文曉霞，白光劍，李韜，馬一凡，鄒偉*

1(四川輕化工大學(xué) 生物工程學(xué)院，四川 宜賓，644005)2(濃香型白酒資源微生物與大數(shù)據(jù)實(shí)驗(yàn)室，四川 宜賓，644005)

水稻秸稈是世界三大農(nóng)作物秸稈之一，主要成分是木質(zhì)纖維素，占比接近50%[1-2]，擁有巨大的潛在價(jià)值。酶解糖化秸稈用于發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)已成為世界各國重點(diǎn)研發(fā)的熱點(diǎn)之一。眾多研究表明，纖維素酶的產(chǎn)酶條件和酶的作用條件不在一個(gè)范圍內(nèi)，因此發(fā)酵和產(chǎn)酶不能最大化進(jìn)行一直是一個(gè)困擾木質(zhì)纖維素資源化利用的難題。為了解決這個(gè)問題，工業(yè)上最常用的方法是纖維素酶直接糖化[3]，但是糖化成本很高；其次是同步發(fā)酵糖化[4]，其受制于微生物的限制，發(fā)酵產(chǎn)物單一，而且不能得到應(yīng)用范圍更廣的可發(fā)酵糖。然而采用原位酶解方式可以有效解決這些問題[5]，能更好的酶解纖維素產(chǎn)可發(fā)酵性糖，是實(shí)現(xiàn)纖維素資源有效利用的最新手段，受到廣泛關(guān)注。

高效且低成本的降解技術(shù)是實(shí)現(xiàn)資源化利用水稻秸稈必需解決的難題。國內(nèi)外已先后建成了多套纖維素生物轉(zhuǎn)化試驗(yàn)裝置，但由于技術(shù)積累不夠，生產(chǎn)成本過高，無法真正實(shí)現(xiàn)工業(yè)化[3,6]。造成木質(zhì)纖維素降解成本過高的主要技術(shù)瓶頸是水解過程的纖維素酶用量較高，酶解效率有待改進(jìn)[7]。相關(guān)研究表明，液態(tài)原位酶解工藝可以降低天然木質(zhì)纖維素糖化對(duì)預(yù)處理的要求，同時(shí)提高酶解效率與糖化率，克服直接發(fā)酵法中還原糖積累少的缺點(diǎn)[8]。原位酶解工藝在各研究領(lǐng)域都有所涉獵，且纖維素原位酶解已廣泛應(yīng)用于離子液體中，如MESBAH等[9]結(jié)合離子液體和纖維素酶En5H處理稻草，纖維素轉(zhuǎn)化率提高28%。李強(qiáng)等[10]利用合成的離子液體[Meim]DMP原位酶解秸稈，結(jié)合秸稈預(yù)處理，最后酶解轉(zhuǎn)化率提高了2.4倍。目前為止，國內(nèi)外關(guān)于利用微生物發(fā)酵原位酶解糖化秸稈報(bào)道較少，水稻秸稈更是鮮有研究，近年來逐漸成為研究的一大熱點(diǎn)。

發(fā)酵產(chǎn)酶和酶解在同一地點(diǎn)或容器內(nèi)被稱為原位酶解[10-11]。本研究以水稻秸稈為底物，里氏木霉為產(chǎn)酶微生物，通過研究液態(tài)發(fā)酵原位酶解糖化水稻秸稈，對(duì)發(fā)酵過程和酶解過程協(xié)同控制條件進(jìn)行優(yōu)化，從而提高水稻秸稈的糖化率。為天然木質(zhì)纖維素的高效糖化研究提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

實(shí)驗(yàn)菌種：里氏木霉CICC 41027，中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

