李淼 李桂祥 劉偉 高曉蘭 王孝友 張安寧

摘要：本研究利用生物信息學方法從桃全基因組數(shù)據(jù)庫篩選出7個NHX反向轉(zhuǎn)運體，并對其序列特征、基因結(jié)構(gòu)、進化關(guān)系、亞細胞定位、組織表達譜和鹽脅迫響應性進行綜合分析。結(jié)果表明，7個桃NHX具有清晰的親緣遠近關(guān)系;5個桃NHX（NHX1，NHX4～NHX7）基因在結(jié)構(gòu)等方面具有相似性，親緣關(guān)系較近，而與NHX2和NHX3親緣關(guān)系較遠。7個桃NHX蛋白在N端具有明顯的跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域。順式元件分析表明，桃NHX基因家族上游啟動子區(qū)域包含與光信號、激素、逆境脅迫及分生組織表達相關(guān)的順式作用元件。qRTPCR分析結(jié)果顯示，大多數(shù)桃NHX家族成員在莖中表達較多;所有桃NHX成員對外源鹽處理具有響應性。

關(guān)鍵詞：桃;NHX基因家族;全基因組;基因表達

中圖分類號：S662.1：Q781文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2021）12-0008-09

Na+/H+反向轉(zhuǎn)運體（Na+/H+ transporters，NHX）在植物耐鹽性方面發(fā)揮著重要作用[1]。NHX能將Na+（K+）區(qū)域化或排出細胞外以保持植物細胞內(nèi)較低水平的Na+（K+）濃度，避免細胞受到傷害，維持其正常生理功能。NHX具有調(diào)節(jié)細胞膨壓、維持細胞Na+（K+）濃度、調(diào)節(jié)細胞內(nèi)pH 值的功能，是植物耐鹽途徑的重要因子[2-5]。

擬南芥基因SOS1和NHX1是植物中最早被克隆的NHX類基因，這兩個基因分別定位于細胞的質(zhì)膜和液泡膜上，分別在細胞質(zhì)中Na+（K+）向胞外運輸和Na+（K+）向液泡的區(qū)域化運輸發(fā)揮著重要作用[6，7]。經(jīng)研究，在多種植物中如水稻（OryzasativaLinanaeus）[8]、棉花（Gossypiumherbaceum Linanaeus）[9]、堿蓬（Suaeda glaucaBunge）[10]、柑桔（CitrusreticulataBlanco）[11]等均克隆到相應的同源基因。目前，數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)的植物NHX類蛋白60多個。擬南芥中NHX基因家族成員共8個（AtNHX1～AtNHX8），均參與擬南芥耐鹽代謝途徑。在鹽脅迫條件下，AtNHX1～AtNHX4定位于液泡膜上，能將Na+區(qū)隔化至液泡中[12-15];AtNHX5與AtNHX6定位在內(nèi)膜體上，在調(diào)控細胞Na+（K+）、pH平衡和鉀營養(yǎng)等方面起重要作用[5，16，17];AtNHX7和AtNHX8定位于細胞膜上，參與細胞質(zhì)Na+的外排代謝，是植物抵抗鹽離子毒害的首個屏障[18，19]。綜上，研究NHX基因家族的亞細胞定位情況是分析NHX基因功能的重要環(huán)節(jié)。

我國鹽堿化土地主要分布于北方及沿海地區(qū)，占全國可利用土地面積的4.88%[20]。日益嚴重的土壤鹽堿化問題嚴重影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境，如何充分利用鹽堿地資源成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)展亟需解決的問題。桃樹抗逆性強，干旱、輕度鹽堿條件下均可正常生長，解析桃樹的耐鹽分子機理和代謝途徑、培育耐鹽新品種可為桃樹在鹽堿地種植提供一條新途徑。

本研究基于桃（Amygdalusdavidiana）全基因組測序結(jié)果，對桃與耐鹽相關(guān)的Na+/H+反向轉(zhuǎn)運體NHX基因家族進行鑒定，利用生物信息學軟件對其進行分類及功能預測，并測定這些基因在植物組織的表達及受到鹽脅迫轉(zhuǎn)錄水平的變化情況，為深入揭示NHX基因家族的生物學功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料與處理

供試材料為山東省果樹研究所金牛山試驗基地5年生山桃（Amygdalusdavidiana）的各組織（根、莖、葉、花和果實）。根、莖、葉和花采樣時間是2020年3月30日，果實采樣時間是2020年7月28日。樣品于液氮中速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

