李娜，崔夢君，馬佳佳，雷炎，郭壯，張振東

(湖北文理學院 食品科學技術學院，鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所，湖北 襄陽，441053)

鲊廣椒是一種以玉米面或大米面或同時2種面粉與鮮辣椒混合作為主料，輔以鹽、胡椒粉和花椒等輔料密封發(fā)酵制成的一種傳統(tǒng)發(fā)酵食品，深受我國四川、重慶、貴州、云南以及湖北等省市地區(qū)人民的喜愛[1]。洪湖市位于湖北省荊州市，該地區(qū)湖泊眾多，地理環(huán)境獨特，出產(chǎn)的鲊廣椒口感酸辣，風味較為特別。由于制作的環(huán)境較為開放，鲊廣椒中的微生物多樣性易受到地區(qū)環(huán)境與制作工藝的影響[2]，推測風味獨特的洪湖鲊廣椒中可能蘊含著一些獨特的微生物類群。

近些年，Illumina MiSeq高通量技術由于具有測序通量高、檢測速度快和靈敏度高的特點，倍受研究人員的喜愛，被廣泛應用于辣椒醬[3]、臘肉[4]、黃酒[5]以及大頭菜[6]等食品中微生物群落結構組成研究。第二代測序技術Illumina MiSeq平臺不僅降低了測序成本還增加了樣品的測序深度，并且具有精確度高和測序量大等特點[7-9]，能更加真實地反映發(fā)酵食品中微生物群落的結構[10]。既往研究發(fā)現(xiàn)多數(shù)鲊廣椒的乳酸菌相對含量較高，并且添加乳酸菌還可以改善鲊廣椒的風味和滋味[11-13]。然而，目前少有對于風味與制作環(huán)境較為獨特的洪湖鲊廣椒的研究報道，對其中蘊含的乳酸菌菌種資源仍不可知。

由于乳酸菌是目前食品領域使用的重要菌種資源，本研究擬同時采用傳統(tǒng)可培養(yǎng)方法與MiSeq高通量技術對鲊廣椒中乳酸菌多樣性進行解析，明確洪湖鲊廣椒中的乳酸菌群落組成以及特色菌群，以期為洪湖地區(qū)鲊廣椒中乳酸菌菌種資源的保存、開發(fā)與利用提供實驗依據(jù)，更可為鲊廣椒的產(chǎn)業(yè)化提供優(yōu)質(zhì)的乳酸菌資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

從湖北省荊州市洪湖市農(nóng)貿(mào)市場采集不同農(nóng)戶自制鲊廣椒共7份，分別編號為HH1、HH2、HH3、HH4、HH5、HH6和HH7，置于含有冰袋的采樣箱中迅速運回實驗室進行分裝，1份于-70 ℃貯存，用于高通量測序；另1份用于乳酸菌的分離。

dNTPs Mix、FastPfu Fly DNA Polymerase、5×TransStartTM FastPfu Buffer，北京全式金生物技術有限公司；QIAGEN DNeasy mericon Food Kit DNA基因組提取試劑盒，德國QIAGEN公司；克隆載體pMD18-T，大連寶生物工程有限公司；MRS培養(yǎng)基(酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、檸檬酸二胺、KH2PO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、NaAc、葡萄糖和吐溫-80，均為分析純)，國藥集團化學試劑有限公司；瓊脂糖，索來寶生物技術有限公司；瓊脂粉，北京奧博星生物技術有限公司；PCR清潔試劑盒，Axygen生物技術(杭州)有限公司。

1.2 儀器與設備

Veriti FAST梯度PCR儀，美國ABI公司；UVPCDS8000凝膠成像分析系統(tǒng)，美國ProteinSimple公司；HR40-IIB2生物安全柜，青島海爾特種電器有限公司；DG250厭氧工作站，英國DonWhitley公司；LRH-250生化恒溫培養(yǎng)箱，上海力辰儀器科技有限公司；Illumina MiSeq高通量測序平臺，美國Illumina公司；ND-2000C微量紫外分光光度計，美國Nano Drop公司；離心機，德國Eppendorf公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 鲊廣椒中微生物宏基因組DNA提取

按照基因組DNA提取試劑盒說明書提取鲊廣椒樣品的宏基因組DNA，將通過瓊脂糖凝膠電泳與微量紫外分光光度計檢驗合格的DNA置于-20 ℃中暫存，備用。

1.3.2 鲊廣椒樣品的高通量測序

以提取到的鲊廣椒樣品總DNA為模板，使用加入了成對堿基核苷酸標簽的338F/806R引物，參照王玉榮等[14]的PCR擴增體系和擴增條件對鲊廣椒樣品中的細菌16S rRNA V3～V4區(qū)進行PCR擴增。使用的引物為：338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)。將擴增產(chǎn)物用15 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測合格后的PCR擴增產(chǎn)物在Illumina MiSeq PE300高通量測序平臺進行高通量測序。