水稻秸稈段：采用預(yù)處理后的水稻秸稈段[12]。

粗酶液：實(shí)驗(yàn)前期產(chǎn)酶優(yōu)化培養(yǎng)基培養(yǎng)的發(fā)酵液，離心取上清液為粗酶液，備用。

1.1.2 試劑及藥品

無水葡萄糖、NaOH、Ca(OH)2、鹽酸、亞硫酸鈉、尿素、硫酸、一水檸檬酸、檸檬酸三鈉、3,5-二硝基水楊酸、亞硝酸鈉、苯酚、酒石酸鉀鈉、羧甲基纖維素鈉等(分析純)，成都市科龍化工試劑廠。

檸檬酸緩沖液(0.05 mol/L，pH 4.8)：取一水檸檬酸4.83 g，溶解于約750 mL去離子水中，邊攪拌邊加入檸檬酸三鈉7.94 g，定容至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH值至4.8后4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

10 g/L羧甲基纖維素鈉溶液(carboxymethylcellulose sodium，CMC-Na)：取1 g CMC-Na溶解于100 mL pH 4.8的檸檬酸緩沖液中，保存時(shí)間不超過3 d。

3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid，DNS)試劑：稱取DNS 3.15 g，加適量水45 ℃水浴攪拌溶解，然后再加入20 g NaOH溶液攪拌溶解，再依次加入酒石酸鉀鈉91 g、亞硝酸鈉2.5 g、苯酚2.5 g，加熱攪拌溶解后定容至1 000 mL，用濾紙過濾后，裝入棕色瓶黑暗處放置7 d后可使用。

1.2 儀器與設(shè)備

QYC-2102搖床，上海滬奧明科學(xué)儀器有限公司；MJ-250恒溫培養(yǎng)箱、TG-16醫(yī)用離心機(jī)，四川蜀科儀器有限公司；V-1000可見分光光度計(jì)，翱藝儀器有限公司；HH-6D數(shù)顯恒水浴鍋，常州普天儀器制造有限公司；Whatman1號(hào)濾紙、抗腐蝕的濾袋。

1.3 培養(yǎng)基的制備

糖化培養(yǎng)基1(初始)：水稻秸稈20 g、(NH4)2SO42 g、KH2PO43 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、微量元素液10 mL、吐溫-80 0.5 mL、H2O 1 000 mL、pH 6。

糖化培養(yǎng)基2：水稻秸稈30 g、(NH4)2SO42 g、KH2PO43 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、微量元素液10 mL、吐溫-80 0.5 mL、H2O 1 000 mL、pH 6。

微量元素液：CoCl2·6H2O 2 mg、MnSO4·H2O 2 mg、ZnSO4·7H2O 3.45 mg、FeSO4·7H2O 4 mg、H2O 1 000 mL。

CMC-Na種子培養(yǎng)基：CMC-Na 10 g、蛋白胨3 g、KH2PO41 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、葡萄糖0.5 g、H2O 1 000 mL、pH自然。

發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基(優(yōu)化后)：預(yù)處理水稻秸稈15 g、(NH4)2SO42 g、MgSO4·7H2O0.5 g、KH2PO43 g、吐溫-80 0.5 mL、FeSO4·7H2O 0.002 g、微量元素液10 mL、H2O 1000 mL、pH6～6.5(自然)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 液態(tài)發(fā)酵原位酶解糖化工藝

液態(tài)發(fā)酵原位酶解糖化工藝如下：

秸稈培養(yǎng)基→接種→發(fā)酵產(chǎn)酶及破壞秸稈結(jié)構(gòu)→調(diào)節(jié)pH→升溫酶解→取樣測(cè)還原糖

配制糖化培養(yǎng)基1，121 ℃滅菌，接種5%(體積分?jǐn)?shù))種子液，搖床恒溫(26～32 ℃)培養(yǎng)一定時(shí)間，取出，用NaOH和稀鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值，置于培養(yǎng)箱中恒溫(40～60 ℃)一段時(shí)間，取樣，6 000 r/min離心5 min，用DNS法測(cè)發(fā)酵液中的還原糖[13]。

