周婷婷，李 媛，任立松，侯 鳳，賀 筍，張 飛

（天康生物股份有限公司，新疆 烏魯木齊830010）

豬鏈球菌病（swineStreptococcosis）是由多種不同菌群的鏈球菌感染引起的一類傳染病的總稱[1]，以敗血癥、淋巴膿腫、心內(nèi)膜炎、多發(fā)性漿膜炎等為典型特征，也可引起人的化膿性腦膜炎、敗血癥、關(guān)節(jié)炎，主要表現(xiàn)為發(fā)熱和毒血癥狀，導(dǎo)致器官衰竭而死亡，是一種人畜共患病。該病呈世界范圍內(nèi)分布，美國(guó)、俄羅斯、法國(guó)、印度、丹麥、荷蘭、加拿大、澳大利亞、新西蘭等國(guó)均有報(bào)道鏈球菌病的疫情[2-3]，國(guó)內(nèi)在20世紀(jì)70至80年代后期發(fā)病嚴(yán)重，在許多地區(qū)呈地方性流行、大面積暴發(fā)。近些年，河北、江蘇、浙江、四川均發(fā)生人感染豬鏈球菌病例[4-9]。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織將該病列為B類疫病，我國(guó)將其列為二類疫病[10]。該病給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，并對(duì)相關(guān)從業(yè)人員的生命安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅。

豬鏈球菌（Streptococcous suis，S.suis）根據(jù)莢膜多糖抗原不同分為35個(gè)血清型，其中能引起人畜共患的致病性鏈球菌血清型主要為1、2、7、9型。在國(guó)內(nèi)發(fā)病豬群中，以2型豬鏈球菌感染報(bào)道居多，對(duì)9型豬鏈球菌感染報(bào)道較少。本試驗(yàn)對(duì)新疆某規(guī)?；i場(chǎng)病豬的淋巴結(jié)、肺臟病料分離株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，開展藥敏試驗(yàn)以此選取針對(duì)流行菌株的敏感藥物，為明確豬場(chǎng)豬鏈球菌的血清型、研制針對(duì)性疫苗及臨床快速診斷等提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料采集

病料采自新疆某豬場(chǎng)臨床發(fā)病豬只淋巴結(jié)、肺臟等臟器。

1.2 試驗(yàn)試劑

胰蛋白大豆肉湯培養(yǎng)基（胰蛋白胨、大豆蛋白胨、氯化鈉、pH值7.2）由美國(guó)BD公司生產(chǎn)；5%綿羊血液營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基按常規(guī)方法配制；Taq DNA聚合酶、電泳凝膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司；DNA Marker DL2000、PCR Mix、dNTP、Taq PCR Buffe購(gòu)自TaKaRa公司；犢牛血清購(gòu)自杭州四季青有限公司；鏈球菌生化鑒定試劑盒、藥敏紙片購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司；革蘭氏染色試劑盒購(gòu)自索萊寶公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 病原菌的分離純化

將病變肺臟、淋巴結(jié)組織用火焰灼燒表面做無菌處理后剪取內(nèi)部組織，同時(shí)劃線接種于含5%牛血清的胰蛋白大豆瓊脂平皿與綿羊血液瓊脂平皿中，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，挑取呈灰白色、濕潤(rùn)、邊緣整齊的圓形單菌落進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢及純化，選取形態(tài)特征較為統(tǒng)一的優(yōu)勢(shì)菌落進(jìn)行增菌培養(yǎng)。

1.4 生化特性鑒定

取分離純化的細(xì)菌純培養(yǎng)物接種于葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、七葉尿素、硫化氫、硝酸鹽、蔗糖、精氨酸等細(xì)菌微量生化反應(yīng)管中，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，生化反應(yīng)根據(jù)鏈球菌生化編碼鑒定手冊(cè)（GYZ—12St）判定。

1.5 16S rDNA序列測(cè)定及分析

16S rDNA的擴(kuò)增引物為通用引物1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，27F：5'-AGAGTTTGATCC TGGCTCAG-3'。按常規(guī)方法提取菌株的基因組DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。使用DNAStar對(duì)測(cè)序推導(dǎo)得到的16S rDNA序列與GenBank已發(fā)表的國(guó)外參考菌株的16S rDNA序列進(jìn)行同源性比較和遺傳進(jìn)化的分析，同時(shí)采用MegAlign和鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹見表1。

表1 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹參考菌株Tab.1 Reference strains for constructing phylogenetic trees

1.6 豬鏈球菌的PCR分型檢測(cè)

根據(jù)豬鏈球菌不同血清型莢膜多糖cps基因的特異性設(shè)計(jì)1、2、7、9型豬鏈球菌的分型引物，引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物具體信息見表2。