1.3.3 序列拼接和質(zhì)量控制

參照王玉榮等[15]的方法對下機后的數(shù)據(jù)進行拼接和質(zhì)控，去除不合格的序列(重疊區(qū)堿基數(shù)≤10 bp，引物錯配數(shù)≥2 bp且去除引物后序列長度≤50 bp的序列)后，使用質(zhì)控后的優(yōu)質(zhì)序列進行生物信息學分析。

1.3.4 生物信息學分析

參照郭壯等[16]的方法，對質(zhì)控后的序列在QIIME分析平臺進行生物信息學分析。首先將序列進行標準比對和對齊，分別以100%和97%相似度進行兩步UCLUST劃分，從而建立分類操作單元(operational taxonomic units，OTU)；接下來剔除含有嵌合體的OTU序列，選取代表性序列在GREENGENE和RDP數(shù)據(jù)庫中進行同源性比對，從而在門、綱、目、科和屬水平上對樣品中的細菌進行解析；計算Chao1指數(shù)、Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)從而對樣品中微生物的多樣性和豐度進行評價。

1.3.5 鲊廣椒中乳酸菌的分離純化

取10 g鲊廣椒樣品，移入含90 mL無菌生理鹽水的三角瓶，然后充分振蕩混勻。將樣品做10倍的梯度稀釋。完成后，吸取50～100 μL的樣品稀釋液(稀釋度為10-3、10-4、10-5)均勻的涂布于碳酸鈣質(zhì)量濃度為10 g/L的MRS固體平板上，置于30 ℃厭氧工作站[V(N2)∶V(CO2)∶V(H2)=85∶10∶5]中培養(yǎng)72 h。隨后挑選大小、顏色、形態(tài)均不相同且有透明圈的單菌落進行至少3 次劃線純化，并將革蘭氏陽性，過氧化氫酶陰性的乳酸菌使用含有30%(體積分數(shù))甘油的MRS液體培養(yǎng)基重懸，然后凍存于-80 ℃超低溫冰箱，待用。

1.3.6 鲊廣椒中乳酸菌的鑒定

使用CTAB法提取乳酸菌的DNA[17]，參照郭壯等[18]的擴增方法進行PCR擴增，并對擴增產(chǎn)物進行檢測、清潔、連接、轉(zhuǎn)化和克隆子的鑒定，挑選出陽性克隆子送至武漢天一輝生物有限公司進行測序。將返回來的測序序列用軟件DNAMAN拼接，手動去引物后，在美國國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)數(shù)據(jù)庫中進行BLASTn比對，選取序列相似度≥99%的16S rRNA模式菌株序列，使用軟件MEGA 5.0中的鄰接法(neighbor joining，NJ)構建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定分離到的乳酸菌的系統(tǒng)分類地位。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

使用軟件MEGA 5.0中的NJ構建系統(tǒng)發(fā)育樹，并用Adobe Illustrator軟件導出系統(tǒng)發(fā)育進化樹；采用相關性分析法對鲊廣椒樣品中平均相對含量>1.0%的優(yōu)勢細菌門和屬進行相關性研究；使用R軟件(v3.5.3)和軟件Origin 2017繪圖。

2 結果與分析

2.1 洪湖鲊廣椒細菌多樣性指數(shù)分析

本研究采集了7份洪湖鲊廣椒樣品，通過Illumina Miseq高通量測序技術對洪湖鲊廣椒樣品細菌多樣性進行了解析。通過生物信息學技術對鲊廣椒樣品的細菌多樣性分析結果如表1所示。

表1 洪湖鲊廣椒樣品的測序數(shù)量與細菌多樣性分析Table 1 Sequencing quantity and bacterial diversity analysis of Honghu Zha-chili

由表1可知，高通量測序共產(chǎn)生了259 663 條高質(zhì)量序列，平均每個樣品37 095條。按照100%和97%相似度對序列進行劃分且去除嵌合體后共得到8 398個OTU。HH6樣品的Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)均最大，分別為1 195和7.03，由此可見，HH6樣品細菌微生物的豐富度最大且多樣性最高，細菌群落結構組成可能最為復雜。

