張紅巖，張妮，楊夢瑩，劉聰，楊立芳，申乃坤*，姜明國

1(廣西民族大學(xué) 海洋與生物技術(shù)學(xué)院，廣西多糖材料與改性重點實驗室，廣西高效微生物與植物資源利用重點實驗室，廣西 南寧，530006) 2(廣西民族大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，廣西林產(chǎn)化學(xué)與工程重點實驗室，廣西 南寧，530006)

近年來，隨著生活水平不斷提高，對雞、鴨等家禽需求日益增加，我國家禽養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)得到迅猛發(fā)展，2018年，我國禽蛋產(chǎn)量位居世界第一(3 128萬t)，禽肉產(chǎn)量位居世界第二(1 994萬t)[1]。而羽毛占活禽總質(zhì)量的5%～7%，據(jù)此推算，我國羽毛年產(chǎn)量超過100萬t。目前，家禽羽毛中除少量絨羽可制作羽絨制品外，大部分并未得到利用，常會被填埋或焚燒[2]，不僅引起嚴(yán)重的環(huán)境污染，還會造成蛋白質(zhì)資源的巨大浪費，甚至?xí)鞑ルu新城疫、氣囊炎等疾病[3]。羽毛中粗蛋白(主要為角蛋白)含量可達(dá)85%以上，且氨基酸組成比較齊全，是一種潛在天然氨基酸來源的生物資源[4]。但羽毛中主要是富含二硫鍵、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的角蛋白，不容易被常見蛋白酶降解，需要經(jīng)過處理后才能被應(yīng)用[5]。傳統(tǒng)是采用物理或化學(xué)方法如高溫高壓、強(qiáng)酸強(qiáng)堿和擠壓膨化等方式處理羽毛，不僅工藝復(fù)雜、能耗高、環(huán)境污染嚴(yán)重，而且會對所產(chǎn)生的氨基酸造成破壞[6]。而采用可分泌角蛋白酶的微生物對羽毛進(jìn)行降解，不僅反應(yīng)條件溫和、降解效果好，而且對氨基酸的破壞較小，降解產(chǎn)物可在飼料、肥料、醫(yī)藥等行業(yè)廣泛應(yīng)用[7-9]。因此，利用微生物法降解羽毛，不僅可充分利用廢棄蛋白資源，而且對環(huán)境保護(hù)也具有積極意義。

目前已經(jīng)篩選出真菌、放線菌、細(xì)菌等30多種可降解羽毛的微生物[5,10]，與真菌和放線菌相比，細(xì)菌類如地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)[11]、短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)[12]、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)[13]、粘金黃桿菌(Caldicoprobacterguelmensis)[14]等具有生長快、產(chǎn)酶活性高、工業(yè)應(yīng)用安全等優(yōu)點，成為目前角蛋白酶來源的主要產(chǎn)生菌。但仍存在角蛋白酶活力低、羽毛降解效果差、發(fā)酵周期長等問題，是限制廢棄羽毛微生物工業(yè)化的瓶頸之一。除菌株本身產(chǎn)酶能力對角蛋白酶酶活起著決定作用外，培養(yǎng)基的組成及培養(yǎng)條件等外部環(huán)境因素也影響著微生物潛力的釋放。RAMNAI等[15]采用Plackett-Burman(PB)試驗及響應(yīng)面優(yōu)化方法對B.licheniformisRG1產(chǎn)角蛋白酶的條件進(jìn)行了優(yōu)化，酶活提高3.5倍。冀勇良等[16]采用單因素結(jié)合響應(yīng)面優(yōu)化方法對B.pumilusZW-36產(chǎn)角蛋白酶的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后角蛋白酶酶活達(dá)到57.14 U/mL，較優(yōu)化前(38.27 U/mL)酶活提高了49.3%。蔣彪等[17]采用響應(yīng)面法對Bacillussp.CJPE209產(chǎn)角蛋白酶條件優(yōu)化后酶活可達(dá)503.5 U/mL，較優(yōu)化前提高20%以上。

本研究以實驗室前期篩選得到的1株海洋來源高效降解羽毛的擬蕈狀芽孢桿菌(Bacillusparamycoides)Gxun-30為產(chǎn)酶菌株，通過單因素及響應(yīng)面優(yōu)化方法對發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，提高了該菌株產(chǎn)角蛋白酶的能力，為后期利用該菌株降解廢棄羽毛角蛋白資源奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種

