周迎春 華向美 李單單

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在國家相關監(jiān)管部門的重點監(jiān)管下，“瘦肉精”違禁添加到動物養(yǎng)殖過程中的情況得到了有效控制，但是在經(jīng)濟利益的驅(qū)動下，仍有不法養(yǎng)殖者在動物養(yǎng)殖過程中非法使用β-受體激動劑[1]，特別是在監(jiān)管難度較大的牛、羊養(yǎng)殖屠宰銷售環(huán)節(jié)，β-受體激動劑的使用現(xiàn)象較嚴重[2]。2017年，“315晚會”中對違法使用“瘦肉精”進行了點名報道。我國農(nóng)業(yè)部在《2017年農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全專項整治方案》中提出了“瘦肉精”專項整治行動[3]。2021年央視“315晚會”曝光青縣“瘦肉精”羊肉問題，再次將β-受體激動劑推向了輿論高潮，引發(fā)人們對食品安全的恐慌。除了一些已知的β-激動劑如CLB、RAC、SAL的濫用，新合成的β-受體激動劑化合物，雖然具有不同的結構，但是仍表現(xiàn)出營養(yǎng)再分配活性，如齊帕特羅、西布特羅、馬布特羅等。β-受體激動劑的測定，需要科學準確的檢測技術作為保障。熟悉β-受體激動劑的性質(zhì)及其檢測時的關鍵點是建立相應檢測方法的基礎，也是實現(xiàn)有效監(jiān)管的關鍵所在。

1 β-受體激動劑的性質(zhì)

β-受體激動劑俗稱“瘦肉精”，它的基本化學結構為苯乙醇胺，具有典型芳香基團、β-羥基和脂肪族氮的一類合成化合物，其功能與腎上腺素和去甲腎上腺素功能類似。β-受體激動劑包括β1-激動劑、β2-激動劑和β3-激動劑。根據(jù)苯環(huán)上取代基的差異，β-受體激動劑又可分為苯胺型、苯酚型、鹵取代型3種類型。當苯環(huán)上的取代基中具有氨基時，為苯胺型，例如CLB；當苯環(huán)上的取代基具有羥基時，為苯酚型，例如SAL和RAC。由于酚羥基具有弱酸性，因此β-受體激動劑在負離子模式下也具有一定響應，但它們正離子模式下的響應更好。當苯環(huán)上的取代基僅有鹵元素時，為鹵取代型，例如馬布特羅。

β-受體激動劑化學性質(zhì)穩(wěn)定，加熱到172℃時才分解，因此，一般燒煮加熱方法不能將其破壞。β-激動劑的物理和化學性質(zhì)相似，大多數(shù)β-激動劑為白色結晶顆?；蚍勰瑹o臭且苦[4]。SAL，分子式C13H21NO3，分子量239.3100，呈粉末狀，白色、基本無味，在乙醇中可快速溶解，微溶于水，熔點為154～158℃[5]。CLB，分子式C12H18Cl2N2O，分子量277.1000，為白色結晶固體，無臭，溶于水、乙醇，微溶于丙酮[6]。CLB經(jīng)人體吸收后，可導致血液中K+含量下降，從而使機體出現(xiàn)心律失常、急性中毒現(xiàn)象，搶救不及時甚至會引起死亡[7]。RAC，分子式C18H23NO3，分子量301.3801，多以鹽酸鹽的形式存在，在丙酮中稍溶，可溶于水、乙醇[8]。西馬特羅(Cimaterol)，分子式C12H17N3O，分子量219.2800。齊帕特羅(Zilpaterol)，分子式C14H19N3O2，分子量261.3200。馬布特羅(Mabuterol)，分子式C13H18ClF3N2O，分子量310.7500。

2 β-受體激動劑的作用及危害

β-受體激動劑在臨床醫(yī)學中一般用作于治療哮喘藥物，該類物質(zhì)以超過治療劑量5～10倍的用量用于家畜飼養(yǎng)時，具有顯著的“營養(yǎng)再分配效應”，可促進動物體蛋白質(zhì)沉積、脂肪分解并有效抑制脂肪沉積[9]，從而顯著降低脂肪含量、促進肌肉纖維的生長[10]、提高瘦肉率[11]和飼料轉(zhuǎn)化率[12]，但是β-激動劑是一種非法的飼料添加劑。