秸稈比產(chǎn)糖量(g/g)：?jiǎn)挝唤斩挳a(chǎn)生的還原糖量，根據(jù)每瓶發(fā)酵液中的總還原糖和秸稈的添加量，算出每克秸稈最終的糖化率[12]。

1.4.2 液態(tài)發(fā)酵原位酶解過程隨時(shí)間變化趨勢(shì)

秸稈糖化培養(yǎng)基1，250 mL錐形瓶裝液100 mL，初始pH 6，29 ℃，150 r/min，接種量5%，從發(fā)酵第2天開始每天取2瓶，取樣測(cè)發(fā)酵液中的還原糖和濾紙酶活力(fliter paper actioity，F(xiàn)PA)酶活，然后將錐形瓶中剩余發(fā)酵液置于55 ℃搖床中保溫6 h后，再次測(cè)發(fā)酵液中的還原糖和FPA及pH值。

1.4.3 酶解階段條件控制

1.4.3.1 酶解階段pH控制對(duì)產(chǎn)糖的影響

配制糖化培養(yǎng)基1，250 mL錐形瓶裝100 mL若干瓶，初始pH 6，種子液接種量5%，150 r/min，29 ℃恒溫培養(yǎng)，發(fā)酵48 h后，發(fā)酵液的pH值在3～3.5，用NaOH和鹽酸溶液調(diào)節(jié)不同初始酶解pH值(3.2、3.6、4.0、4.4、4.8、5.2)，將錐形瓶靜置于50 ℃的培養(yǎng)箱中，酶解24 h，取樣，6 000 r/min離心5 min，測(cè)還原糖，比較初始酶解pH對(duì)產(chǎn)糖的影響。

1.4.3.2 酶解階段溫度控制對(duì)產(chǎn)糖的影響

發(fā)酵條件不變，發(fā)酵48 h后，調(diào)節(jié)初始酶解pH 4.8，然后將錐形瓶置于不同溫度(40、45、50、55、60、65 ℃)的培養(yǎng)箱中酶解24 h，分別在6、12、24 h取樣，測(cè)還原糖。

1.4.3.3 酶解時(shí)間對(duì)產(chǎn)糖的影響

發(fā)酵條件不變，發(fā)酵48 h后，調(diào)節(jié)初始酶解pH 4.8，酶解溫度50 ℃，不同酶解時(shí)間取樣(0、2、6、12、24、36、48、72、84 h)，測(cè)還原糖。

1.4.4 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

1.4.4.1 水稻秸稈的最佳添加量

原位酶解法糖化水稻秸稈，基礎(chǔ)培養(yǎng)基中每升培養(yǎng)基中秸稈的裝載量為20 g，實(shí)驗(yàn)通過不同的水稻秸稈添加量(10、20、30、40、50 g/L)，比較每升培養(yǎng)基總還原糖產(chǎn)量和每克秸稈產(chǎn)糖量，確定較優(yōu)的秸稈載量。

1.4.4.2 氮源的選擇

在水稻秸稈30 g/L的基礎(chǔ)上，選擇不同的氮源2 g/L，其他條件相同，選擇對(duì)于原位酶解法產(chǎn)糖的較優(yōu)氮源。

1.4.5 發(fā)酵階段的條件控制

1.4.5.1 發(fā)酵溫度的優(yōu)化

在確定發(fā)酵培養(yǎng)基為：水稻秸稈30 g、(NH4)2SO42 g、KH2PO43 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、微量元素液10 mL、吐溫-800.5 mL、H2O1 000 mL的情況下探究發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)糖的影響。設(shè)置發(fā)酵階段的溫度為24、26、28、29、30、32 ℃。

1.4.5.2 發(fā)酵pH的優(yōu)化

在上述實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上探究發(fā)酵初始pH值對(duì)產(chǎn)糖的影響，設(shè)置初始pH值分別為4、5、6、6.5、7。

