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解淀粉芽孢桿菌DF-7液體培養(yǎng)基優(yōu)化及其無菌發(fā)酵液穩(wěn)定性研究

2021-03-01 15:09敖靜李楊高曉梅劉曉輝孫玉祿
山東農(nóng)業(yè)科學(xué) 2021年12期
關(guān)鍵詞:響應(yīng)面法穩(wěn)定性

敖靜 李楊 高曉梅 劉曉輝 孫玉祿

摘要:為確定解淀粉芽孢桿菌DF-7的最優(yōu)液體培養(yǎng)基及其無菌發(fā)酵液的穩(wěn)定性,利用單因素試驗(yàn)確定了培養(yǎng)基最優(yōu)碳源為蔗糖,最優(yōu)氮源為蛋白胨,最優(yōu)無機(jī)鹽為KH2PO4;利用響應(yīng)面法得到最優(yōu)培養(yǎng)基為蔗糖29.01g/L、蛋白胨24.45g/L、KH2PO46.47g/L,在最優(yōu)培養(yǎng)條件下DF-7發(fā)酵液OD600值為2.365;DF-7無菌發(fā)酵液在40~60℃、pH值為4~8之間、紫外線照射90min及-80℃低溫條件下均有較好的穩(wěn)定性,說明DF-7無菌發(fā)酵液在耐低溫和抗紫外線方面具有較高的研究價(jià)值。

關(guān)鍵詞:解淀粉芽孢桿菌;液體培養(yǎng)基優(yōu)化;響應(yīng)面法;無菌發(fā)酵液;抑菌作用;穩(wěn)定性

中圖分類號:S182 文獻(xiàn)標(biāo)識號:A 文章編號:1001-4942(2021)12-0149-06

解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)是一類具有促生作用的植物根際細(xì)菌,在促進(jìn)作物生長、防治病害和改良土壤等方面有著重要作用[1]。有研究表明,解淀粉芽孢桿菌具有廣泛的抗菌能力,對尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)、橡膠樹褐根病菌(Phellinusnoxius)、橡膠疫霉(Phytophthoraheveae)、小孢擬盤多毛孢(Pestalotiopsismicrospora)、尖孢炭疽病菌(Colletotrichumacutatum)等多種病原真菌具有很好抑制效果,被廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物病害的防治[2-4]。

目前研究表明,解淀粉芽孢桿菌可通過產(chǎn)生脂肽類抗菌活性物質(zhì)、植物生長激素和酶類等物質(zhì)[5,6]抑制植物病原菌,預(yù)防植物病害。本研究中解淀粉芽孢桿菌DF-7是從遼寧省朝陽市喀左縣設(shè)施溫室土壤中分離所得,具有較高的抗真菌活性,本試驗(yàn)以尖孢鐮刀菌黃瓜?;停‵.oxysporumf.sp.cucumerinum)為指示菌,研究DF-7的培養(yǎng)條件和無菌發(fā)酵液的穩(wěn)定性,為開發(fā)不同劑型的微生物菌劑和生物農(nóng)藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

DF-7菌株:解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens),由遼寧省微生物科學(xué)研究院分離并保存。

病原菌:尖孢鐮刀菌黃瓜?;停‵usariumoxysporumf.sp.cucumerinum),由遼寧省微生物科學(xué)研究院分離并保存。

LB液體培養(yǎng)基[7];PDA固體培養(yǎng)基[7];立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠型號:LDZX-75KB);恒溫?fù)u床(上海世平實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司型號:SPF-2008);可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司型號:T6新悅);高速冷凍離心機(jī)(SIGMA公司型號:3K15);生化培養(yǎng)箱[中儀國科(北京)科技有限公司型號:SPX-450]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 無菌發(fā)酵液制備 取一環(huán)保存于試管中的DF-7菌株接種到100mLLB液體培養(yǎng)基中,37℃、180r/min培養(yǎng)24h得到種子液。將種子液按2%的比例接種至LB液體培養(yǎng)基中,37℃、180r/min培養(yǎng)24h[8],5000r/min離心10min,0.22μm濾膜過濾,得到無菌發(fā)酵液備用。

