為7.5×1010copies·μL-1。

M. DL2000 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. 擴(kuò)增的NLRP3基因；2.空白對照M. DL2000 DNA marker; 1.Amplified NLRP3 gene; 2.Blank control圖1 NLRP3基因的擴(kuò)增Fig.1 Amplification of NLRP3 gene

2.2 雞NLRP3熒光定量 PCR的建立

經(jīng)過一系列熒光定量反應(yīng)條件的篩選，最終的反應(yīng)體系為總體系20 μL，其中，SYBR?Prexim ExTaqTMⅡ 10 μL，無菌DEPC水6 μL，qNLRP3-F/R(10 μmol·L-1)各1 μL，模板2 μL。最佳反應(yīng)條件：95 ℃ 1 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 8 s，共40個循環(huán)；95 ℃ 10 s；65 ℃ 5 s；95 ℃ 5 s。在該條件下熔解曲線單峰，表明設(shè)計的引物特異性良好(圖2)。

利用1.0×107、1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103copies·μL-1稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品為模板進(jìn)行熒光定量PCR。熒光定量結(jié)果顯示，以相對熒光強(qiáng)度(RFU)為縱坐標(biāo)，循環(huán)數(shù)(cycle)為橫坐標(biāo)建立的擴(kuò)增曲線光滑，擴(kuò)增效率好；熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線顯示，以Cq值為Y、拷貝數(shù)為X建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=-3.434lgX+37.777，相關(guān)系數(shù)R2為0.999，擴(kuò)增效率E為95.5%，滿足R2>0.999，110%>E>90%。 標(biāo)準(zhǔn)曲線顯示質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)與Cq值之間具有良好的線性關(guān)系(圖2)。

A.擴(kuò)增曲線；B.標(biāo)準(zhǔn)曲線(X為拷貝數(shù))；C.熔解曲線；1～5. 1.0×107～1.0×103 copies·μL-1A. Amplification curve; B. Standard curve (X.Copies number); C. Melting curve；1-5. 1.0×107-1.0×103 copies·μL-1圖2 雞NLRP3 SYBR Green Ⅰ 實(shí)時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線建立Fig.2 Establishment of standard curve of chicken NLRP3 SYBR Green Ⅰ real-time PCR

2.3 致病性FAdV-4感染雞不同組織中NLRP3基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測

利用建立的雞NLRP3 SYBR Green Ⅰ 熒光定量PCR方法，對致病性FAdV-4感染雞和未感染對照雞各組織中NLRP3的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行測定。結(jié)果顯示，該方法能檢測出雞不同組織中NLRP3基因的轉(zhuǎn)錄，各組織中NLRP3的轉(zhuǎn)錄水平有所差異。FAdV-4感染雞肝和脾中NLRP3的轉(zhuǎn)錄水平極顯著(P<0.001)高于對照組，盲腸扁桃體和法氏囊中NLRP3的轉(zhuǎn)錄水平顯著(P<0.01)高于對照組(圖3)。在致病性FAdV-4感染雞的心、肝和脾組織中NLRP3的轉(zhuǎn)錄水平極顯著(P<0.001)高于法氏囊、肺、腎、腺胃和盲腸扁桃體，而心、肝、脾組織中NLRP3的轉(zhuǎn)錄水平差異不顯著。法氏囊中NLRP3的轉(zhuǎn)錄水平極顯著(P<0.001)高于肺、腎、腺胃和盲腸扁桃體，且盲腸扁桃體中NLRP3的轉(zhuǎn)錄水平極顯著(P<0.001)高于肺、腎和腺胃，腎中NLRP3的轉(zhuǎn)錄水平極顯著(P<0.001)高于肺和腺胃，肺和腺胃組織中NLRP3的轉(zhuǎn)錄水平差異不顯著。

組間比較，**. 差異顯著(P<0.01)； ***. 差異極顯著(P<0.001)。感染組組織間比較，不同字母表示差異極顯著(P<0.001).Comparison between groups, **. Significant difference (P<0.01); ***. Extremely significant difference (P<0.001). Comparison among organizations of infected group, different letters indicate significant differences (P<0.001)圖3 SYBR Green Ⅰ 實(shí)時熒光定量PCR檢測FAdV-4感染雞組織中的NLRP3基因轉(zhuǎn)錄水平Fig.3 SYBR Green I real-time PCR for quantitative detection of NLRP3 gene in FAdV-4-infected chicken tissues