2.2 洪湖鲊廣椒細菌群落結構分析

在對樣品序列豐富度和多樣性分析的基礎上，進一步對質(zhì)控合格的序列進行了鑒定，共鑒定出36個門，96個綱，137個目，204個科和403個屬，其中僅有0.11%和6.02%的序列鑒定不到門和屬水平。將本研究的鲊廣椒樣品中平均相對含量>1.0%的門和屬定義為優(yōu)勢門和優(yōu)勢屬，鲊廣椒樣品中平均相對含量>1.0%的優(yōu)勢細菌門組成如圖1所示。

圖1 洪湖鲊廣椒中的優(yōu)勢細菌門Fig.1 Dominant phylum in Honghu Zha-chili

由圖1可知，鲊廣椒樣品中細菌平均相對含量>1.0%的細菌門有4個，分別是硬壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和放線菌門(Actinobacteria)，其平均相對含量分別為77.78%、18.09%、1.74%和1.51%。值得一提的是，硬壁菌門在樣品HH3、HH4和HH7中較高，相對含量分別為98.71%、98.40%和99.49%。洪湖鲊廣椒中的共有優(yōu)勢菌門為硬壁菌門、變形菌門和放線菌門，累計平均相對含量超過了97.38%。

同樣的，本研究在屬的分類水平上對鲊廣椒樣品中的細菌進行了分析，結果如圖2所示。

圖2 洪湖鲊廣椒中的優(yōu)勢細菌屬Fig.2 Dominant bacteria genera in Honghu Zha-chili

由圖2可知，洪湖鲊廣椒中優(yōu)勢細菌屬共有7個，分別是隸屬于硬壁菌門的乳桿菌屬(Lactobacillus)和海洋芽孢桿菌屬(Oceanobacillus)，其平均相對含量分別為67.97%和3.88%；隸屬于變形菌門的鹽單胞菌屬(Halomonaas)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、雷爾氏菌屬(Ralstonia)、假單胞菌屬(Pseudomonas)和草螺菌屬(Herbaspirillum)，平均相對含量分別為3.47%、1.83%、1.75%、1.53%和1.02%。乳桿菌屬在樣品HH1、HH3、HH4和HH7中含量最高，相對含量均超過了85%。由此可見，洪湖鲊廣椒樣品中主要的細菌是隸屬于硬壁菌門的乳桿菌屬。

本研究中的高通量測序數(shù)據(jù)共產(chǎn)生了8 398個OTU，進一步對平均相對含量>1.0%的優(yōu)勢OTU進行了分析。平均相對含量>1.0%的OTU如圖3所示。

由圖3可知，洪湖鲊廣椒樣品中含12個平均相對含量>1.0%的OTU，分別是OTU3336、OTU4099、OTU5847、OTU1749、OTU357、OTU2214、OTU5962、OTU1973、OTU7126、OTU7065、OTU6541和OTU4775，其平均相對含量分別為3.30%、1.20%、1.60%、1.66%、1.80%、2.01%、2.89%、3.75%、5.31%、8.12%、8.78%和12.83%。經(jīng)序列比對分析發(fā)現(xiàn)，OTU3336隸屬于鹽單胞菌屬；OTU4099隸屬于海洋芽孢桿菌屬；OTU5847隸屬于雷爾氏菌屬；OTU1749、OTU357、OTU2214、OTU5962、OTU1973、OTU7126、OTU7065、OTU6541和OTU4775隸屬于乳桿菌屬。由此可見，基于屬水平及OTU水平的分析均表明，乳桿菌屬仍然是洪湖地區(qū)鲊廣椒樣品中的優(yōu)勢細菌。

圖3 平均相對含量大于1.0%的OTU方塊圖Fig.3 OTU block diagram with average relative content greater than 1.0%

乳酸桿菌最初在1986年被描述，到2019年為止一共建立了289個種水平的分類單元[19]。乳酸桿菌被認為是安全的，可用于食品行業(yè)的微生物中，乳酸桿菌占了很大比例。在當陽[20]、恩施[21]、荊州[22]等多個地區(qū)的鲊廣椒中，乳桿菌屬都是優(yōu)勢屬，可能對食品的滋味和風味形成具有重要影響[13,23]。洪湖鲊廣椒中乳酸桿菌對其特色風味物質(zhì)的作用仍有待于進一步研究。

2.3 乳酸菌的分離與系統(tǒng)分類

由高通量測序可知，洪湖鲊廣椒樣品中的乳酸菌以乳酸桿菌為主，而乳酸桿菌在食品等領域具有重要的應用價值，因此接下來對洪湖鲊廣椒中的乳酸菌進行了分離與鑒定。本研究使用碳酸鈣含量為10 g/L的MRS平板對洪湖鲊廣椒樣品中的乳酸菌進行了分離，并使用平板劃線法進行純化。將具有透明圈，革蘭氏染色為陽性，且過氧化氫酶陰性的菌株初步判定為乳酸菌[24]。從7份洪湖鲊廣椒樣品中共分離出29 株疑似乳酸菌菌株，均是桿菌，其特征描述見表2。

