徐 晴，楊翰文，王思齊，陳啟艷，張 玲*

（1．錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，遼寧 錦州 121001；2．錦州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧 錦州 121001）

鼠傷寒沙門氏菌（Salmonellatyphimurium，STM）屬于人、畜共患病原菌。由STM所引發(fā)的大規(guī)模食物中毒事件在國內(nèi)外均有發(fā)生[1]。雖然STM感染健康成年人所引起的癥狀多為自限性，較易控制和治療，但對于免疫功能尚未發(fā)育完全的幼兒、免疫力與身體機(jī)能下降的老人和免疫系統(tǒng)受損的病人來說，感染STM卻有致命性[2]。黃芩素，化學(xué)名稱5，6，7-三羥基黃酮，又名百可利（baicalein），是植物黃芩（Scutellaria radix）中含量最高的黃酮類化合物之一。研究表明，黃芩素具有較強(qiáng)的抗微生物[3]、抗炎、抗氧化[4]、抗腫瘤[5]、保護(hù)心血管系統(tǒng)等作用[6]，對大腸桿菌、尖孢鐮刀菌、白色念珠菌等有顯著的抑制作用[7-8]。本課題組前期體外研究發(fā)現(xiàn)，黃芩素對STM有顯著抑制作用[9]。本試驗(yàn)觀察黃芩素對感染STM小鼠的影響，為抗STM感染提供新的治療方案，為豐富該藥的藥理作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株

鼠傷寒沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)株（ATCC14028）購自中國醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏中心（National Center for Medical Culture Collection，CMCC）。

1.1.2 試驗(yàn)試劑

黃芩素（批號：20190820）購自西安開來生物工程有限公司（純度為98%），取適量甲醇溶解、蒸餾水稀釋，超凈臺內(nèi)過濾后備用；亞硒酸鹽胱氨酸增菌液（SC）與SS瓊脂培養(yǎng)基購自青島海博生物技術(shù)有限公司；TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8 ELISA檢測試劑盒購自安諾倫（北京）生物科技有限公司。

1.1.3 試驗(yàn)動物

健康昆明小鼠，雌、雄各半，體重 26～28 g，購自錦州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究中心。

1.1.4 試驗(yàn)儀器與設(shè)備

SW-CJ-2F雙人雙面超凈工作臺購自蘇州凈化設(shè)備有限公司；THZ-300恒溫培養(yǎng)搖床購自上海一恒科技有限公司；酶標(biāo)儀購自美國伯樂iMark公司；精密電子天平購自Sartorius公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 STM懸液制備

將鼠傷寒沙門氏菌接種于SC培養(yǎng)基中，恒溫?fù)u床培養(yǎng)12 h，劃線在SS瓊脂平板上。恒溫培養(yǎng)后，挑取典型STM菌落，再次接種于液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)。次日用PBS調(diào)整菌液濃度至OD600nm處吸光值為1.7，離心、洗滌、備用。

1.2.2 試驗(yàn)動物分組

健康昆明小鼠80只，飼養(yǎng)環(huán)境保持安靜，通風(fēng)良好，自由采食、飲水。經(jīng)1周適應(yīng)性飼養(yǎng)后，隨機(jī)分為4組，每組20只?？瞻捉M、STM組、黃芩素+STM組和黃芩素組。分組后第1 d，空白組和黃芩素組小鼠灌服生理鹽水（NS）0.2 mL/只，其余2組小鼠灌服濃度為1×107CFU鼠傷寒沙門氏菌液0.2 mL/只，灌胃后2 h恢復(fù)飼料和飲水的供應(yīng)。第2 d，空白組和STM組小鼠3次/d灌服NS，每次0.2 mL/只；黃芩素+STM組和黃芩素組小鼠按20 mg/kg灌服黃芩素，3次/d。連續(xù)灌胃10 d后，觀察各組小鼠存活情況，計算各組存活率。

1.2.3 血清細(xì)胞因子的測定

摘除小鼠眼球收集血液于1.5 mL離心管中，室溫靜置1～2 h；3 000 r/min離心10 min，吸取上清，迅速移至-80 ℃保存?zhèn)溆?。按照ELISA試劑盒說明書檢測血清中的細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6 和IL-8的水平。

1.2.4 臟器指數(shù)的測定

小鼠斷頸處死，去盡肝臟和脾臟表面的結(jié)締組織，稱量臟器重量，計算各臟器指數(shù)。

1.2.5 組織切片的制備

剪取小塊肝臟和脾臟組織，PBS清洗，置于4%多聚甲醛中，室溫固定，常規(guī)石蠟包埋和HE染色。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃芩素對鼠傷寒沙門氏菌感染小鼠存活率的影響（見圖1）

空白組和黃芩素組小鼠生長狀態(tài)良好、毛發(fā)光澤順滑、精神狀態(tài)活潑、進(jìn)食量正常、未見死亡。STM組小鼠感染后，小鼠毛發(fā)凌亂無光澤、精神萎靡不振且嗜睡、進(jìn)食量明顯減少，并于感染后第5 d開始出現(xiàn)死亡。由圖1可知，5～10 d的存活率分別是80%、70%、60%、45%、30%和25%。黃芩素+STM組小鼠毛發(fā)凌亂無光澤、精神萎靡、進(jìn)食量略微減少，第7 d開始出現(xiàn)死亡。由圖1可知，7～ 10 d的存活率分別是90%、75%、65%和60%。

