陳廣勇，韓乾杰，張玲玲，李 慧，楊彩梅,*

（1.浙江農林大學動物科技學院·動物醫(yī)學院，浙江省畜禽綠色生態(tài)健康養(yǎng)殖技術研究重點實驗室，動物健康互聯網檢測技術浙江省工程實驗室，浙江杭州 311300；2.浙江惠嘉生物科技股份有限公司，浙江安吉 311703）

植物多糖是從天然植物中提取的生物高分子活性物質，具有調節(jié)動物機體免疫、抑菌抗病毒和恢復其腸道上皮細胞的活力等作用[1]。人參多糖（Ginseng Polysaccharide，GPS）是人參根莖提取人參皂甙后剩余部分中提煉而來，對于患有輪狀病毒的小鼠，GPS 能夠減輕其癥狀，且使受到損傷腸道上皮恢復正常功能[2]。飼糧中添加植物多糖能改善斷奶仔豬的生長速度，增強細胞免疫和體液免疫功能和Thl 類細胞因子（IL-2、IFN-γ）和Th2 類細胞因子的分泌量，逆轉免疫抑制[3]。GPS 可以改善大鼠抗生素相關腹瀉結腸組織結構變化并且改善炎性腸病結腸損傷，改善硫酸葡聚糖鈉（DextranSulphate Sodium，DSS）造成的結腸炎性水平[4]。GPS能夠改善創(chuàng)傷性膿毒癥患者的免疫功能，抑制或減輕炎性反應[5]。目前，GPS 對于抗炎和免疫調節(jié)的影響雖有一定研究，但關于在應激條件下GPS 對細胞及免疫調節(jié)相關信號通路的作用機理尚不清楚。本試驗旨在研究在LPS 刺激條件下，GPS 對應激小鼠巨噬細胞形態(tài)及免疫功能的影響，為GPS 在免疫調節(jié)和緩解炎癥方面的作用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 GPS 市購，含量90%，其余10% 為輔料麥芽糊精，主要由葡萄糖、果糖和甘露聚糖等組成；細菌脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS，來源于大腸桿菌，血清型O55:B5）購自于美國Sigma 公司。小鼠單核巨噬細胞（RAW264.7）購于中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所基礎醫(yī)學細胞中心。

酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）、乳酸脫氫酶（LDH）、白介素-1β（IL-1β）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）試劑盒均購自南京建成生物科技有限公司。

1.2 RAW264.7 細胞培養(yǎng) 參考許丹等[6]方法，培養(yǎng)RAW264.7 細胞，進行計數并觀察細胞形態(tài)。

1.3 LPS 誘導RAW264.7 細胞炎癥模型的建立 根據李淑玲[7]的研究進行LPS 濃度范圍探索，分別配制0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0 μg/mL LPS 溶液，分別刺激RAW264.7 細胞，在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，每個組別設置6 個重復，試驗終劑量為500 μL。觀察細胞形態(tài)記錄細胞數量，并且檢測其LDH 活性，隨著LPS 濃度升高到1.0 μg/mL，LDH 不發(fā)生明顯變化，因此選取1.0 μg/mL LPS 濃度用于RAW264.7 細胞炎癥模型。

1.4 GPS 對RAW264.7 細胞形態(tài)的影響 試驗設置1 個CON 組（對照組）及LPS 組（1 μg/mL LPS）；GPS 組（1 μg/mL LPS+1 mg/mL GPS）2 個試驗組，每組6 個重復。各組均使用無抗細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)。LPS 組和GPS 組加250 μL 的LPS 刺激培養(yǎng)1 h 后，再添加250 μL GPS溶液，空白對照組添加等量細胞處理液，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。觀察細胞形態(tài)并進行顯微拍照。

1.5 GPS 對細胞生物酶活性和細胞促炎癥因子分泌功能的影響 試驗分為CON 組（對照組）、LPS 組（1 μg/mL LPS）、1 mg/mL GPS 組（1 μg/mL LPS+1 mg/mL GPS）、0.5 mg/mL GPS 組（1 μg/mL LPS+0.5 mg/mL GPS）、0.1 mg/mL GPS 組（1 μg/mL LPS+0.1 mg/mL GPS）5 個組，每組6 個重復。LPS 組、1 mg/mL GPS組、0.5 mg/mL GPS 組和0.1 mg/mL GPS 組添加250 μL的LPS 刺激培養(yǎng)1 h 后，GPS 組分別添加250 μL 不同濃度的GPS 溶液，CON 組和LPS 組添加細胞處理液至500 μL，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)12、24、48 h。取細胞上清液，檢測LDH、AKP、ACP、TNF-α、IL-1β含量。