擬蕈狀芽孢桿菌(B.paramycoidesGxun-30)[8]篩選自廣西北海某海鴨養(yǎng)殖場。

1.1.2 羽毛

收集家禽市場的雞、鴨等羽毛，分別用自來水、蒸餾水洗凈后，70 ℃烘箱烘干至衡重，羽毛無需粉碎，較長羽毛剪成2 cm左右小段，備用。

1.1.3 試劑

蛋白胨、酵母抽提物，英國OXOID公司；瓊脂粉為西班牙進(jìn)口分裝；干酪素、福林酚，生物工程(上海)股份有限公司，均為分析純。

1.1.4 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl 5，pH 7.2。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：羽毛10，NaCl 5，K2HPO41.4，MgSO40.1，KH2PO40.7，pH 7.0。

1.2 實驗方法

1.2.1 角蛋白酶活測定

(1)粗酶液的制備：粗酶液為發(fā)酵液12 000 r/min、離心10 min后得到的上清液。

(2)角蛋白酶酶活測定：參照文獻(xiàn)[8]的方法進(jìn)行。

1.2.2 單因素實驗分析

(1)羽毛含量對菌株產(chǎn)角蛋白酶的影響

以初始發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別稱取0、10、15、20、25 g/L羽毛，其他培養(yǎng)基成分不變，裝液量為50 mL/250 mL三角瓶，接種量為1%，35 ℃，200 r/min條件下培養(yǎng)60 h，每組設(shè)3個平行，結(jié)果取平均值，測定不同羽毛濃度下的粗酶液酶活，以確定最適羽毛添加濃度(若無特殊說明，其他條件相同)。

(2)碳源及濃度對菌株產(chǎn)角蛋白酶的影響

分別添加10 g/L不同碳源，根據(jù)酶活大小確定最適碳源，再對濃度進(jìn)行優(yōu)化，從而確定最適濃度。

(3)氮源及濃度對菌株產(chǎn)角蛋白酶的影響

分別添加2 g/L有機(jī)氮源(牛肉膏、酵母粉、玉米漿、蛋白胨、酪蛋白)和無機(jī)氮源(硫酸銨、硝酸銨)，根際酶活大小確定最適氮源，再對氮源濃度進(jìn)行優(yōu)化。

(4)無機(jī)鹽及濃度對菌株產(chǎn)角蛋白酶的影響

分別添加0.1 g/L不同無機(jī)鹽，根據(jù)酶活大小確定菌株產(chǎn)酶的最佳無機(jī)鹽，再對濃度進(jìn)行優(yōu)化。

(5)發(fā)酵初始pH值及接種量對菌株產(chǎn)角蛋白酶的影響

將發(fā)酵初始pH值分別調(diào)為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，接種量分別為0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%，根據(jù)酶活大小確定菌株產(chǎn)酶的最佳初始pH值和最佳接種量。

(6)發(fā)酵時間和溫度對菌株產(chǎn)角蛋白酶的影響

發(fā)酵時間分別設(shè)為12、24、36、48、60 h，發(fā)酵溫度分別設(shè)為30、32.5、35、37.5、40 ℃，根據(jù)酶活大小確定菌株產(chǎn)酶最佳發(fā)酵時間和溫度。

1.2.3 Packett-Burman 試驗分析

根據(jù)前期單因素試驗結(jié)果，利用Design-Expert 8.0.6軟件選用N=13的PB試驗設(shè)計，對8個試驗因子進(jìn)行研究，每個因子取-1、+1水平，以角蛋白酶酶活的均值Y(U/mL)為響應(yīng)值，從中確定出相對較顯著的影響因子，以便進(jìn)行下一步響應(yīng)面試驗[19]。各個因子及水平見表1。

表1 Plackett-Burman試驗設(shè)計參數(shù)和水平Table 1 Six Plackett-Burman designed experimental parameters and levels

1.2.4 最陡爬坡試驗分析

依據(jù)影響角蛋白酶酶活顯著因素的效應(yīng)值大小來決定最陡爬坡試驗的步長，根據(jù)酶活大小找到爬坡試驗的拐點，為下一步響應(yīng)面優(yōu)化(Box-Behnken法)提供中心點數(shù)據(jù)。

1.2.5 Box-Behnken 試驗分析

根據(jù)PB試驗和最陡爬坡試驗結(jié)果，采用3因素3水平的Box-Behnken優(yōu)化試驗來確定B.paramycoidesGxun-30產(chǎn)角蛋白酶的最佳培養(yǎng)基組成，用軟件對酶活試驗結(jié)果進(jìn)行處理和分析，并對獲得最佳產(chǎn)酶條件進(jìn)行發(fā)酵驗證[20]。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理及分析

