張海洋，陸翔宇，張家華，劉 欣，韓政軒，崔 安，趙 元，宋曼玉，劉 濤，范宏剛

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030)

膿毒血癥是由外傷感染、創(chuàng)傷、再灌注損傷及缺氧等所誘發(fā)的劇烈全身炎癥反應(yīng)綜合征。在獸醫(yī)臨床中，膿毒血癥主要繼發(fā)于犬、貓子宮蓄膿，膿皮癥及嚴(yán)重外科感染等過程中，如不及時治療將導(dǎo)致多器官衰竭，最終導(dǎo)致患畜死亡[1]。脂多糖(LPS)是革蘭陰性菌細(xì)胞壁主要成分，也是膿毒血癥引發(fā)休克的主要啟動因子[2]。近年來，腹腔注射LPS是建立膿毒血癥動物模型的常用手段。LPS可造成機(jī)體多組織、器官繼發(fā)性損傷[3-4]，海馬是其主要損傷靶組織之一[5]。海馬是記憶和學(xué)習(xí)功能的主要場所，當(dāng)受到有毒物質(zhì)侵害時，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，尤其是小膠質(zhì)細(xì)胞會被促炎因子大量激活，釋放炎性因子，引起海馬炎癥，嚴(yán)重時可導(dǎo)致動物行為異常和認(rèn)知功能障礙[6]。

褪黑素(MT)是由腦松果體合成、分泌的一種吲哚類神經(jīng)內(nèi)分泌激素，具有調(diào)節(jié)機(jī)體晝夜節(jié)律、保護(hù)膽堿、抗氧化、抗炎等功效，參與體內(nèi)多種生理反應(yīng)[7]。目前，已應(yīng)用于催眠、抗衰老、抗癌及抗心腦血管疾病治療等領(lǐng)域[8-9]。近年來，MT在神經(jīng)保護(hù)方面的作用日益受到重視。研究表明，其能修復(fù)受損的神經(jīng)元突觸，促進(jìn)神經(jīng)元間的信號交流，延緩神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生[10-11]。有研究發(fā)現(xiàn)，MT可以通過降低組織中IL-1β、IL-6及TNF-α等含量，改善炎癥反應(yīng)[12]。此外，MT還可上調(diào)抗炎因子IL-10和TGF-β蛋白及基因表達(dá)[9]，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，對抗寄生蟲感染所引起的炎癥反應(yīng)[13]。因此，MT可以促進(jìn)機(jī)體的免疫應(yīng)答，抑制炎性因子的釋放，使機(jī)體產(chǎn)生抗炎性因子，從而起到抗炎作用。但是，其在膿毒血癥致海馬炎性損傷中的具體作用尚待研究。

本研究從抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化，減少促炎因子分泌，促進(jìn)抗炎因子生成的角度，探究MT對LPS致大鼠海馬炎性損傷的保護(hù)作用，為獸醫(yī)和醫(yī)學(xué)臨床中推進(jìn)MT在防治LPS導(dǎo)致的膿毒性腦病中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與飼養(yǎng)

選取4周齡健康雄性SD大鼠40只，體重180～200 g，購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng)管理，飼養(yǎng)溫度控制在22～24 ℃，相對濕度50%～60%，保持室內(nèi)光照12 h/12 h晝夜交替，保持通風(fēng)良好，不限制飲食飲水，所有大鼠飼養(yǎng)1周后進(jìn)入正式試驗。

1.2 主要試劑

脂多糖(LPS，Sigma-Aldrich)，褪黑素(MT，百靈威科技)，總RNA提取試劑盒(Promega，U.S.)，RIPA裂解液、蘇木精-伊紅(HE)染液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，β-actin、IL-10、TGF-β抗體(沈陽萬類生物科技有限公司)，IL-6、IL-1β、TNF-α抗體(Santa)(北京優(yōu)維寧生物科技有限公司)。