1.6 GPS 對炎癥細胞TLR4 信號通路基因表達量的影響試驗分為4 個組，每組6 個重復。CON（對照組）采用500 μL 細胞培養(yǎng)液處理24 h，不采用LPS 刺激；GPS對照組采用500 μL 濃度為1 mg/mL 的GPS 培養(yǎng)液處理24 h；LPS 組采用250 μL 濃度為1 μg/mL 的LPS 刺激1 h，再添加250 μL 細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)23 h。參考戴先成等[8]的方法，用實時定量RT-PCR 方法測定TLR-4、NFκB、MyD88的mRNA 水平。參考韓乾杰[9]的方法，設計引物序列如表1，由杭州尚亞生物科技有限公司合成和驗證。

表1 實時熒光定量PCR 引物

1.7 統(tǒng)計分析 數據采用SPSS 21.0 軟件進行統(tǒng)計分析，使用單因子方差分析（One-Way ANOVA，LSD），以P＜0.05 表示差異顯著。

2 結果

2.1 GPS 對LPS 刺激巨噬細胞形態(tài)的影響 由圖1 可見，在培養(yǎng)1 h 后，LPS 刺激組培養(yǎng)1 h 后RAW264.7細胞較輕程度的變形。在培養(yǎng)24 h 后，CON 組的RAW264.7 細胞形態(tài)與1 h 前無顯著差異，均為橢球狀且24 h 后增殖能力良好；LPS 組細胞數量顯著降低，細胞形態(tài)不規(guī)則，細胞膜破損導致細胞液外泄。LPS 刺激后添加GPS，細胞形態(tài)、細胞增殖能力恢復至正常水平，與未添加GPS 差異顯著。

圖1 GPS 對LPS 刺激巨噬細胞形態(tài)的影響

2.2 GPS 對LPS 刺激巨噬細胞生物酶活性的影響 由表2 可得，LPS 處理后12、24、48 h，LPS 組的LDH 值均顯著高于空白對照組。與LPS 組相比，添加GPS 后LDH 值均顯著降低。

LPS 處理后的RAW264.7 細胞ACP 活性在12、24、48 h 均低于對照組（P＜0.05）。添加GPS 能夠提高巨噬細胞ACP 活性（P＜0.05）。LPS 誘導刺激后的RAW264.7 細胞分泌AKP 含量在12、24 h 均顯著低于對照組。高劑量GPS 組在12、24、48 h AKP 含量均高于LPS 組和對照組（P＜0.05）。

2.3 GPS 對LPS 刺激巨噬細胞炎癥因子分泌的影響 由表3 可知，RAW264.7 細胞在LPS 刺激下分泌的IL-1β和TNF-α水平升高（P＜0.05），在48 h 內持續(xù)升高。GPS 能夠降低RAW264.7 受到LPS 刺激分泌促炎癥因子IL-1β和TNF-α的水平（P＜0.05）。相同時間內，GPS 濃度越高，促炎癥因子降低越顯著。

2.4 GPS 對LPS 刺激巨噬細胞TLR4 信號通路相關基因的影響 由表4 可知，當給予LPS 誘導刺激后，RAW 264.7 細 胞TLR4、MyD88、NF-κB的mRNA 表達量相較于對照組顯著升高。添加GPS mRNA 表達量均較LPS 組顯著降低。

表3 GPS 對LPS 刺激巨噬細胞炎癥因子含量的影響 ng/L

表4 GPS 對LPS 刺激巨噬細胞信號通路相關基因mRNA 表達量的影響

3 討 論

巨噬細胞屬免疫細胞，通過非特異性識別抗原物質，對病原體進行吞噬作用，誘導免疫應激，產生抗原遞呈，從而激活機體的免疫系統(tǒng)，實現免疫細胞對抗原分子識別、活化、增殖和分化，啟動免疫應答[10]。

LPS 是一個由類脂A 和纖維素構成的生物大分子，其中類脂A 是LPS 的毒性和生物活性中心，它由2 個葡萄胺、磷酸鹽和一定量的脂肪酸構成，其分子量在10 000 以上[11]。LPS 是革蘭氏陰性菌細胞壁特有的化學成分，是一種免疫激活劑，作用于動物細胞時會表現炎癥反應[12]。正常情況下巨噬細胞可以通過各種刺激從靜息狀態(tài)到免疫反應激活[13]。任琳等[14]研究表明，LPS 刺激巨噬細胞，誘導其分泌大量的炎癥因子，過量的炎癥因子會加速巨噬細胞的非程序性死亡，引起免疫應激。多糖對機體的免疫調控作用主要為激活巨噬細胞、激活網狀內皮細胞、激活T 細胞和B 細胞、激活補體、促進干擾素的生成、促進白細胞介素的生成等[15-16]。