采用Design-Expert 8.0.6.1和SPSS 13.0進(jìn)行試驗設(shè)計及數(shù)據(jù)分析，Origin 8.0軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果與分析

2.1.1 羽毛濃度對B.paramycoidesGxun-30產(chǎn)角蛋白酶的影響

羽毛濃度對菌株產(chǎn)角蛋白酶影響如圖1所示，當(dāng)不添加羽毛時，無法檢測到角蛋白酶酶活，可能由于羽毛除了為菌株生長所需營養(yǎng)外，還可誘導(dǎo)菌株分泌角蛋白酶。這與目前文獻(xiàn)報道結(jié)果類似：產(chǎn)角蛋白酶大多數(shù)菌株往往需要角蛋白類底物誘導(dǎo)，才能誘導(dǎo)酶的產(chǎn)生和胞外分泌[21]。當(dāng)羽毛質(zhì)量濃度低于15 g/L時，酶活隨著羽毛濃度升高而逐漸增加，當(dāng)羽毛質(zhì)量濃度為15 g/L時，酶活達(dá)到最高為227.38 U/mL；但當(dāng)羽毛質(zhì)量濃度高于15 g /L時，酶活反而減少，可能是羽毛含量過高時，發(fā)酵液的黏稠度較大，影響了發(fā)酵體系中氧的供應(yīng)，進(jìn)而影響菌株生長和角蛋白酶分泌[12]。因此，羽毛最適添加量為 15 g/L。

圖1 羽毛添加量對B.paramycoides Gxun-30菌株產(chǎn)角蛋白酶的影響Fig.1 Effect of different feather contents on keratinase production of strain B.paramycoides Gxun-30

當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中羽毛為唯一碳、氮源時，菌株需要先分泌角蛋白酶降解羽毛后，才能獲得生長所需營養(yǎng)，但在生長初期，培養(yǎng)基內(nèi)菌株分泌角蛋白酶較低，羽毛降解產(chǎn)物較少，導(dǎo)致營養(yǎng)相對缺乏，菌體無法快速積累，最終無法達(dá)到較高的產(chǎn)酶水平[15]。

2.1.2 外加碳源對B.paramycoidesGxun-30產(chǎn)角蛋白酶的影響

碳源為微生物生長代謝提供碳骨架和能量，其種類及濃度對微生物生長代謝至關(guān)重要。由圖2可知，不同碳源對B.paramycoidesGxun-30產(chǎn)酶的影響不同，蔗糖和可溶性淀粉對菌株產(chǎn)酶有阻遏作用，而果糖、麥芽糖和葡萄糖對產(chǎn)酶有激活作用，特別是添加果糖時，酶活可達(dá)335.72 U/mL，遠(yuǎn)高于對照酶活154.36 U/mL。因此，B.paramycoidesGxun-30產(chǎn)角蛋白酶最適碳源為果糖。進(jìn)一步對果糖最適添加濃度進(jìn)行優(yōu)化，當(dāng)添加量為10 g/L時，酶活最高為336.85 U/mL。

a-不同碳源；b-不同果糖添加量圖2 碳源及濃度對B.paramycoides Gxun-30產(chǎn)角蛋白酶的影響Fig.2 Effect of carbon source species and concentration on keratinase production of strain B.paramycoides Gxun-30

2.1.3 外加氮源對角蛋白酶酶活的影響

氮源是微生物蛋白質(zhì)、核酸以及含氮代謝產(chǎn)物合成的重要營養(yǎng)物質(zhì)，對微生物生長及代謝具有重要影響。由圖3可知，無機(jī)氮源(硫酸銨和硝酸銨)對產(chǎn)酶均產(chǎn)生抑制；而牛肉膏、酵母粉、玉米漿、蛋白胨等有機(jī)氮源對菌株產(chǎn)酶有激活作用，當(dāng)玉米漿為氮源時，酶活最高為323.45 U/mL。進(jìn)一步對玉米漿的最適濃度進(jìn)行了優(yōu)化，當(dāng)添加4.0 g/L時，酶活最高為460.90 U/mL；但濃度增高時，酶活反而迅速降低，可能是由于過高的氮源抑制了菌株誘導(dǎo)角蛋白酶產(chǎn)生[12]。因此，玉米漿最適添加量為4.0 g/L。

a-不同氮源；b-不同玉米漿添加量圖3 氮源及濃度對B.paramycoides Gxun-30產(chǎn)角蛋白酶的影響Fig.3 Effect of nitrogen source species and concentration on keratinase production of strain B.paramycoides Gxun-30