1.4.5.3 發(fā)酵時(shí)間的優(yōu)化

在上述實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上探究發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)糖的影響，設(shè)置不同的發(fā)酵時(shí)間為24、36、48、60、72、84 h。

1.4.6 原位酶解補(bǔ)加酶液對(duì)糖化的影響

由于液態(tài)原位酶解糖化工藝中發(fā)酵階段只有48 h，還未達(dá)到產(chǎn)纖維素酶高峰期，探究在進(jìn)入酶解階段前補(bǔ)加粗酶液(由實(shí)驗(yàn)前期得到的發(fā)酵產(chǎn)酶優(yōu)化培養(yǎng)基培養(yǎng)的發(fā)酵液離心獲得)能否進(jìn)一步提升秸稈糖化的比產(chǎn)糖量。分別添加產(chǎn)酶優(yōu)化后的粗酶液0、2.5、5、7.5、10 mL，測(cè)最終的比產(chǎn)糖量。

1.4.7 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)樣品固態(tài)發(fā)酵均做3次平行試驗(yàn)，采用Excel對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)初步處理，再用Design Expert 8.0處理數(shù)據(jù)，Origin 8.5作圖，試驗(yàn)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。數(shù)據(jù)采用ANOVA進(jìn)行Duncan差異分析，以P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 原位酶解產(chǎn)糖隨發(fā)酵時(shí)間變化趨勢(shì)

通過對(duì)發(fā)酵過程、酶解過程中還原糖、FPA、pH過程檢測(cè)，了解發(fā)酵、酶解過程隨時(shí)間的變化情況，對(duì)原位酶解發(fā)酵法糖化工藝進(jìn)行初步探索。由圖1和表1可知，首先在2～6 d時(shí)發(fā)酵液中本身的還原糖濃度很低，還原糖濃度最高時(shí)為發(fā)酵第2天，約為1.414 mg/mL。纖維素酶活隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)逐步增加，最高為第6天，約0.706 IU/mL，這與纖維素產(chǎn)酶的特點(diǎn)是相符的。通過對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行升溫酶解,6 h后測(cè)其中的還原糖，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵2～4 d的發(fā)酵液通過升溫酶解后，還原糖含量明顯增加，其中第2天發(fā)酵液中的還原糖含量由1.414 mg/mL上升至4.2 mg/mL，是未酶解前的3倍，而5～6 d酶解后還原糖變化不大。酶解6 h后相比于酶解前發(fā)酵液中的酶活都有所下降，特別是4～6 d。由表1可知，發(fā)酵液中的pH值隨發(fā)酵時(shí)間降低，在發(fā)酵第6天僅有2.04。

表1 原位酶解產(chǎn)糖過程中各參數(shù)隨發(fā)酵時(shí)間的變化Table 1 Changes of various parameters with fermentation time during in situ enzymatic hydrolysis)

圖1 不同發(fā)酵時(shí)間保溫前后還原糖和酶活變化Fig.1 Changes of reducing sugar and enzyme activity before and after holding at different fermentation time

根據(jù)研究和預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，就整個(gè)過程而言,酶解條件控制對(duì)秸稈的糖化影響大于發(fā)酵過程，因此先將影響大的條件確定下來，再優(yōu)化影響較小的，這樣整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中的理論誤差最小。同時(shí)發(fā)酵過程有前期實(shí)驗(yàn)做的產(chǎn)酶條件優(yōu)化作參考，有一定指導(dǎo)意義，因此接下來實(shí)驗(yàn)將先研究不同的酶解條件對(duì)于水稻秸稈糖化的影響，后研究不同的發(fā)酵產(chǎn)酶條件對(duì)于糖化的影響。