3 討 論

炎癥小體既是宿主天然免疫應(yīng)答的重要組成部分，同時也在病毒致病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[17]。NLRP3炎性小體是天然免疫系統(tǒng)的重要調(diào)節(jié)劑，在正常細(xì)胞中保持較低的水平，然而，一些病原的刺激會引起NLRP3炎性小體的過度活化，從而誘發(fā)細(xì)胞炎性因子風(fēng)暴導(dǎo)致機(jī)體的病理損傷[18-19]，NLRP3分子是NLRP3炎癥小體復(fù)合物的重要組成成分[20-21]，很多病毒感染與NLRP3炎癥小體的激活相關(guān)[22]。參與激活過程的病毒組分主要包括病毒核酸、離子通道蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白等。如人腺病毒感染巨噬細(xì)胞可以導(dǎo)致IL-1β的快速釋放，這種反應(yīng)依賴于NLRP3炎癥小體的形成和Caspase-1的活化[23-24]；流感病毒的RNA和M2通道蛋白均可激活炎癥小體[25-26]；腦心肌炎病毒的通道蛋白2B可以激活NLRP3炎癥小體[27]；豬瘟病毒的p7通道蛋白可激活豬巨噬細(xì)胞炎癥小體[28]；豬繁殖與呼吸綜合征病毒通過NLRP3炎癥小體活化誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表達(dá)IL-1β[29-30]。丙型肝炎病毒感染會刺激肝巨噬細(xì)胞中NLRP3炎癥小體活化產(chǎn)生IL-1β進(jìn)而造成肝炎癥[31]。迄今為止，與病毒感染相關(guān)的NLRP3炎癥小體的研究報道主要集中在哺乳動物模型，而與禽類病毒感染相關(guān)的禽NLRP3炎癥小體的研究相對較少，主要原因是受限于禽類NLRP3炎癥小體相關(guān)分子的檢測方法和研究材料。Ye等[32]首次研究了中國三黃雞體內(nèi)NLRP3的組織特異性表達(dá)圖譜和組織分布。陶志云等[33]開展了雞小腸上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)和NLRP3在該細(xì)胞中的表達(dá)研究。Wang等[34]證明新城疫病毒(NDV)可以激活小鼠和人巨噬細(xì)胞中的NLRP3和增加IL-1β的表達(dá)。Gao等[35]首次證實(shí)了NDV在感染的雞細(xì)胞中通過活化NLRP3/Caspase-1炎癥小體誘導(dǎo)IL-1β的高表達(dá)。建立雞NLRP3分子的檢測技術(shù)有助于研究其在禽病發(fā)生中的作用。目前國內(nèi)外尚未見有關(guān)雞NLRP3分子實(shí)時熒光定量PCR檢測方法的報道。

自2015年5月份以來，由FAdV-4導(dǎo)致的雞HHS給我國養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大損失。研究顯示，致病性FAdV-4感染雞的肝、肺、脾和法氏囊等組織存在嚴(yán)重的淋巴細(xì)胞變性、壞死等炎癥損傷，而且這些組織中IL-1β的表達(dá)量與未感染對照雞相比顯著升高[5-6]。鑒于NLRP3炎癥小體的活化與IL-1β的表達(dá)和分泌密切相關(guān)，本研究設(shè)計雞NLRP3特異性引物，建立了檢測雞NLRP3的 SYBR Green Ⅰ 熒光定量PCR方法，并利用該方法對致病性FAdV-4感染雞組織中NLRP3基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，所建立方法對雞NLRP3標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的擴(kuò)增曲線良好，標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)與Cq值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，所設(shè)計的NLRP3引物可特異性擴(kuò)增雞NLRP3基因。

應(yīng)用所建立的SYBR Green Ⅰ 熒光定量PCR對致病性FAdV-4感染雞和正常雞組織中NLRP3基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示，該方法能檢測出不同組織中NLRP3基因的轉(zhuǎn)錄。與對照組比對發(fā)現(xiàn)，NLRP3分子在致病性FAdV-4感染雞肝、脾中的轉(zhuǎn)錄水平極顯著高于對照組，在盲腸扁桃體和法氏囊的表達(dá)顯著高于對照組，提示這些器官是致病性FAdV-4的主要靶器官。致病性FAdV-4感染發(fā)病雞的心、肝、脾和法氏囊組織中NLRP3的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于其他組織，這也與筆者前期研究結(jié)果顯示的致病性FAdV-4感染雞的心、肝、脾和法氏囊組織中IL-1β的高水平表達(dá)，以及這些組織的嚴(yán)重炎癥損傷病變相一致。鑒于NLRP3炎癥小體在IL-1β成熟和分泌過程中扮演重要角色，而IL-1β又是炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)，筆者推測致病性FAdV-4的致病過程是通過激活NLRP3炎癥小體，進(jìn)而導(dǎo)致炎癥因子IL-1β的過量表達(dá)和分泌，最終導(dǎo)致機(jī)體組織的組織炎癥損傷。

4 結(jié) 論

本研究建立了一種檢測禽腺病毒血清4型(FAdV-4)感染雞組織中NLRP3基因轉(zhuǎn)錄水平的實(shí)時熒光定量PCR方法，該方法能檢測雞不同組織中NLRP3基因的轉(zhuǎn)錄，檢測結(jié)果表明各組織中NLRP3的轉(zhuǎn)錄水平有所差異。致病性FAdV-4感染發(fā)病雞肝、脾、盲腸扁桃體和法氏囊中NLRP3的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于未感染對照組(P<0.01)；NLRP3分子在致病性FAdV-4感染雞的心、肝、脾和法氏囊組織中的轉(zhuǎn)錄水平極顯著高于其他組織(P<0.001)。 本研究可為進(jìn)一步研究雞NLRP3分子在FAdV-4致病機(jī)制中的作用提供方法和技術(shù)支持。