β-受體激動劑化學性質(zhì)穩(wěn)定，在動物組織中不易被分解，因此可通過食物鏈在人體內(nèi)逐漸積累，對人體健康有害[13]：可導致急性中毒，引起肌肉振顫、心慌、戰(zhàn)栗、頭暈、頭疼、惡心、嘔吐、心跳加速甚至心臟驟停致昏迷死亡等癥狀[14，15]，會導致染色體畸變的可能，誘發(fā)惡性腫瘤，特別是對高血壓、心臟病、青光眼、糖尿病、甲亢和前列腺肥大等疾病患者危害更大，嚴重的可導致死亡[16]。

3 各國對β-受體激動劑的禁用情況

為了食品安全，1996年，歐盟96/22/EC令禁止將β-受體激動劑用于食用動物養(yǎng)殖中[17]；中國農(nóng)業(yè)部1997年發(fā)文禁止將“瘦肉精”使用在飼料和畜牧生產(chǎn)中；自2009年12月9日起，我國商務部禁止進出口萊克多巴胺(Ractopamine，RAC)與克倫特羅(Clenbuterol，CLB)；農(nóng)業(yè)部第176號[18]、第193號[19]和235號[20]公告明確將CLB、沙丁胺醇(Salbutamol，SAL)、RAC、西馬特羅及其鹽類、酯類列為可食品動物禁用的獸藥化合物清單，并規(guī)定在動物性食品中不得檢出該類藥物；我國農(nóng)業(yè)部公告第1519號禁止多種β-受體激動劑在動物飼料和飲用水中使用[21]；2011年國家食品安全委員會規(guī)定了16種禁用β-受體激動劑的品種[22]。我國《農(nóng)業(yè)部辦公廳關于印發(fā)茄果類蔬菜等58種無公害農(nóng)產(chǎn)品檢測目錄的通知》(農(nóng)辦質(zhì)[2015]4號)中規(guī)定牲畜的可食組織中的CLB、RAC和SAL是禁止檢出的。

由于肝臟、腎臟中的β-受體激動劑殘留量較大且中國、俄羅斯和歐盟對內(nèi)臟的攝入量相對較多，因此他們均出臺了一系列法律法規(guī)，禁止在飼料中添加SAL、CLB、RAC等β-受體激動劑[23]。美國、加拿大、日本等國家規(guī)定了殘留標準，但并沒有禁止使用“瘦肉精”[24，25]，包括美國在內(nèi)的其他22個國家，將RAC批準用于豬、牛和火雞的動物養(yǎng)殖，此外齊帕特羅被批準用于南非和墨西哥的動物養(yǎng)殖[26]。根據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界食品添加劑聯(lián)合專家委員會(JECFA)規(guī)定，RAC在肌肉、肝臟、腎臟和脂肪中的最大殘留限量(MRL)分別為10、40、90和10μg/kg[27]。世界衛(wèi)生組織(WTO)和美國食品藥品管理局(FDA)以及國際食品法典委員會(CAC)推薦CLB的MRL為：脂肪和肌肉中為0.2μg/kg。此外，歐洲立法提出了馬和牛肝臟中CLB的MRL為0.5μg/kg[28]，同樣，中國國家標準GB/T 5009.192-2003動物性食品中克倫特羅檢測標準中檢測限(LOD)也定為0.5μg/kg[29]。日本與國際食品法典委員會(CAC)推薦的豬、牛脂肪和肌肉中RAC的MRL相同，均為10μg/kg，而澳大利亞對豬、牛脂肪和肌肉中RAC的MRL規(guī)定分別為：200μg/kg、50μg/kg[30]。此外，中國和歐盟普遍禁止所有化合物用作生長促進劑，并發(fā)布了大量法規(guī)來監(jiān)測和控制非法使用β-激動劑作為生長促進劑[31]?？梢姡贫茖W準確的β-激動劑殘留量檢測方法也是應對國際貿(mào)易壁壘的有效措施。