1.3 儀器設(shè)備

3K-15高速低溫離心機(jī)購自德國Sigma公司，Epoch2酶標(biāo)儀購自美國BioTek公司，TanonESP300通用型電泳儀、Tanon5200全自動凝膠成像儀均購自上海天能科技有限公司，F(xiàn)orma(-80 ℃)超低溫冰箱購自美國Thermo Fisher Scientific公司，Beckman225型自動pH計購自美國Beckman公司，高壓蒸汽滅菌器、ZE260微量電子天平均購自杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司，恒溫培養(yǎng)搖床購自上海一恒科技有限公司，玻璃勻漿器購自南通市衛(wèi)寧實驗器材有限公司。

1.4 試驗動物分組及處理

將40只健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為4組，分別為空白組(CON組)、模型組(LPS組)、褪黑素干預(yù)組(LPS+MT組)及褪黑素組(MT組)。CON組大鼠腹腔注射0.5 mL生理鹽水，30 min后再腹腔注射0.5 mL生理鹽水。LPS組大鼠腹腔注射0.5 mL生理鹽水，30 min后再腹腔注射10 mg·kg-1[2]LPS (0.5 mL)。LPS+MT組大鼠腹腔注射10 mg·kg-1MT (0.5 mL)，30 min后再腹腔注射10 mg·kg-1LPS (0.5 mL)。MT組大鼠腹腔注射10 mg·kg-1[14-15]MT (0.5 mL)，30 min后再腹腔注射0.5 mL生理鹽水。

1.5 大鼠行為學(xué)測試

造模4 h后對各組大鼠進(jìn)行曠場試驗，按本實驗室前期曠場試驗方法[16]加以改進(jìn)，進(jìn)行大鼠行為學(xué)測試。應(yīng)用Super Maze軟件記錄并分析3 min內(nèi)大鼠的表現(xiàn)，包括運動軌跡、靜止時間、總路程以及跨格次數(shù)。

1.6 大鼠海馬體系數(shù)測定

用電子天平稱量大鼠體重并記錄，按照解剖結(jié)構(gòu)小心剝離大鼠(n= 7)完整海馬，用電子分析天平稱量海馬質(zhì)量并記錄。整理記錄的數(shù)值并計算海馬體系數(shù)：

海馬體系數(shù)(%)=海馬重/體重×100。

1.7 大鼠海馬HE染色

各試驗組中隨機(jī)選取3只大鼠大腦用于組織病理學(xué)觀察。異氟醚麻醉后，采用頸椎脫臼法處死試驗大鼠，取出大腦，浸入4%多聚甲醛溶液中，4 ℃固定48 h，乙醇梯度脫水，使用二甲苯透明，之后石蠟包埋，切片3～5 μm， HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察腦切片中海馬區(qū)域病理組織變化。

1.8 實時熒光定量PCR檢測Iba-1和CD11b mRNA表達(dá)

各試驗組中隨機(jī)選取3只大鼠取海馬用于mRNA水平檢測。用總RNA提取試劑盒提取總RNA，按試劑盒說明書操作，將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，得到的cDNA用于實時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測Iba-1和CD11b mRNA相對轉(zhuǎn)錄水平。PCR引物見表1，反應(yīng)體系為：含酶混合物5 μL，ROX液0.2 μL，上、下游引物各0.4 μL，cDNA模板1.0 μL，dd H2O 3.0 μL， 總體積10 μL。擴(kuò)增條件為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，35個循環(huán)。mRNA 的相對轉(zhuǎn)錄量采用2-ΔΔCT方法計算，并以β-actin為內(nèi)參基因。