2.1.4 無機(jī)鹽對菌株產(chǎn)酶的影響

無機(jī)鹽除對微生物細(xì)胞膜滲透壓有調(diào)節(jié)作用外，其所含金屬離子往往是蛋白酶的輔助因子，對維持酶的催化活性有重要作用。由圖4可知，硫酸錳和硫酸鋅對菌株產(chǎn)酶活性略有抑制；而硫酸銅和硫酸亞鐵對菌株產(chǎn)酶有強(qiáng)烈抑制；而氯化鈣、硫酸鎂及氯化鈉有顯著促進(jìn)作用，特別是添加氯化鈣時，酶活達(dá)468.60 U/mL，較對照提高了近4倍?？赡苁荂a2+、Mg2+和Na+能直接參與酶活性中心的構(gòu)成或是酶的激活劑，進(jìn)而提高了發(fā)酵液中酶的活性[23]。氯化鈣最適添加質(zhì)量濃度為0.15 g/L。

a-不同無機(jī)鹽；b-不同氯化鈣添加量圖4 無機(jī)鹽及濃度對B.paramycoides Gxun-30產(chǎn)角蛋白酶的影響Fig.4 Effects of inorganic salts and concentration on keratinase production of strain B.paramycoides Gxun-30

2.1.5 接種量及初始pH值對菌株產(chǎn)酶的影響

由圖5可知，接種量對菌株產(chǎn)酶有較大影響，當(dāng)接種量為2%時，酶活達(dá)到最大474.37 U/mL。接種量過低，菌體延滯期增加，進(jìn)而影響酶的合成；而接種量過高時，菌體迅速進(jìn)入對數(shù)生長，前期營養(yǎng)消耗過快，而穩(wěn)定期蛋白酶合成時營養(yǎng)供應(yīng)不足，從而影響酶的合成[19]。當(dāng)初始pH值低于6.5時，酶活隨pH值升高而增加， pH值為6.5時，酶活達(dá)到最大為469.24 U/mL；但當(dāng)pH值高于7.0時，酶活隨pH值的升高而迅速下降。這說明B.paramycoidesGxun-30在弱酸性條件下有利于菌株生長和酶的誘導(dǎo)；而菌株自身代謝相關(guān)的酶活性在堿性條件下受到抑制。因此，該菌株產(chǎn)酶最適初始pH值為6.5～7.0，與多數(shù)細(xì)菌類產(chǎn)角蛋白的最適pH為弱堿性的報道不同[22]。

a-接種量；b-初始pH值圖5 接種量及初始pH對B.paramycoides Gxun-30產(chǎn)角蛋白酶的影響Fig.5 Effect of inocation amount and initial pH on keratinase productionof strain B.paramycoides Gxun-30

2.1.6 發(fā)酵溫度和時間對產(chǎn)酶活性的影響

由圖6可知，最適發(fā)酵時間為48 h，酶活475.00 U/mL；最適發(fā)酵溫度35～37.5 ℃，酶活達(dá)773.57 U/mL。

a-發(fā)酵時間；b-發(fā)酵溫度圖6 發(fā)酵時間和溫度對B.paramycoides Gxun-30產(chǎn)角蛋白酶的影響Fig.6 Effect of fermentation time and temperature on keratinase production of strain B.paramycoides Gxun-30

2.2 Packett-Burman試驗

PB試驗設(shè)計及結(jié)果見表2，利用Design-Expert軟件對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，可得到模型回歸方程：Y=446.45+113.41X1-18.94X2+1.70X3+66.50X4+24.19X5-64.59X6-0.02X7-3.33X8。該模型的R2為0.967 3，P值為0.032，表明模型的擬合度較好。對表2結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析見表3。各個影響因子的顯著性排序為：X1>X4>X6>X5>X2>X3>X8>X7，其中因素X1、X4、X6的P值<0.05，表明這3個因素即玉米漿、氯化鈣、羽毛含量是影響菌株分泌角蛋白酶的重要因素[20]，需進(jìn)行下一步的最陡爬坡實驗。

表2 Plackett-Burman試驗設(shè)計和結(jié)果Table 2 Plackett-Burman experimental design and results