2.2 酶解階段的條件控制

pH是影響纖維素酶活的重要因素，對(duì)于糖化效率有很大的影響。將發(fā)酵48 h后的發(fā)酵液分別調(diào)節(jié)pH 3.2、3.6、4.0、4.4、4.8、5.2，然后升溫50 ℃酶解24 h。如圖2-a所示，每克秸稈的還原糖產(chǎn)量先隨pH升高而增加然后減小，在pH=4.8時(shí)取得最大值，約0.406 g/g，同時(shí)pH 4.4時(shí)和pH 4.8相差不大，約0.396 g/g。最終選擇pH 4.8為酶解階段的最適pH。

圖2 不同酶解條件對(duì)產(chǎn)糖的影響Fig.2 Effect of different enzymatic hydrolysis conditions on sugar production注：不同大、小寫字母、希文字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

纖維素酶的最適合成溫度和最適酶解溫度不同，找到最適酶解溫度有助于提高糖化效率。結(jié)合已有的研究，同時(shí)考慮到高溫會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)有影響，因此實(shí)驗(yàn)設(shè)置為不同溫度下，不同時(shí)間的酶解產(chǎn)糖。如圖2-b，在酶解6 h時(shí)，產(chǎn)糖量最高的是溫度為60 ℃時(shí)，而50、55、65 ℃時(shí)處于同一水平。當(dāng)酶解至12 h時(shí)，產(chǎn)糖量最高的是溫度為55 ℃時(shí)，依次為60、50 ℃。當(dāng)酶解至24 h時(shí)，產(chǎn)糖量最高的是溫度為50 ℃時(shí)，依次為45、55 ℃。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，在短時(shí)間的酶解時(shí)，60 ℃和55 ℃的酶解效率更高，但隨著酶解時(shí)間延長(zhǎng)，溫度對(duì)酶的損害作用逐漸體現(xiàn)出來，其綜合正向促進(jìn)作用開始小于負(fù)向的損害作用。溫度40 ℃時(shí)酶的糖化效率不高。因此，若酶解時(shí)間超過24 h，應(yīng)選擇酶解溫度為50 ℃或45 ℃，本研究選擇50 ℃作為酶解階段的發(fā)酵溫度。

酶的催化通常會(huì)有動(dòng)力學(xué)方程，酶解效率會(huì)受酶解條件和環(huán)境的影響，隨著酶解過程的進(jìn)行，底物減少、產(chǎn)物的反饋抑制、酶的損耗等都會(huì)影響到最終的產(chǎn)物，纖維素酶的酶解糖化過程也有這些現(xiàn)象。如圖2-c，酶解時(shí)間越短，曲線的斜率越大，單位時(shí)間的糖化效率越快。在酶解的前12 h，底物充足，酶的活性高，反饋抑制弱，糖化的速度快，在12 h時(shí)產(chǎn)糖量約為0.282 g/g；在酶解至24 h時(shí)約為0.410 g/g，12 h增加了0.118 g/g；在酶解至36 h時(shí)約為0.474 g/g，12 h增加了0.074 g/g；最終酶解至72 h時(shí)約為0.567 g/g。隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，受制于發(fā)酵液中的底物和酶的限制，最終產(chǎn)糖量提升并不多?？紤]到成本因素，暫選24 h作為后續(xù)研究的酶解時(shí)間。