以提取的分離菌株基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系：PCR Mix 0.4μL、10×Taq PCR Buffer 5μL、dNTP（2.5 mmol/L）8μL、DNA模板1.5μL、上下游引物各1μL、加ddH2O至終體積50μL。PCR反應(yīng)條件：94℃5 min；94℃30 s，56℃50 s，72℃90 s，30個(gè)循環(huán)；72℃5 min。取PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.7 小鼠致病性試驗(yàn)

將分離菌株接種于含5%牛血清的胰蛋白大豆肉湯培養(yǎng)基37℃過夜培養(yǎng)，腹腔注射法對(duì)健康昆明小鼠進(jìn)行攻擊，攻擊劑量約為5×108CFU/mL，對(duì)照組小鼠注射等量生理鹽水，每組10只小鼠，觀察14 d內(nèi)小鼠的死亡情況。及時(shí)剖檢死亡小鼠，無菌采集肝臟、肺臟等病變組織并鏡檢。

1.8 藥敏試驗(yàn)

表2 引物信息Tab.2 Primer information

采用標(biāo)準(zhǔn)K-B紙片擴(kuò)散法，將培養(yǎng)16～18 h生長(zhǎng)良好的100μL分離株菌液均勻涂布于含5%牛血清的胰蛋白大豆瓊脂平皿表面，37℃培養(yǎng)24 h后檢測(cè)分離株對(duì)林可霉素、多西環(huán)素、青霉素鈉、環(huán)丙沙星、頭孢噻呋、氟苯尼考、替米考星、氧氟沙星、磺胺嘧啶鈉、硫酸黏菌素、氨芐西林鈉、四環(huán)素、慶大霉素、阿莫西林14種抗生素的敏感性。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌株的形態(tài)特征（見圖1）

圖1 分離菌株的形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of isolated strains

由圖1可知，該分離菌株在綿羊血液平皿上培養(yǎng)24 h后生長(zhǎng)良好，形成灰白色、半透明、邊緣整齊、呈β溶血的光滑型菌落（圖1a）；革蘭氏染色后鏡檢可觀察到革蘭氏陽性、2個(gè)到10個(gè)不等長(zhǎng)鏈短鏈排列的球菌（圖1b）。

2.2 分離菌生化試驗(yàn)結(jié)果（見表3）

由表3可知，該分離株能夠發(fā)酵葡萄糖、乳糖、蔗糖，精氨酸、七葉苷為陽性，甘梨醇、山梨醇、尿素、硫化氫、硝酸鹽、V-P為陰性，符合豬鏈球菌的生化特性。

表3 分離菌生化試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Biochemical test results of isolates

2.3 16S rDNA序列同源性分析（見圖2）

由圖2可知，新疆分離株XJS9與豬鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 43765（GenBank登錄號(hào)：NR_115737.1）同源性為100%。

圖2 分離株XJS9 16S rDNA序列同源性分析Fig.2 Homology analysis of 16S rDNA sequence of isolate XJS9

2.4 16S rDNA序列進(jìn)化樹（見圖3）

由圖3可知，所比較的源于不同菌株可以分為4個(gè)明顯的基因群，分離株與4株豬鏈球菌親緣關(guān)系較近，屬于同一個(gè)進(jìn)化分支Ⅰ群。

圖3 分離菌16S rDNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of 16S rDNA gene of isolate

2.5 豬鏈球菌的分型鑒定（見圖4）

由圖4可知，以豬鏈球菌的血清型特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果豬鏈球菌1、2、7型均未擴(kuò)增出目的條帶，但是豬鏈球菌9型擴(kuò)增出約390 bp大小的特異性條帶，表明該分離株為9型豬鏈球菌。

圖4 臨床分離菌株9型PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 The results of PCR amplification of type 9 clinical isolates

2.6 小鼠致病性試驗(yàn)

將分離菌株接種于含5%牛血清的胰蛋白大豆肉湯培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)24 h，腹腔攻擊小鼠24 h后，小鼠表現(xiàn)被毛凌亂、畏冷、食欲廢絕、呼吸急促等癥狀，后期眼內(nèi)出現(xiàn)大量黃白色分泌物。部分小鼠在接種2 d內(nèi)出現(xiàn)死亡。及時(shí)剖檢死亡小鼠，脾臟腫大充血、出血，肺臟組織呈現(xiàn)灰白色腫脹。將組織的肺臟、肝臟用生理鹽水研磨稀釋后革蘭氏染色鏡檢結(jié)果顯示與豬鏈球菌形態(tài)特征一致。對(duì)照組小鼠表現(xiàn)正常。