表1 RT-PCR引物序列Table 1 RT-PCR primers sequence

1.9 Western blot法檢測炎性因子蛋白表達(dá)

各試驗組中隨機(jī)選取4只大鼠海馬用于Western blot檢測。稱取50 mg大鼠海馬組織，使用RIPA裂解液提取海馬組織蛋白，向蛋白質(zhì)樣品中比例加入PAGE loading buffer，充分混勻，置于100 ℃沸水煮10 min使蛋白質(zhì)變性。通過制備分離膠和濃縮膠、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育和化學(xué)自發(fā)光等操作對IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-10及TGF-β相關(guān)蛋白表達(dá)量進(jìn)行檢測。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析

利用 GraphPad Prism 7軟件處理分析本試驗獲得的所有數(shù)據(jù)結(jié)果并作圖，采用SPSS 22.0進(jìn)行顯著性分析。結(jié)果采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)”表示，P>0.05表示差異不顯著，P<0.05 表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 MT對LPS導(dǎo)致的大鼠異常行為的影響

曠場試驗結(jié)果如圖1所示，從運動軌跡和運動總路程來看，CON組大鼠活動范圍廣，運動總路程長；而LPS組大鼠活動范圍邊緣化，且運動總路程較CON組極顯著減少(P<0.01)；LPS+MT組與LPS組相比，活動范圍廣，且總路程較LPS顯著增加(P<0.05)；而MT組的運動軌跡和運動總路程與CON組相比均無明顯差異(P>0.05)；從跨格次數(shù)來看，LPS組大鼠與CON組大鼠相比，跨格次數(shù)極顯著減少(P<0.01)；MT+LPS組大鼠與LPS組相比，跨格次數(shù)顯著增多(P<0.05)；MT組大鼠與CON組大鼠相比，跨格次數(shù)無明顯差異(P>0.05)；從曠場中靜止時間來看，LPS組與CON組相比，靜止時間顯著增加(P<0.05)；MT+LPS組與LPS組相比，靜止時間顯著減少(P<0.05)；MT組與CON組相比，靜止時間無明顯差異(P>0.05)。

**表示相應(yīng)LPS組與CON組相比差異極顯著(P<0.01)；*表示相應(yīng)LPS組與CON組相比差異顯著(P<0.05)；#表示相應(yīng)MT+LPS組與LPS組差異顯著(P<0.05)；##表示相應(yīng)MT+LPS組與LPS組差異極顯著(P<0.01)；無標(biāo)注表示相應(yīng)MT組與CON組差異不顯著(P>0.05)。下同** indicates that the corresponding LPS group is extremely significantly different from the CON group (P<0.01); * indicates that the corresponding LPS group is significantly different from the CON group (P<0.05)；# indicates the corresponding MT + LPS group is significantly different from the LPS group (P<0.05); ## indicates the corresponding MT+LPS group is extremely significantly different from the LPS group (P<0.01); No label indicates that the corresponding MT group is not significantly different from the CON group (P>0.05). The same as below圖1 各組大鼠在曠場中運動軌跡、總路程、跨格次數(shù)及靜止時間Fig.1 The movement trajectories, total distance, crossing number and immobility time of rats in the open field

2.2 MT對LPS導(dǎo)致的海馬體系數(shù)變化的影響

由于試驗持續(xù)時間較短，各組大鼠體重變化不明顯，LPS作用于海馬組織時間較短，未見對海馬組織造成實質(zhì)性損傷，所以各組大鼠的海馬體系數(shù)之間的差異不明顯，具體結(jié)果見圖2。

圖2 各組大鼠海馬體系數(shù)Fig.2 Hippocampus coefficient of rats in each group

2.3 MT對LPS導(dǎo)致的大鼠海馬組織損傷的影響

對海馬組織進(jìn)行病理組織學(xué)觀察(圖3A)發(fā)現(xiàn)，CON組與MT組海馬組織神經(jīng)細(xì)胞排列致密整齊，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞核清晰可見，未見明顯病變。LPS組海馬神經(jīng)元排列不整，細(xì)胞間隙增大(黑色箭頭所示)，細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清晰(黃色箭頭所示)，核固縮、深染，神經(jīng)細(xì)胞變性(紅色箭頭所示)，膠質(zhì)細(xì)胞浸潤(藍(lán)色箭頭所示)。LPS+MT組海馬神經(jīng)元排列相對規(guī)律整齊，細(xì)胞形態(tài)較正常，細(xì)胞間隙稍微增大，變性細(xì)胞較少。但各組海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量并無顯著變化(圖3B)。