2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.3.1 水稻秸稈的最佳添加量

水稻秸稈段中有許多空隙和中空，平均體積大，密度小，且不溶于水，每升發(fā)酵液中的裝載量較少。在不壓實(shí)的狀態(tài)下，每升發(fā)酵液能裝40～50 g秸稈段，而且秸稈段裝載過多，發(fā)酵一段時(shí)間后發(fā)酵液會(huì)成糊狀，不利于發(fā)酵過程的進(jìn)行。因此，通過比較每升發(fā)酵液中不同水稻秸稈段的添加量對(duì)單位秸稈的糖化率和每升發(fā)酵液中的總產(chǎn)糖量的影響，選擇出合適的秸稈添加量。如圖3所示，每克秸稈的產(chǎn)糖量隨秸稈的添加量增加而減少，每升發(fā)酵液中的總產(chǎn)糖量隨秸稈添加量增加而增加。根據(jù)原位酶解發(fā)酵產(chǎn)糖工藝，發(fā)酵階段主要是產(chǎn)酶和進(jìn)一步打破秸稈為下一步酶解提供基礎(chǔ)，酶的產(chǎn)量與秸稈量在一定范圍內(nèi)呈負(fù)相關(guān)，每升發(fā)酵液中秸稈含量少，更利于纖維素酶的誘導(dǎo)合成，同時(shí)在酶解階段單位質(zhì)量秸稈會(huì)擁有更多的纖維素酶，而且發(fā)酵液中的總糖含量低，酶解的反饋抑制作用也會(huì)降低。因此，在一定范圍內(nèi)，每升發(fā)酵液中含有的秸稈越少其單位質(zhì)量的糖化率反而更高。但是每升發(fā)酵液秸稈添加少，其總的產(chǎn)糖也必然少，即便糖化率高其研究?jī)r(jià)值也不大，在實(shí)際應(yīng)用中需要平衡單位秸稈糖化率和每升發(fā)酵液中總產(chǎn)糖量的關(guān)系。要想得到客觀可靠的結(jié)果，必須對(duì)整個(gè)生產(chǎn)過程的成本進(jìn)行估算，建立一個(gè)成本模型和函數(shù)關(guān)系，最后才能得出最適的添加量，這其中涉及的問題較多且復(fù)雜。在30～35 g/L的秸稈添加量時(shí)，單位秸稈糖化率和每升發(fā)酵液的總糖量都能保持在一定水平，因此在缺少相關(guān)的數(shù)據(jù)和信息前，本研究只能簡(jiǎn)單的暫選30 g/L作為每升發(fā)酵液的秸稈添加量。

圖3 秸稈的添加量對(duì)產(chǎn)糖的影響Fig.3 Effect of added amount of straw on sugar production

2.3.2 氮源的選擇和氮源含量

在微生物發(fā)酵過程中添加氮源主要是為了補(bǔ)充生長(zhǎng)繁殖所必需的氮元素。如圖4所示，以蛋白胨為氮源糖化率最高，為0.355 g/g，硫酸銨氮源的糖化率其次，為0.336 g/g，硝酸銨和麩皮糖化率分別為0.277、0.233 g/g，以尿素為氮源的糖化率最低，僅0.030 g/g。蛋白胨和硫酸銨都是里氏木霉的優(yōu)質(zhì)氮源，但考慮到蛋白胨和硫酸銨的成本差異，仍選擇硫酸銨為原位發(fā)酵酶解法糖化工藝的氮源。

圖4 不同氮源對(duì)產(chǎn)糖的影響Fig.4 Effect of nitrogen source on sugar production

2.4 發(fā)酵階段的條件控制

發(fā)酵階段的主要目的是微生物的快速生長(zhǎng)和產(chǎn)酶，溫度過高和過低都不利于微生物的生長(zhǎng)代謝。如圖5-a所示，發(fā)酵階段的溫度在30 ℃時(shí)，最終的產(chǎn)糖量更高。但是根據(jù)鄔敏辰等[16]的研究，在里氏木霉發(fā)酵產(chǎn)酶的溫度優(yōu)化中，先將發(fā)酵液在29 ℃的溫度下發(fā)酵1～2 d，再降低到28 ℃發(fā)酵，最終發(fā)酵酶活更高。他認(rèn)為溫度高一點(diǎn)更有利于前期發(fā)酵微生物的生長(zhǎng)繁殖，本研究的結(jié)果與其有相似之處。最終選擇30 ℃作為發(fā)酵產(chǎn)酶階段的發(fā)酵溫度。