1.2.2 抑菌作用測定 采用牛津杯法:將1mL尖孢鐮刀菌孢子混懸液(1×106個(gè)/mL)與10mL融化冷卻至45℃左右的PDA培養(yǎng)基混合,倒入平皿中冷卻,放置牛津杯,其中加入100μL無菌發(fā)酵液,(28±1)℃培養(yǎng)24h,以不含菌的發(fā)酵液為空白對照,觀察是否有抑菌圈出現(xiàn),并測量抑菌圈大小,每個(gè)處理3次重復(fù)[9]。

1.2.3 液體培養(yǎng)基優(yōu)化單因素試驗(yàn) 以LB液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,用葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、檸檬酸鈉、玉米粉、乳糖和麥芽糖替代LB培養(yǎng)基中碳源酵母膏,替代量為20g/L。用硝酸鈉、酵母膏、蛋白胨、氯化銨、尿素、大豆蛋白胨和硫酸銨替代LB培養(yǎng)基中氮源蛋白胨,替代量為20g/L。用硫酸鎂、硫酸亞鐵、硫酸錳、硫酸鋅、磷酸二氫鉀和氯化鈣替代LB培養(yǎng)基中無機(jī)鹽氯化鈉,替代量為5g/L[10]。接種量為2%,裝液量為20%,37℃、180r/min恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)24h,測OD600值[11],每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化設(shè)計(jì) 根據(jù)培養(yǎng)基單因素試驗(yàn)結(jié)果,以O(shè)D600值為響應(yīng)值,選擇對其影響較顯著的蔗糖(A)、蛋白胨(B)和KH2PO4(C)進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn),設(shè)置試驗(yàn)為3因素3水平[12](表1)。

1.2.5 無菌發(fā)酵液活性成分穩(wěn)定性試驗(yàn) 熱穩(wěn)定性:將無菌發(fā)酵液分別置于40、60、80、100℃水浴中60min和121℃ 20min,冷卻至室溫[13]。

酸堿穩(wěn)定性:將無菌發(fā)酵液用1mol/L的HCl和NaOH調(diào)節(jié)pH值分別為2、4、6、8、10,置于冰箱4℃保存24h后[14],將pH值調(diào)回至6。

紫外線穩(wěn)定性:將無菌發(fā)酵液敞口置于超凈臺紫外線燈(功率30W)下照射20、40、60、90min[15]。

反復(fù)凍融穩(wěn)定性:將無菌發(fā)酵液于-20℃冷凍2h,室溫融化1h,反復(fù)凍融3次;將無菌發(fā)酵液分別在-20℃和-80℃冰箱中冷凍72h后再融化1h[16]。

以上處理后的樣品均用0.22μm濾膜過濾,以未作處理的無菌發(fā)酵液(pH=6.3)為對照。利用1.2.2方法觀察是否產(chǎn)生抑菌圈,并測量抑菌圈大小,每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基優(yōu)化單因素試驗(yàn)

由圖1可以看出,不同碳源、氮源和無機(jī)鹽對DF-7的生長量影響較大。當(dāng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的碳源被蔗糖取代時(shí)DF-7的OD600值最大,為2.077,因此選擇蔗糖為碳源;當(dāng)?shù)鞍纂吮黄渌镔|(zhì)取代時(shí),DF-7的生長量明顯減少,所以氮源選擇蛋白胨;無機(jī)鹽的選擇中,KH2PO4對DF-7的生長有較明顯的促進(jìn)作用。因此培養(yǎng)基最優(yōu)碳源、氮源和無機(jī)鹽分別為蔗糖、蛋白胨和KH2PO4。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

利用DesignExpert8設(shè)計(jì)試驗(yàn),以蔗糖、蛋白胨和KH2PO4為響應(yīng)變量,OD600為響應(yīng)值,進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)(表2)。分析結(jié)果見表3,得到回歸方程為Y=2.070+0.230A+0.100B+0.150C+0.071AB+0.170AC-0.071BC -0.190A2 -0.150B2-0.280C2。該模型P=0.0004(P<0.01),表明回歸方程具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;其中A、C、AC和A2、C2因素對DF-7的生長量影響極顯著(P<0.01),B和B2因素對DF-7的生長量影響顯著(P<0.05);AB和BC因素對DF-7的生長量影響不顯著(P>0.05)。

