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GDF11對糖尿病小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞凋亡的影響及其信號機(jī)制

2021-03-01 11:44吳方麗田蕭羽郭樹琴趙立升郭紅延
武警醫(yī)學(xué) 2021年1期
關(guān)鍵詞:特異性抑制劑抗體

翟 羽,吳方麗,田蕭羽,李 爽,郭樹琴,朱 彪,趙立升,郭紅延

隨著我國經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展、生活方式西方化和人口老齡化,2型糖尿病患病率和發(fā)病率急劇上升[1]。2型糖尿病是口腔種植術(shù)的相對禁忌證,其中一個重要原因就是高血糖所致的晚期糖基化終末產(chǎn)物聚集導(dǎo)致骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone-marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)凋亡[2]。文獻(xiàn)[3]報道,生長分化因子11(growth differentiation factor 11, GDF11)能緩解2型糖尿病小鼠的胰島素抵抗,改善胰腺β細(xì)胞功能并減少β細(xì)胞凋亡[4]。而且,GDF11對2型糖尿病小鼠的這些有益作用是通過激活磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide 3-kinase, PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B, Akt)信號通路實(shí)現(xiàn)的[3-5]。但是,GDF11對2型糖尿病小鼠BMSCs細(xì)胞凋亡的影響及相關(guān)信號機(jī)制尚不清楚。因此,本課題以體外培養(yǎng)的2型糖尿病小鼠BMSCs為研究對象,探討GDF11對2型糖尿病小鼠BMSCs細(xì)胞凋亡的影響及其信號機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器 正常小鼠與糖尿病小鼠BMSCs(解放軍總醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室),重組人GDF11蛋白(北京百奧萊博),PI3K特異性抑制劑LY294002(美國Selleck),α-MEM培養(yǎng)液、胎牛血清(美國Gibco),胰酶、臺盼藍(lán)、青霉素及鏈霉素(美國Sigma),兔抗人PI3K抗體、磷酸化PI3K(p-PI3K)抗體、兔抗鼠Akt抗體、p-Akt抗體、Bax抗體、Bcl-2抗體及山羊抗兔二抗(美國Cell Signaling Technology);BCA(bicinchoninic acid)測定試劑盒(武漢博士德);PVDF(polyvinylidene fluoride)膜(美國Millipore)。

Herocell C1型CO2恒溫培養(yǎng)箱(中國潤度生物);BCM-1000A型生物凈化工作臺(蘇州安泰);5702R型低速離心機(jī)、Biophotometer核酸蛋白測定儀(德國eppendorf);DYY-7C型電泳儀、DYCZ-40型轉(zhuǎn)膜儀(北京六一儀器廠);LW300LFT型正置熒光顯微鏡(日本奧林巴斯)。

1.2 細(xì)胞分組 實(shí)驗(yàn)分組:正常小鼠BMSCs組(normal; Nor),糖尿病小鼠BMSCs組(diabetes; DB),GDF11干預(yù)組(DB+GDF11; GDF11)和PI3K/Akt信號通路抑制劑組(DB+GDF11+LY294002;LY)。復(fù)蘇細(xì)胞庫凍存的BMSCs,采用含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)1 d后,全換液。加藥后繼續(xù)培養(yǎng)3 d進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn),加藥順序:加入50 μM的LY294002[6]培養(yǎng)30 min后,加入30 g/ml GDF11[7](未標(biāo)明加藥的組別不處理)。

1.3 細(xì)胞凋亡率 取各組細(xì)胞,0.5%胰蛋白酶消化后制成單細(xì)胞懸液。然后,采用濃度為0.4%的臺盼藍(lán)染液進(jìn)行染色。9滴單細(xì)胞懸液加1滴臺盼藍(lán)染液混勻后鋪板,細(xì)胞計數(shù)儀檢測各組細(xì)胞的凋亡率。細(xì)胞凋亡率(%)=著色細(xì)胞/總細(xì)胞×100%。

1.4 Western blot檢測相關(guān)蛋白的表達(dá) 取各組細(xì)胞,PBS緩沖液沖洗3遍,然后加入細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞并提取總蛋白。測定總蛋白濃度后,各取50 μg總蛋白,上樣后進(jìn)行凝膠電泳。電泳后在220 mA, 2 h的條件下轉(zhuǎn)膜于0.2 μm的PVDF膜,室溫封閉2 h,分別滴加特異性一抗封閉過夜,再以辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗封閉2 h。最后,用化學(xué)發(fā)光劑染色、顯影并采用Image J軟件分析膠片灰度。所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1 GDF11對糖尿病小鼠BMSCs細(xì)胞凋亡率的影響 與正常小鼠BMSCs[(3.1±1.1)%]相比,糖尿病小鼠細(xì)胞BMSCs(DB組)凋亡率明顯升高[(36.2±3.3)%,P<0.05],而GDF11干預(yù)(GDF11組)顯著降低(18.9±1.9)%vs.(36.2±3.3)%,P<0.05]。當(dāng)加入PI3K特異性抑制劑LY294002后(LY組),GDF11降低凋亡率的作用顯著升高[(41.1±3.9)%vs.(18.9±1.9)%,P<0.05]。