發(fā)酵階段的pH對(duì)微生物的生長(zhǎng)繁殖和代謝有重要影響。如圖5-b所示，在原位酶解發(fā)酵法糖化中pH 6.5時(shí)有最大產(chǎn)糖量，但在pH 5時(shí)產(chǎn)糖量排在第2，初始pH 6、7分別排在第3和第5。由表1可知，在持續(xù)的產(chǎn)酶發(fā)酵過程中，發(fā)酵液的pH會(huì)隨著時(shí)間降低，在發(fā)酵第3～6天時(shí)pH值已經(jīng)低于3了，pH過低會(huì)對(duì)微生物的生長(zhǎng)代謝帶來不利影響，因此高初始pH可以減緩pH減低的速度，但同時(shí)pH過高不利于微生物前期的生長(zhǎng)繁殖。由于發(fā)酵時(shí)間為2 d，發(fā)酵液中pH降低不明顯，最終表現(xiàn)為初始pH 4～6.5對(duì)產(chǎn)糖量的影響并不大。可推測(cè)在里氏木霉的發(fā)酵產(chǎn)酶過程中，pH過高不利于微生物的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶。在一定范圍內(nèi)，pH過低雖然同樣不利于微生物的生長(zhǎng)，但對(duì)產(chǎn)酶有促進(jìn)作用。由于剛配制的發(fā)酵液自然pH 6～7，且在初始pH 6.5時(shí)有最大產(chǎn)糖量，因此本研究選擇pH 6.5作為發(fā)酵液的初始pH值。

發(fā)酵時(shí)間是發(fā)酵產(chǎn)酶階段和酶解糖化階段的重要分界點(diǎn)，對(duì)最終產(chǎn)糖量影響很大，是原位酶解糖化工藝中的關(guān)鍵因素。發(fā)酵階段微生物快速生長(zhǎng)，產(chǎn)纖維素酶對(duì)天然木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)進(jìn)行破壞；酶解階段為纖維素酶提供適宜的酶解條件使其充分酶解糖化。發(fā)酵時(shí)間過長(zhǎng)，大量的底物被消耗，酶解階段可利用底物減少，秸稈的糖化率降低；發(fā)酵時(shí)間過短，微生物生長(zhǎng)不足，產(chǎn)酶不足，秸稈破壞程度低，都會(huì)對(duì)酶解階段造成影響，使秸稈糖化不充分，糖化率低。如圖5-c所示，在發(fā)酵48 h時(shí)取得最大秸稈糖化率，約0.350 g/g。發(fā)酵24和36 h，發(fā)酵時(shí)間不足，糖化率低，超過48 h，微生物進(jìn)一步生長(zhǎng)代謝，底物消耗，糖化率降低。本研究選擇48 h作為發(fā)酵階段的發(fā)酵時(shí)間。

a-發(fā)酵溫度；b-初始pH；c-發(fā)酵時(shí)間圖5 不同發(fā)酵條件對(duì)產(chǎn)糖的影響Fig.5 Effect of different fermentation conditions on sugar production

2.5 原位酶解補(bǔ)加酶液對(duì)糖化的影響

在原位酶解發(fā)酵法糖化工藝中，發(fā)酵產(chǎn)酶階段的主要目的是發(fā)酵產(chǎn)酶和利用微生物對(duì)秸稈的結(jié)構(gòu)進(jìn)一步破壞，但是由于里氏木霉的產(chǎn)酶特性，在發(fā)酵前兩天并不是產(chǎn)酶最快的時(shí)間，發(fā)酵液中的纖維素酶含量并不高，通過外加少量粗酶液的方式，提高發(fā)酵液中的纖維素酶，進(jìn)而提高比產(chǎn)糖量。研究表明，與商品酶相比，未加工的粗酶液有更高的酶解效率[17-18]。李勇昊[19]通過里氏木霉發(fā)酵產(chǎn)酶，將未經(jīng)任何處理的纖維素粗酶液加入秸稈中進(jìn)行酶解糖化，發(fā)現(xiàn)在50 ℃酶解溫度下，里氏木霉的存在不僅不會(huì)影響糖化效率，而且自身被裂解釋放出部分葡萄糖，提高了最終的糖濃度。如圖6所示，液態(tài)原位酶解糖化工藝中不補(bǔ)加酶液的比產(chǎn)糖量為0.332 g/g，隨著添加粗酶液其最終比產(chǎn)糖量有所提升，當(dāng)每100 mL糖化液中粗酶液添加量超過5 mL時(shí)，其比產(chǎn)糖量在0.400 g/g附近不再顯著提升。因此可以選擇5 mL為較適的粗酶液添加量。