2.3 響應(yīng)曲面分析及最佳條件驗(yàn)證

利用DesignExpert8對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,構(gòu)建響應(yīng)曲面。通過曲面模型(圖2)可知,當(dāng)蔗糖29.01g/L、蛋白胨24.45g/L、KH2PO46.47g/L時(shí)DF-7的OD600值為2.233,驗(yàn)證試驗(yàn)OD600值為2.365,說明該模型能夠較好地反映實(shí)際情況。

2.4 無菌發(fā)酵液活性成分穩(wěn)定性試驗(yàn)

由表4可以看出,隨處理溫度升高抑菌圈直徑逐漸減小,40℃時(shí)抑菌圈直徑為17.96mm,60℃時(shí)抑菌圈直徑(6.35mm)明顯減小,當(dāng)處理溫度達(dá)到80℃時(shí),無菌發(fā)酵液未產(chǎn)生抑菌圈,說明溫度高于80℃以后,無菌發(fā)酵液失去了抑菌活性。由圖3A可以看出,pH=2時(shí),抑菌圈直徑為7.3mm,當(dāng)pH在4~8之間,抑菌圈直徑基本無變化,當(dāng)pH =10時(shí),抑菌圈明顯變?。?6.3mm),說明抑菌作用下降;隨著紫外線照射時(shí)長的增加,抑菌作用有所下降,但不明顯,照射90min后抑菌圈直徑仍有16.47mm,說明在90min內(nèi)DF-7的無菌發(fā)酵液具有較好的抗紫外線能力(圖3B);由反復(fù)凍融試驗(yàn)可知,3種處理方式對無菌濾液抑菌活性影響不大(圖3C),說明無菌濾液在低溫下具有較好的穩(wěn)定性。

3 討論與結(jié)論

本研究利用單因素試驗(yàn)得到解淀粉芽孢桿菌DF-7的最優(yōu)碳源為蔗糖,最優(yōu)氮源為蛋白胨,最優(yōu)無機(jī)鹽為KH2PO4,通過響應(yīng)面法得到最優(yōu)培養(yǎng)基為蔗糖29.01g/L、蛋白胨24.45g/L、KH2PO46.47g/L,最優(yōu)培養(yǎng)條件下DF-7發(fā)酵液OD600值為2.365。

本研究從4個(gè)方面考察了DF-7無菌發(fā)酵液的穩(wěn)定性。在溫度小于80℃時(shí),隨溫度增加,無菌發(fā)酵液抑菌作用下降,說明發(fā)酵液中活性成分對高溫較敏感,當(dāng)溫度高于80℃,未出現(xiàn)抑菌圈,這可能是由于高溫導(dǎo)致發(fā)酵液中的活性物質(zhì)變性[17],失去了抑菌作用。秦楠等[18]發(fā)現(xiàn)一株產(chǎn)抗菌蛋白的解淀粉芽孢桿菌,在40~80℃范圍內(nèi)抗菌蛋白具有較好的穩(wěn)定性。發(fā)酵液對酸堿度有一定的要求,pH值在4~8范圍內(nèi)穩(wěn)定性較好,極酸或極堿的環(huán)境下發(fā)酵液中活性成分可能變性失活[19],導(dǎo)致抑菌作用明顯下降。張娟等[20]研究了解淀粉芽孢桿菌活性成分中大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的化學(xué)性質(zhì),結(jié)果表明在酸或堿條件下均不穩(wěn)定,容易失活。無菌發(fā)酵液對紫外線具有一定的穩(wěn)定性,90min內(nèi)發(fā)酵液的抑菌作用基本不變。Wang等[21]由枯草芽孢桿菌中分離到抗菌蛋白,也具有一定的抗紫外線能力。-80℃下對無菌發(fā)酵液活性影響不大,說明發(fā)酵液在低溫條件下也具有較好的穩(wěn)定性。以上結(jié)果說明DF-7無菌發(fā)酵液在耐低溫和抗紫外線方面具有研究價(jià)值,下一步將對DF-7無菌發(fā)酵液中活性成分以及活性物質(zhì)的分離進(jìn)行研究。

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