2.2 黃芩素對感染小鼠血清炎性因子的影響（見表1）

表1 黃芩素對感染小鼠血清中炎性因子的影響（n=5）Tab.1 The effect of baicalein on inflammatory factors in the serum of infected mice 單位：ng/L

由表1可知，STM組的4種炎性因子水平均較空白 組有顯著提高（P＜0.01）；黃芩素+STM組中的炎性因子水平均極顯著低于STM組（P＜0.01）；而黃芩素組的炎性因子水平與空白組無顯著性差異（P＞0.05）。

2.3 黃芩素對感染小鼠臟器指數(shù)的影響（見表2）

由表2可知，STM組中小鼠的肝臟和脾臟指數(shù)極顯著低于空白組（P＜0.01）；黃芩素+STM組的肝臟和脾臟指數(shù)顯著高于STM組（P＜0.05），但與空白組仍有差異（P＜0.05或P＜0.01）；黃芩素組的2個臟器指數(shù)與空白組無顯著差異（P＞0.05）。

表2 黃芩素對感染小鼠臟器指數(shù)的影響（n=5）Tab.2 The effect of baicalein on the organ index of infected mice 單位 ：%

2.4 黃芩素對感染小鼠肝臟和脾臟組織的學(xué)影響（見圖2、圖3）

由圖2可知，空白組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝竇清晰、較寬，肝上皮細(xì)胞排列整齊、呈多邊形，細(xì)胞質(zhì)均勻紅染、細(xì)胞核清晰；STM組可見一膿腔、肝細(xì)胞排列紊亂、細(xì)胞核固縮、細(xì)胞質(zhì)部分區(qū)分不明顯、肝小葉內(nèi)見小壞死灶、有的呈無結(jié)構(gòu)均質(zhì)紅染、中央靜脈和竇狀隙擴(kuò)張、有充血出血，竇狀隙內(nèi)有中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞浸潤。與STM組相比，黃芩素+STM組肝小葉結(jié)構(gòu)相對完整、細(xì)胞變性數(shù)量及程度逐漸降低、肝小葉內(nèi)壞死灶數(shù)量減少、壞死程度減輕、中央靜脈和竇狀隙擴(kuò)張程度減??；黃芩素組的肝臟組織結(jié)構(gòu)與空白組類似。

由圖3可知，空白組小鼠的脾臟被膜和小梁結(jié)構(gòu)完整、紅髓和白髓界限清晰、細(xì)胞形態(tài)大小正常；與空白組相比，模型組脾臟的被膜明顯增厚、脾小梁增寬、髓質(zhì)區(qū)可見明顯淀粉樣物質(zhì)沉積、白髓面積明顯減少、紅髓內(nèi)有相當(dāng)程度的淋巴細(xì)胞彌漫性增生和浸潤現(xiàn)象；與模型組相比，黃芩素+STM組的脾臟被膜變薄、脾小梁變窄、白髓大小和形態(tài)接近正常、組織間隙有大量血細(xì)胞；黃芩素組的脾組織形態(tài)與空白組接近。

3 討論

STM主要存在于動物機(jī)體消化道內(nèi)，通過糞便可在動物之間、動物和人之間廣泛傳播。近年來，由于抗菌藥物的大范圍使用，多重耐藥株的出現(xiàn)已成為臨床治療STM感染面臨的嚴(yán)峻問題[10]。目前，尚未見到細(xì)菌對中藥抗菌成分出現(xiàn)耐藥性的報道。因此，尋找抗STM的有效中藥為該病的防治提供新思路。本試驗(yàn)結(jié)果表明，黃芩素對STM感染的小鼠具有很好的治療效果。

作為活化細(xì)胞產(chǎn)生的小分子多肽類物質(zhì)，TNF-α是參與機(jī)體免疫應(yīng)答和炎性反應(yīng)的重要介質(zhì)[11]。IL-1則是由單核細(xì)胞產(chǎn)生的多肽，可分為IL-1α和IL-1β兩種異構(gòu)體。IL-1β廣泛參與組織破壞、水腫形成等多種病理損傷過程[12]。IL-6是機(jī)體受到炎癥刺激后，由單核巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、T細(xì)胞核內(nèi)皮細(xì)胞等分泌的糖蛋白，具有多種生物學(xué)效應(yīng)，也是導(dǎo)致機(jī)體組織或器官嚴(yán)重?fù)p傷的重要因子[13]。IL-8屬于一種炎癥趨化因子，可促進(jìn)嗜中性多形核白細(xì)胞與其結(jié)合，釋放出大量氧自由基和溶酶體，繼而誘發(fā)炎癥反應(yīng)[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，與空白組相比，STM使感染小鼠的存活率明顯下降，小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的含量明顯增高，臟器指數(shù)則顯著降低（P＜0.01），肝臟和脾臟組織呈現(xiàn)明顯的病理改變。與STM組相比，黃芩素使感染小鼠的存活率明顯升高，小鼠血清中炎性因子水平顯著降低，臟器指數(shù)顯著提高（P＜0.05），肝臟和脾臟的病理變化有明顯改善。上述結(jié)果說明，黃芩素可通過降低炎性因子水平、改善肝臟和脾臟的病理變化提高感染STM小鼠的存活率。黃芩素組的各項指標(biāo)均與空白組接近，且無統(tǒng)計學(xué)差異，說明黃芩素對正常小鼠無影響。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)研究表明，黃芩素對STM感染小鼠的存活率、炎性因子水平、臟器指數(shù)、肝臟和脾臟的組織變化均有改善作用。