2.7 藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果（見表4）

表4 藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Results of drug sensitivity test

由表4可知，該分離菌株對(duì)克林霉素、多西環(huán)素、青霉素、環(huán)丙沙星、頭孢噻呋、氟苯尼考、替米考星、氧氟沙星、磺胺嘧啶鈉、硫酸黏菌素、氨芐西林11種藥物敏感，對(duì)四環(huán)素、慶大霉素、阿莫西林表現(xiàn)耐藥。

3 討論

豬鏈球菌病是一種世界性分布的人畜共患傳染病[11]。近年來，隨著養(yǎng)豬業(yè)的快速規(guī)模化發(fā)展，豬鏈球菌病已給豬養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。豬鏈球菌2型是主要的流行血清型。但近年來9型豬鏈球菌的流行呈上升趨勢(shì)，在我國(guó)各省市均有不同程度的發(fā)生和流行[12-13]。目前，有關(guān)新疆地區(qū)9型豬鏈球菌的分子流行情況的資料很少。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，新疆地區(qū)分離株與豬鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC43765同源性為100%。16S rDNA的序列信息，如今已經(jīng)廣泛運(yùn)用于菌種鑒定和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究[14-15]。根據(jù)不同屬細(xì)菌16S rDNA基因同源性為70%～90%，而同一種內(nèi)不同株間基因同源性＞99%[16]，從分子水平確定該菌株為豬鏈球菌，且該株鏈球菌進(jìn)化穩(wěn)定，未發(fā)生明顯變異。為進(jìn)一步確定分離株的血清型，設(shè)計(jì)鑒別豬鏈球菌1、2、7、9型的特異性引物，結(jié)果分離株擴(kuò)增出約390 bp的預(yù)期片段，確定為9型豬鏈球菌。

藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，該分離菌株對(duì)克林霉素、多西環(huán)素、青霉素、環(huán)丙沙星、頭孢噻呋、氟苯尼考、替米考星、氧氟沙星、磺胺嘧啶鈉、硫酸黏菌素、氨芐西林11種藥物敏感，對(duì)四環(huán)素（四環(huán)素類）、慶大霉素（氨基糖苷類）、阿莫西林（β-內(nèi)酰胺類）表現(xiàn)耐藥。Marie等[17]的研究顯示，1996～2000年分離的135株豬源和人源鏈球菌的藥敏結(jié)果顯示對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素敏感。張振江等[18]分離1株9型豬鏈球菌，檢測(cè)出tetO（四環(huán)素類）、aph-（3）-lia（氨基糖苷類）、SulⅢ（磺胺類）耐藥基因，與該菌株的耐藥譜基本一致。徐引弟等[19]的研究表明，35株2型豬鏈球菌河南分離株中對(duì)慶大霉素、四環(huán)素、鏈霉素的耐藥情況嚴(yán)重。

目前，豬鏈球菌病是養(yǎng)殖業(yè)發(fā)病率較高的疾病之一，豬體內(nèi)豬鏈球菌的帶菌率約為20%～40%，在條件適宜的情況下細(xì)菌會(huì)發(fā)生變異產(chǎn)生毒力，誘因?yàn)橥饨鐪囟鹊淖兓?、飼料的更換、豬群的數(shù)量變化、豬舍的清潔衛(wèi)生等。發(fā)病后快速傳播，因此加強(qiáng)對(duì)豬鏈球菌病的防治，是降低該類疾病發(fā)生和傳播的關(guān)鍵途徑之一。本研究藥敏試驗(yàn)結(jié)果提示，加強(qiáng)對(duì)養(yǎng)豬場(chǎng)的病原的分離與耐藥情況進(jìn)行檢測(cè)，確定有效的藥物進(jìn)行治療，獲得最佳治療效果，快速有效的控制豬場(chǎng)病情，但是長(zhǎng)時(shí)間大量使用抗生會(huì)造成豬場(chǎng)細(xì)菌耐藥，因此加速疫苗研發(fā)是對(duì)抗細(xì)菌耐藥的重要性舉措。明確當(dāng)?shù)亓餍械那v膜血清型，可以為有效防止豬鏈球菌病提供新思路，也為豬鏈球菌疫苗的研發(fā)提供參考。

4 結(jié)論

本研究從新疆某豬場(chǎng)病豬組織中分離1株疑似豬鏈球菌，通過細(xì)菌的分離鑒定、形態(tài)學(xué)觀察、生化試驗(yàn)等試驗(yàn)分析，確定該分離株為9型豬鏈球菌，與豬鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC43765同源性為100%。該鏈球菌的分離鑒定為該豬場(chǎng)的豬鏈球菌病的防控提供了參考。