4 β-受體激動劑殘留量測定時的關鍵點

4.1 酶解提取

β-受體激動劑的芳香環(huán)結構上均有烷羥基或羥基，在動物體內(nèi)的代謝過程中，它們大部分都與硫酸或葡萄糖醛酸發(fā)生作用，生成β-葡萄糖醛酸結合物和氧化產(chǎn)物[32]，這些代謝產(chǎn)物不易溶于有機試劑，但易溶于水[33]，因此樣品的前處理一般采用先水解使目標化合物游離出來，再提取富集目標化合物。水解常采用酶水解和酸水解2種。酸水解以使用無機酸為主，但無機酸的作用強度往往較大，不易準確控制反應過程。β-葡萄糖醛苷酶進行水解處理過程中，一般不會破壞待測物β-受體激動劑的結構，重現(xiàn)性好，有利于提高方法的回收率[34]。

β-葡萄糖醛酸甙酶/芳香硫酸酯酶酶解有助于充分釋放組織中的β-受體激動劑，提高檢測的準確性。苯胺型β-受體激動劑的結構軛合反應率及蛋白結合率較低，如CLB。苯酚型β-受體激動劑的軛合代謝過程較強，苯環(huán)上羥基是結合的位點，形成葡萄糖醛苷代謝物，如SAL在組織和排泄物中主要以硫酸軛合物、葡萄糖醛酸軛化物形式存在。RAC在組織和排泄物中也主要以葡萄糖醛酸軛化物形式存在。在酸性環(huán)境下，苯胺型β-受體激動劑很容易由結合態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x態(tài)，所以只測定CLB時，可以省去酶解步驟；SAL和RAC等苯酚型β-受體激動劑軛合代謝過程較強與蛋白結合率高，所以這類β-受體激動劑殘留量測定時是需要酶解的。石靜飛[35](2014)在前期研究基礎上優(yōu)化檢測方法，利用β-葡萄糖醛酸酶酶解樣品，酶解液經(jīng)5%氨水乙酸乙酯超聲提取，通過MCX固相萃取柱凈化，從而建立了一種沙丁胺醇、齊帕特羅、萊克多巴胺、克侖特羅、苯乙醇胺A共計5種β-受體激動劑殘留量的檢測方法，測定對象主要有豬和山羊的肝臟、肌肉、脂肪、肺臟、大小腸、尿液、糞便和毛發(fā)等11種組織，該方法能夠滿足確證方法學要求。該研究表明，脂肪組織中SAL不酶解會顯著影響測定結果。

目前動物源性食品中β-受體激動劑檢測標準主要有GB/T 21313-2007、GB/T 22286-2008、SN/T 1924-2011及農(nóng)業(yè)部1025號公告-18-2008，以上4個標準均采用37℃下避光酶解16h的方式把結合態(tài)的β-受體激動劑釋放出來。有研究表明：40℃避光水浴酶解2h后，測得CLB、SAL、RAC的回收率、提取率、和精密度也均能滿足實驗要求，可見通過優(yōu)化酶解溫度、酶解時間，可以有效縮短實驗室前處理時間，提高了檢測效率[36]。

樣品中的基質(zhì)成分可以增強或抑制被分析物的響應，高效的樣品制備可在一定程度上減弱基質(zhì)效應。同位素內(nèi)標使用簡便，可有效提高回收率和檢測準確度。常用的同位素內(nèi)標包括氘代同位素內(nèi)標和碳同位素內(nèi)標，β-受體激動劑殘留量檢測時一般用氘代同位素內(nèi)標。

4.2 凈化和濃縮

適當?shù)臉悠非疤幚砜蓽p少干擾和避免可能的基質(zhì)效應[37]。β-激動劑在游離狀態(tài)下可溶于大多數(shù)有機極性溶劑和弱酸性或弱堿性的無機溶劑中[38]。鹽酸CLB為強極性物質(zhì)，易溶于甲醇、乙醇和水，微溶于丙酮，不溶于乙醚。這些鹽不具有非極性結構，因此不溶于疏水溶液，其在疏水溶液中的不溶性可用于提取純物質(zhì)[39]。正己烷作為疏水溶劑，去除脂肪方便、快捷，因此采用正己烷對β-受體激動劑提取液進行除脂。