2.2 GDF11對糖尿病小鼠BMSCs凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 如圖1與表1所示,與正常小鼠BMSCs(Nor組)相比,糖尿病小鼠細(xì)胞BMSCs(DB組)抗凋亡蛋白Bcl-2與促凋亡蛋白Bax的表達(dá)比(Bcl-2/Bax)明顯降低,而GDF11干預(yù)(GDF11組)顯著升高Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)比。當(dāng)加入PI3K特異性抑制劑LY294002后(LY組),GDF11升高Bcl-2/Bax的作用顯著降低。

圖1 各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

表1 各組細(xì)胞凋亡蛋白相對表達(dá)量

2.3 GDF11對PI3K/Akt信號通路的影響 與Nor組相比,糖尿病小鼠BMSCs細(xì)胞(DB組)p-PI3K和p-Akt的表達(dá)水平均顯著降低,而GDF11干預(yù)(GDF11組)顯著升高p-PI3K和p-Akt的表達(dá)水平,激活PI3K/Akt信號通路。而且,GDF11激活PI3K/Akt信號通路的作用可被LY294002阻斷(LY組),p-PI3K和p-Akt的表達(dá)水平均顯著降低(圖2與表2)。

圖2 GDF11對PI3K/Akt信號通路的影響

表2 各組細(xì)胞PI3K和Akt的磷酸化水平

3 討 論

本研究以糖尿病小鼠BMSCs為研究對象,發(fā)現(xiàn)GDF11能降低糖尿病小鼠BMSCs細(xì)胞凋亡率,降低促凋亡蛋白Bax的表達(dá)并提高抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá),并且GDF11的這些作用與激活PI3K/Akt信號通路有關(guān)。

細(xì)胞凋亡是在特定的信號誘導(dǎo)下,細(xì)胞內(nèi)級聯(lián)反應(yīng)被觸發(fā)所致的生理性或病理性的主動死亡過程[8]。線粒體在內(nèi)源性細(xì)胞凋亡調(diào)控中居于重要地位,許多Bcl-2家族成員如Bcl-2、Bax等都定位于線粒體膜上[9]。Bcl-2通過阻止細(xì)胞色素C從線粒體釋放來抑制凋亡;而Bax通過與線粒體上的膜通道結(jié)合促使細(xì)胞色素C的釋放來促進(jìn)凋亡[10]。由于Bcl-2能防止或延遲由γ射線、糖皮質(zhì)激素、熱休克和多種化療藥物所致的細(xì)胞凋亡,因此Bcl-2蛋白也被稱作“存活蛋白”[11],而Bax是“凋亡蛋白”。本研究發(fā)現(xiàn)GDF11既能促進(jìn)糖尿病小鼠BMSCs細(xì)胞Bcl-2蛋白的表達(dá)又能降低Bax蛋白的表達(dá),即升高Bcl-2與Bax蛋白的表達(dá)比例,從而發(fā)揮抑制糖尿病小鼠BMSCs細(xì)胞凋亡的作用。

PI3K/Akt信號通路在細(xì)胞生長、增殖、代謝、凋亡和遷移等多種生物過程中發(fā)揮重要作用[12-14]。文獻(xiàn)[15]報道稱,激活PI3K/Akt信號通路能通過減少促凋亡蛋白caspase 3、caspase 9、Bax和升高抗凋亡蛋白Bcl-2減緩細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn),GDF11不僅能提高糖尿病小鼠BMSCs細(xì)胞Bcl-2與Bax蛋白的表達(dá)比例,而且能激活PI3K/Akt信號通路。最重要的是,當(dāng)加入PI3K特異性抑制劑LY294002后,GDF11升高Bcl-2與Bax蛋白的表達(dá)比例的作用明顯減弱,而且細(xì)胞凋亡也顯著上升,這從反面證實(shí)GDF11降低糖尿病小鼠BMSCs細(xì)胞凋亡的作用至少在某種程度上與激活PI3K/Akt信號通路有關(guān)。如果同時使用Akt抑制檢測GDF11對糖尿病小鼠BMSCs細(xì)胞凋亡的影響,可以更完整地證明PI3K/Akt信號通路的重要作用,這是本文的一個局限。與我們的研究相似,文獻(xiàn)[16]報道,石斛酚抑制大鼠BMSCs細(xì)胞凋亡的作用也是通過激活PI3K/Akt信號通路實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)GDF11可在體外抑制糖尿病小鼠BMSCs細(xì)胞凋亡,并且GDF11的這種作用與激活PI3K/Akt信號通路有關(guān)。GDF11有望被開發(fā)成抑制BMSCs細(xì)胞凋亡,進(jìn)而緩解糖尿病患者種植術(shù)區(qū)骨量不足的一種新型藥物。

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