Xu 等[17]研究發(fā)現黃芪多糖納米顆粒對LPS 處理的H9c2 細胞形態(tài)起到保護作用。本研究發(fā)現當用LPS刺激單核巨噬細胞后，巨噬細胞會發(fā)生形態(tài)的改變；添加GPS 可直接作用于免疫細胞，修復細胞的形態(tài)，細胞恢復卵圓形，改善細胞膜破損，減少細胞液外溢，可顯著發(fā)揮抗炎作用。

LDH 是巨噬細胞活化的標志之一，它對巨噬細胞的吞噬作用有直接影響，吞噬過程需要糖酵解的能量，而激活LDH 可以加速糖酵解過程[18]。李異等[19]以LPS 刺激新生大鼠心肌細胞，發(fā)現LPS 能降低心肌細胞存活率，促進LDH 釋放，表明LPS 刺激導致了心肌細胞損傷，LDH 含量升高表明細胞損傷程度增大。尹俊等[20]試驗發(fā)現柴胡多糖可呈濃度依賴性增強細胞活力，LDH 含量顯著降低，說明柴胡多糖對心肌損傷具有保護作用。本研究發(fā)現GPS 顯著降低由于LPS 誘導產生的LDH，對于LPS 刺激的RAW264.7 形態(tài)改變細胞膜破損有較好的改善效果。

ACP 和 AKP 是2 種重要的機體功能調節(jié)酶，ACP廣泛分布于生物界，是一種磷酸酯酶，大量研究表明磷酸酶活力是細胞和體液免疫的綜合體現，也是衡量免疫功能和機體狀態(tài)的指標，反映了機體對外源微生物侵染的防御能力[21]。Millar 等[22]研究發(fā)現，在蛋白（酶）的去磷酸化過程中，ACP 和 AKP 可能共同參與了細胞的增殖啟動。本研究發(fā)現APS 能夠提高ACP 和AKP的活性，增強了巨噬細胞對外源微生物侵染的防御能力。

由于巨噬細胞擁有Toll 樣受體和清道夫受體，它們對凝集素、脂蛋白、蛋白質、寡核苷酸、多糖和其他分子具有廣泛的配體特異性。另一方面，巨噬細胞在其膜上表達主要的組織相容性復合物（MHC）II 類分子，因此也向淋巴細胞呈遞抗原。所以巨噬細胞是最早與這些入侵者接觸的一些細胞，啟動針對微生物的免疫反應。研究表明誘導免疫細胞分泌多種細胞因子的基因轉錄的關鍵信號通路為TLR4/NF-κB[23]。Kim 等[25]研究發(fā)現，與免疫抑制劑環(huán)磷酰胺治療組相比，刺松藻和紅參提取物混合物大大增加了iNOS、COX-2、TLR-4、IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-γ等免疫相關基因的表達。本研究發(fā)現，LPS 刺激后TLR4、MyD88和NF-κBmRNA 的轉錄量明顯上升，啟動免疫應激，而添加GPS 能緩解免疫應激，降低TLR4、MyD88和NF-κBmRNA 的轉錄量。

Evgenikos 等[26]研究發(fā)現，TLR4的轉錄受到來自IL-1β正反饋，促炎癥因子被免疫細胞大量分泌，炎癥反應開始加劇，中性粒細胞和白細胞同時作用于腸道，加劇炎癥反應。Wu 等[27]研究發(fā)現，由LPS 刺激后巨噬細胞后，添加平菇多糖能夠顯著降低LDH、IL-1β和TNF-α水平，降低免疫應激。TNF-α是巨噬細胞應激時產生的小分子蛋白，具有炎癥介質作用。IL-1β和TNF-α水平伴隨炎癥反應加劇不斷升高，可以用來判斷炎癥反應程度。Spielmann 等[28]研究發(fā)現，患有潰瘍性結腸炎患者血清中的TNF-α含量升高。Caillot 等[29]研究發(fā)現LPS 處理巨噬細胞誘導NF-κB 表達顯著上升，黑莓多糖能夠顯著降低其表達，并且減少TNF-α和IL-1β分泌。本試驗發(fā)現，LPS 刺激巨噬細胞，促進TNF-α和IL-1β的分泌增加，導致炎癥反應加劇，GPS 通過降低TLR4、MyD88和NF-κBmRNA 的轉錄量從而減少免疫相關基因促炎癥因子 IL-1β和TNF-α水平，減少炎癥反應，緩解過量應激給機體帶來的損傷。

4 結 論

本研究結果顯示，添加GPS 可以改善LPS 刺激的小鼠巨噬細胞（RAW264.7）的細胞形態(tài)，恢復細胞增殖；提高ACP 和AKP 活性；減少TLR4、MyD88和NF-κB基因的轉錄，抑制促炎癥因子IL-1β和TNF-α的分泌及表達，降低免疫應激。