眾所周知，樣品前處理是痕量殘留特別是非法藥品殘留分析中的一個重要步驟。由于實際樣品中目標分析物的微量濃度和食品基質(zhì)的復雜性[40]，食用脂肪中β-激動劑藥物的測定是一項具有挑戰(zhàn)性的任務。液液萃取，固相萃取(SPE)、微萃取和分子印跡聚合物萃取或上述樣品制備方法的集成程序，用于對復雜樣品的清理，以減少樣品基質(zhì)干擾[41]，具有重現(xiàn)性好、回收高等優(yōu)勢[42]。MCX小柱可有效吸附混合型陽離子以及堿性物質(zhì)，而MAX小柱對混合型陰離子以及酸性物質(zhì)具有更高的吸附力[43]，因此，可選用MCX固相萃取小柱對樣液進行凈化。

洗脫階段是利用MCX固相萃取小柱凈化的關鍵步驟，一般情況下β-受體激動劑多使用氨化有機溶劑進行洗脫。由于CLB、SAL、RAC等β-受體激動劑的分子結構中都存在氨基和羥基，屬于酸堿兩性基團，因此在選擇洗脫液時，常用氨化甲醇或用異丙醇等帶羥基的試劑，如氨化甲醇、氨化乙酸乙酯等。

真空水浴抽干耗時較長，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)較氮吹耗時短，但易損失、純化程度不高[35]，因此采用氮吹進行濃縮更有利于β-受體激動劑殘留量檢測的準確性。

4.3 儀器條件

基于HPLC、GC-MS、LC-MS或LC-MS/MS、毛細管電泳電化學檢測和免疫分析法(EIA)的多種分析方法均可用于檢測β-激動劑。在這些方法中，LC-MS/MS方法被認為是目前檢測食品中多種獸藥最合適的技術，對定量測定的靈敏度和選擇性最高，提供了明確的識別和可靠的確認，已發(fā)展成為主要的分析方法[44]。

動物體內(nèi)β-激動劑及其產(chǎn)品檢測的確證方法主要采用氣相色譜質(zhì)譜(GC-MS)和液相色譜質(zhì)譜(LC-MS)或串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)。在確認目的的框架內(nèi)，質(zhì)譜法是歐洲立法考慮到的唯一分析技術。GC-MS可用于β-激動劑的定量和定性分析，但由于β-激動劑的極性強，衍生過程復雜，使用液相色譜(LC)串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)已被公認為β-激動劑的檢測技術。LC-MS/MS結合了LC的分析分離功能以及MS的鑒定及解析結構[45]，有著準確度高、專屬性好、精密度高、靈敏度高等明顯優(yōu)勢[46]。

迄今為止，已有大量基于LC-MS/MS的分析方法用于檢測不同樣品基質(zhì)中的β-激動劑[27]。如現(xiàn)行標準SN/T 4817-2017中就是采用液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法對進出口食用動物中CLB、SAL、RAC殘留量的測定[47]。LC-MS/MS分析中常用的質(zhì)譜離子源是電噴霧電離(ESI)和大氣壓化學電離(APCI)，APCI適合分析中等極性及弱極性的化合物，ESI用于大分子或極性的化合物，β-受體激動劑屬于強極性化合物，因此本標準采用了ESI源作為離子源進行檢測[48]。依據(jù)β-受體激動劑屬于堿性物質(zhì)，選用正離子模式進行分析測定。

5 小結

β-受體激動劑作為一類物質(zhì)，具有相似的結構和性質(zhì)，在實際檢測中，將β-受體激動劑從樣品組織中有效游離出來，實現(xiàn)β-受體激動劑的高效富集及凈化，保證儀器檢測的準確性是β-受體激動劑殘留量測定時的關鍵步驟，決定著檢測結果的精準性。