圖6 補(bǔ)加酶液對(duì)比產(chǎn)糖量的影響Fig.6 Effect of supplemented enzyme solution on sugar production

3 結(jié)論與討論

基于里氏木霉產(chǎn)酶特性和酶解特性的差異性矛盾，對(duì)將產(chǎn)酶過程和酶解過程整合起來的液態(tài)原位酶解糖化工藝進(jìn)行了探索。發(fā)現(xiàn)水稻秸稈的原位酶解發(fā)酵糖化將面臨幾個(gè)問題：(1)發(fā)酵產(chǎn)酶和微生物破壞秸稈結(jié)構(gòu)與底物消耗之間的平衡關(guān)系；(2)纖維素酶的酶活力不能充分發(fā)揮；(3)底物在產(chǎn)糖以外的消耗等。根據(jù)原位酶解產(chǎn)糖面臨的問題，實(shí)驗(yàn)主要圍繞以下3個(gè)方向展開：

(1)首先，通過為酶解階段的纖維素酶提供適宜的酶解條件，充分激發(fā)酶的活力，從而減少單位秸稈對(duì)纖維素酶活的需求，提高糖化效率，進(jìn)而縮短發(fā)酵時(shí)間，減少底物的無效消耗。

(2)通過優(yōu)化改良發(fā)酵培養(yǎng)基成分，使其在發(fā)酵階段產(chǎn)酶效率提高的同時(shí)對(duì)酶解階段的負(fù)效應(yīng)降低。

(3)通過優(yōu)化發(fā)酵階段和糖化階段的條件控制，找到發(fā)酵產(chǎn)酶和微生物破壞秸稈結(jié)構(gòu)與底物消耗之間的平衡，從而提高糖化工藝的綜合效能[20]。

實(shí)驗(yàn)初步發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵過程中發(fā)酵液中的還原性糖積累很少，僅能滿足微生物的生長(zhǎng)所需，pH隨發(fā)酵時(shí)間降低，F(xiàn)PA隨發(fā)酵時(shí)間增加，在發(fā)酵2 d后通過升溫、調(diào)節(jié)pH的方式可以有效提高發(fā)酵液中的還原糖積累。對(duì)水稻秸稈的液態(tài)原位酶解糖化工藝進(jìn)行優(yōu)化，在液態(tài)產(chǎn)酶培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，確定了每升30 g秸稈的發(fā)酵培養(yǎng)基；發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度30 ℃，初始pH 6.5，發(fā)酵時(shí)間48 h；酶解條件為酶解pH 4.8，酶解溫度50 ℃，酶解時(shí)間24 h，最終的比產(chǎn)糖量為0.350 g/g。同時(shí)發(fā)現(xiàn)發(fā)酵結(jié)束后補(bǔ)加少量酶液可以進(jìn)一步提高比產(chǎn)糖量至0.400 g/g，約提升了20%。

目前鮮有關(guān)于分位原位酶解糖化工藝的研究報(bào)道。本研究主要探究了液態(tài)發(fā)酵原位酶解糖化工藝條件，以每克秸稈的產(chǎn)糖量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，得到較優(yōu)的水稻原位酶解工藝。后續(xù)將繼續(xù)對(duì)其固態(tài)原位酶解糖化工藝進(jìn)行優(yōu)化，為進(jìn)一步應(yīng)用于木質(zhì)纖維素的糖化和生物煉制提供更多的理論參考。