CON組和MT組海馬組織神經(jīng)細(xì)胞排列緊密整齊，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞核清晰可見，未見明顯病變。LPS組神經(jīng)細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞間隙增大(如黑色箭頭所示)，細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清晰(如黃色箭頭所示)，細(xì)胞核固縮深染，神經(jīng)細(xì)胞變性(如紅色箭頭所示)，并伴有膠質(zhì)細(xì)胞浸潤(如藍(lán)色箭頭所示)。LPS+MT組海馬神經(jīng)元排列相對規(guī)律整齊，細(xì)胞形態(tài)較正常，細(xì)胞間隙稍微增大，變性細(xì)胞較少(如紅色箭頭所示)The hippocampal nerve cells of CON group and MT group were arranged in tight and neat arrangement, with intact cell structure, clear nucleus and no obvious lesions. In the LPS group, the nerve cells were disordered, the cell space was enlarged (as shown in the black arrows), the cell structure was unclear (as shown in the yellow arrows), the nuclei were pyknosis and deep stained, the nerve cells degenerated (as shown in the red arrow), and glial cell infiltrated (as shown in the blue arrow). In the LPS+MT group, the nerve cells were relative regular and neat, cells morphology were normal, intercellular space slightly enlarged, less cells degenerated (as shown in the red arrows)圖3 MT對各組大鼠海馬CA1區(qū)HE染色切片(A，400×)及神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量(B)Fig.3 HE staining sections(A,400×) and the number of nerve cells of hippocampal CA1 area of rats in each group (B)

2.4 MT對LPS誘導(dǎo)大鼠海馬Iba-1和CD11b mRNA表達(dá)的影響

RT-PCR檢測結(jié)果顯示(圖4)，與CON組相比，LPS組海馬組織Iba-1和CD11b mRNA表達(dá)量極顯著升高(P<0.01)，LPS+MT組與LPS組mRNA 表達(dá)量差異極顯著降低(P<0.01)，MT組與CON組相比，mRNA表達(dá)量無明顯差異(P>0.05)。

圖4 各組Iba-1和CD11b mRNA表達(dá)情況Fig.4 Iba-1 and CD11b mRNA expression in each group

2.5 MT對LPS導(dǎo)致大鼠海馬IL-1β、TNF-α、IL-6、 IL-10及TGF-β蛋白表達(dá)的影響

Weston blot結(jié)果表明(圖5)，與CON組相比，LPS組促炎性因子IL-1β、TNF-α及IL-6蛋白表達(dá)極顯著增加(P<0.01)；LPS+MT組與LPS組相比，以上促炎因子蛋白表達(dá)均極顯著減少(P<0.01)；而MT組與CON組相比，以上促炎性因子蛋白表達(dá)均無明顯差異(P>0.05)；與CON組相比，LPS組抗炎性因子IL-10和TGF-β的蛋白表達(dá)極顯著減少(P<0.01)，LPS+MT組與LPS組相比，以上抗炎因子蛋白表達(dá)極顯著增加(P<0.01)，MT組與CON組相比，以上抗炎因子蛋白表達(dá)差異不顯著(P>0.05)。

圖5 各組大鼠海馬中促炎因子IL-1β、TNF-α和IL-6及抗炎因子IL-10和TGF-β蛋白表達(dá)Fig.5 The protein expression of hippocampal pro-inflammatory factors IL-1β, TNF-α and IL-6, as well as anti-inflammatory factors IL-10 and TGF-β in each group