表2 洪湖鲊廣椒樣品來源的乳酸菌菌落形態(tài)Table 2 Colony morphology of lactic acid bacteria from Honghu Zha-chili

本研究對獲得的29 株疑似乳酸菌進行了基因組DNA提取，細菌16S rRNA基因的PCR擴增、TA克隆與測序，將返回來的序列經(jīng)手動拼接和去引物后，通過NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLASTn比對。選取序列相似度達到99%以上的16S rRNA模式序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹，基于16S rRNA基因序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖4所示。

由圖4可知，菌株HBUAS56267、HBUAS56268、HBUAS56272、HBUAS56274、HBUAS56276、HBUAS56279、HBUAS56280和HBUAS56282與模式菌株LactobacillusfutsaiiJCM 17355的系統(tǒng)發(fā)育關系最近，其16S rRNA序列相似度超過了99%，被鑒定為福萊乳桿菌(L.futsaii)；菌株HBUAS56258、HBUAS56259和HBUAS56260與模式菌株LactobacilluszhachiliiHBUAS52074的系統(tǒng)發(fā)育關系最近，被鑒定為鲊廣椒乳桿菌(L.zhachilii)；菌株HBUAS56257和HBUAS56275與模式菌株L.paralimentariusJCM 10415的在系統(tǒng)發(fā)育樹上形成了一個分支，被鑒定為類消化乳桿菌(L.paralimentarius)；菌株HBUAS56264、HBUAS56266和HBUAS56286與模式菌株L.alimentariusDSM 20249的系統(tǒng)發(fā)育關系最近，被鑒定為消化乳桿菌(L.alimentarius)；菌株HBUAS56256、HBUAS56261、HBUAS56262、HBUAS563、HBUAS56269、HBUAS56270、HBUAS56273、HBUAS56277、HBUAS56278和HBUAS56284被鑒定為植物乳桿菌(L.plantarum)；菌株HBUAS56265與模式菌株PediococcusethanoliduransZ9位于系統(tǒng)發(fā)育樹的同一分支上，因而被鑒定為耐乙酸片球菌(P.ethanolidurans)；菌株HBUAS56271與模式菌株L.acidipiscisNBRC 102163的系統(tǒng)發(fā)育關系最近，被鑒定為酸魚乳桿菌(L.acidipiscis)；菌株HBUAS5628被鑒定為綠色魏斯氏菌(Weissellaviridescens)。

圖4 基于16S rRNA序列的洪湖鲊廣椒來源的乳酸菌鄰接法系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 NJ phylogenetic tree of lactic acid bacteria from Honghu Zha-chili based on 16S rRNA sequence

總的來說，本研究從洪湖鲊廣椒樣品中共分離出來29株乳酸菌，鑒定為3個屬和8個種，其中有植物乳桿菌(L.plantarum)10 株，福萊乳桿菌(L.futsaii)有8株，分別占總分離菌株數(shù)的34.48%和27.59%。因此，洪湖地區(qū)鲊廣椒中除植物乳桿菌外，還含有較高比例的福萊乳桿菌(L.futsaii)，可能是洪湖地區(qū)鲊廣椒的特色細菌類群，而該結果與鄧風[25]、雷炎[21]與葛東穎等[22]對鲊廣椒的研究結果并不一致。

3 結論

本研究采用Illumina Miseq高通量測序技術結合傳統(tǒng)可培養(yǎng)方法對7 份洪湖地區(qū)鲊廣椒樣品中乳酸菌多樣性進行了解析。研究發(fā)現(xiàn)，硬壁菌門、變形菌門、擬桿菌門和放線菌門是洪湖鲊廣椒的優(yōu)勢細菌門；乳桿菌屬、海洋芽孢桿菌屬、鹽單胞菌屬、不動桿菌屬、雷爾氏菌屬、假單胞菌屬和草螺菌屬是洪湖鲊廣椒的優(yōu)勢細菌屬，其中乳桿菌屬含量最高。此外，研究發(fā)現(xiàn)從洪湖鲊廣椒樣品中分離出來的29 株乳酸菌中植物乳桿菌有10株，福萊乳桿菌有8株，分別占總分離菌株數(shù)的32.26%和25.81%，后者可能為洪湖鲊廣椒樣品中的特色優(yōu)勢菌群。