表3 Plackett-Burman試驗設(shè)計分析Table 3 The analysis of Plackett-Burman

2.3 最陡爬坡試驗

根據(jù)PB試驗結(jié)果玉米漿、氯化鈣、羽毛濃度為菌株產(chǎn)酶顯著影響因素，其中玉米漿及氯化鈣為正影響，羽毛濃度為負(fù)影響，最陡爬坡試驗時要逐步升高玉米漿及氯化鈣的濃度，逐漸降低羽毛濃度，其他5個不顯著的影響因子維持較低濃度水平。試驗設(shè)計及結(jié)果如表4所示，酶活最大值出現(xiàn)在試驗的第4組，故以此點各因子濃度做為Box-Bohnkon試驗中心點。

表4 最陡爬坡試驗設(shè)計及結(jié)果Table 4 Results of the steepest climb experiment

2.4 響應(yīng)面(Box-Bohnkon)優(yōu)化試驗

運用Design-Expert 8.0.6 軟件的Box-Bohnkon的中心組合設(shè)計原理，設(shè)計響應(yīng)面各個因素水平如表5所示，設(shè)計了3因素3水平共13個試驗點，可分成兩類：一類是零點(試驗點4)為區(qū)域中心點；一類是析因點，共12組，每組3個平行，試驗安排及結(jié)果見表6。

表5 響應(yīng)面分析實驗參數(shù)水平Table 5 Factors and levers of response surface central composite design

表6 Box-Bohnkon 試驗設(shè)計表和結(jié)果Table 6 Experimental design of Box-Bohnkon andcorresponding results

表7方差分析結(jié)果表明,P<0.002，遠(yuǎn)小于 0.05，說明模型是重要的，一次項、二次項及交互項對響應(yīng)值的影響是十分顯著的，試驗因子與響應(yīng)值之間不是線性關(guān)系[19]。響應(yīng)曲面圖如圖7所示，回歸模型存在最大穩(wěn)定點，最佳點為X1=0.17、X2=0.15、X3=-0.21時，Y值(角蛋白酶酶活)達(dá)到最大預(yù)測值(1 874.6 U/mL)，即玉米漿8.17 g/L，氯化鈣0.27 g/L，羽毛13.58 g/L，該點角蛋白酶活預(yù)測值為1 874.6 U/mL。

表7 Box-Bohnkon 試驗方差分析結(jié)果Table 7 Analysis of variance of Box-Bohnkon experiment

圖7 各因素對產(chǎn)酶影響的響應(yīng)曲面圖Fig.7 Response surface for the factors on protease production

2.5 模型驗證試驗

為了檢驗?zāi)Ｐ皖A(yù)測的準(zhǔn)確性，按照優(yōu)化得到培養(yǎng)基配方，接種后每隔4 h取樣，測定生物量及角蛋白酶酶活，結(jié)果如圖8所示。菌體接種4 h后進(jìn)入對數(shù)生長期，24～32 h時進(jìn)入穩(wěn)定期，隨后生物量緩慢下降；角蛋白酶酶活在16～48 h快速升高，48 h達(dá)到最大為1 810.98 U/mL，與模型的預(yù)測值1 866.47 U/mL非常接近，說明建立的模型準(zhǔn)確性較好。這說明該菌株羽毛降解速度較快，與前期研究2 d可將未粉碎羽毛幾乎完全降解[8]的結(jié)果相一致。該菌株酶活及產(chǎn)酶速度優(yōu)于目前文獻(xiàn)報道蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)發(fā)酵48 h，酶活132.50 U/mL[23]；枯草芽孢桿菌(B.subtilis)發(fā)酵48 h，酶活166.08 U/mL[24]；地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)發(fā)酵48 h，酶活72.20 U/mL[25]，具有良好的工業(yè)化應(yīng)用潛力。

圖8 菌株B.paramycoides Gxun-30降解羽毛過程中生長及產(chǎn)角蛋白酶活曲線Fig.8 The process of degradation of feather growth and keratinase production curve of strain B.paramycoides Gxun-30

3 結(jié)論

本文分別通過單因素、PB、最陡爬坡和響應(yīng)面優(yōu)化方法對擬蕈狀芽孢桿菌Gxun-30產(chǎn)角蛋白酶的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。得到該菌株最佳產(chǎn)酶條件為玉米漿8.17 g/L，氯化鈣0.27 g/L，羽毛含量13.58 g/L，果糖10 g/L、初始pH 6.5、接種量 2.0%、發(fā)酵時間 48 h 時，酶活力模型預(yù)測值為1 866.47 U/mL，實測值達(dá)到1 810.98 U/mL，較優(yōu)化前酶活227.38 U/mL提高了7.96倍。