3 討 論

LPS是膿毒血癥的主要的致病因素之一，可導(dǎo)致海馬損傷，主要表現(xiàn)為認(rèn)知障礙及行為異常[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，對大鼠腹腔注射LPS后，大鼠的自主探索行為減少及運動能力降低。海馬組織病理切片也觀察到，海馬神經(jīng)細(xì)胞排列松散，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清晰，核固縮、深染，神經(jīng)細(xì)胞變性，膠質(zhì)細(xì)胞浸潤等現(xiàn)象。因此，LPS致大鼠海馬炎性損傷模型建立成功。有研究表明，小膠質(zhì)細(xì)胞過度激活是神經(jīng)炎癥的標(biāo)志[18-20]。當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)感受到刺激后，小膠質(zhì)細(xì)胞能快速增殖活化，在吞噬壞死的細(xì)胞組織碎片的同時，也會釋放大量IL-1β、IL-6和TNF-α等促炎因子，從而介導(dǎo)炎癥的發(fā)生[21-23]。在本研究中，大鼠注射LPS后，小膠質(zhì)細(xì)胞激活標(biāo)志物Iba-1和CD11b的mRNA表達(dá)顯著增加，促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白表達(dá)顯著增加，抗炎因子IL-10和TGF-β蛋白表達(dá)顯著減少。以上結(jié)果表明，LPS激活海馬小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)而調(diào)控炎性因子的釋放，誘發(fā)海馬炎性反應(yīng)。

MT是由松果體合成并分泌入血及腦脊液中，以調(diào)控睡眠等生物周期節(jié)律的一種胺類激素[24-27]。研究發(fā)現(xiàn)，MT可通過減少IL-1β和IL-6的釋放改善各種因素如手術(shù)創(chuàng)傷、鋁中毒、甲基苯丙胺中毒以及老齡等導(dǎo)致的腦損傷[7,28-29]。在本研究中，LPS+MT組大鼠在曠場中的自主探索能力和運動能力較LPS組增強(qiáng)，海馬組織病變較LPS組明顯減輕，表明MT改善了LPS導(dǎo)致的海馬損傷。在體外試驗中，MT可抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞系BV-2的活化，且對LPS導(dǎo)致的神經(jīng)干細(xì)胞的損傷有明顯緩解作用[30-31]。此外，有研究報道，MT可降低LPS誘導(dǎo)的小鼠脾臟炎性因子IL-1和TNF-ɑ的分泌，同時增加抗炎性因子IL-10的分泌[32]。另有研究表明，在小鼠乳腺組織中MT可抑制LPS誘導(dǎo)的TNF-ɑ、IL-1β和IL-6的生成[33]。在本研究中，LPS+MT組大鼠海馬中Iba-1和CD11b mRNA表達(dá)較LPS組顯著下降，IL-1β、TNF-α及IL-6蛋白表達(dá)較LPS組顯著下降，而IL-10和TGF-β蛋白表達(dá)較LPS組顯著增加。以上結(jié)果表明，MT可抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活，減少促炎因子釋放，促進(jìn)抗炎因子生成，進(jìn)而改善LPS造成的大鼠海馬炎性損傷。然而，LPS只是膿毒血癥的主要致病因素之一，本研究模擬發(fā)生膿毒血癥時LPS導(dǎo)致的海馬炎性損傷并探究MT對其保護(hù)作用及機(jī)制。但膿毒血癥的主要致病因素還包括細(xì)菌增殖和擴(kuò)散等。因此，MT是否對除LPS以外的其他致病因素導(dǎo)致的膿毒性腦病起保護(hù)作用及其保護(hù)作用機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

LPS可激活小膠質(zhì)細(xì)胞，使其釋放促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α導(dǎo)致海馬炎性損傷，進(jìn)而導(dǎo)致動物行為異常及認(rèn)知功能障礙。MT可抑制LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞活化，減少促炎因子的釋放，同時增加抗炎因子的生成，進(jìn)而改善LPS造成的大鼠海馬炎性損傷。