鹽處理試驗離體枝條采自5年生山桃，采樣時間是2020年7月28日。取長勢一致、健康一年生枝條分為兩組：一組放入300mmol/L的NaCl鹽溶液;另一組放入清水（對照）。置于人工氣候箱中進行培養(yǎng)，設定溫度25℃，相對濕度60%左右，光照強度40μmol/（m2·s）。處理0、0.5、1.0、1.5h后取樣，每次每組隨機選取3根枝條，每根枝條取成熟葉3片立即放入液氮中冷凍，-80℃保存，用于提取RNA進行基因表達分析。

1.2 桃NHX轉(zhuǎn)錄因子的鑒定與表達分析

1.2.1 桃NHX基因家族成員的檢索 已報道文獻顯示擬南芥（ArabidopsisthalialaHeynh.）有8個AtNHXs基因成員、水稻有5個OsNHXs基因成員、胡楊（PopuluseuphraticaOliver）有6個PeNHXs基因成員。利用美國國立生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫（NationalCenterforBiotechnologyInformation，NCBI，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）搜索上述基因的蛋白序列，利用桃基因組數(shù)據(jù)庫GDR（https：//www.rosaceae.org/）中BLASTP選項搜索比對。下載比對出的蛋白序列和對應的基因序列。將候選基因提交至InterProScan（http：//www.ebi.ac.uk/interpro/）進行結(jié)構(gòu)域驗證，最終確定桃基因組NHX家族成員共7個。依據(jù)家族成員在染色體上的位置依次命名為PpNHX1～PpNHX7。

利用網(wǎng)站ExPASy（https：//web.expasy.org/protparam/）預測家族成員對應的等電點（pI）、不穩(wěn)定指數(shù)以及親水指數(shù);使用在線網(wǎng)站TMHMMServer（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）和軟件IBS（http：//ibs.biocuckoo.org/）預測并繪制PpNHXs蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)模型;使用在線網(wǎng)站Softberry（http：//www.softberry.com）進行亞細胞定位預測。

1.2.2 系統(tǒng)進化關(guān)系分析和基因結(jié)構(gòu)分析 使用MEGA5軟件（https：//www.megasoftware.net）將擬南芥、水稻、胡楊和桃NHX家族全部成員蛋白序列采用鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）在默認參數(shù)下構(gòu)建進化樹。

利用桃基因組數(shù)據(jù)庫GDR獲取家族成員的基因序列和對應編碼區(qū)（CDS）序列，運用在線軟件GSDS（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）進行PpNHXs家族成員外顯子和內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)分析。

1.2.3 桃NHX家族成員啟動子順式作用元件分析 在桃基因組數(shù)據(jù)庫GDR下載各成員基因翻譯起始位點ATG上游2000bp的序列，使用在線網(wǎng)站Plantcare（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）進行作用元件預測分析。

1.2.4 桃NHX基因家族的組織表達分析 對桃7個NHX家族成員進行組織（根、莖、葉、花和果實）表達譜分析，并對NaCl處理下離體枝條上葉片的表達量進行實時熒光定量PCR檢測。用植物總RNA提取試劑盒HiPureHPPlantRNAMiniKit（MagenR4165-02）提取總RNA。以總RNA為模板，采用試劑盒SUM OnetubeRTMixtureⅢ（gDNAremovel）（SUMMERSUM7806a）合成cDNA。采用熒光定量試劑盒qPCRmastermixSybrGreen100Reaction（DBI-2043）配制qRT-PCR體系，以稀釋10倍的cDNA為模板，具體反應體系為（20μL）：2×SYBRqPCRMix10μL，正反向引物（10μmol/L）各0.4μL（表1），DNA模板1μL、ddH2O8.2μL;熒光定量PCR儀器為美國DBI7500fast熒光定量系統(tǒng)。qRT-PCR反應程序為：94℃ 10min;94℃ 15s，50℃ 30s，72℃30s，40個循環(huán);95℃ 1min，55℃ 30s，95℃ 30s。內(nèi)參基因為桃基因Translationelongationfactor2（TEF2），每個樣品重復3次。采用2-△△Ct法計算基因相對表達量。

2 結(jié)果與分析

2.1 桃PpNHXs基因的鑒定和理化性質(zhì)分析

利用桃基因組數(shù)據(jù)庫共鑒定出7個PpNHXs基因，根據(jù)其在染色體上的定位依次命名為PpNHX1～PpNHX7（表2）。PpNHXs家族7個成員CDS長度在1590～3507bp之間，其中PpNHX4最短，PpNHX2最長。PpNHXs蛋白氨基酸長度在529～1168之間，相對分子質(zhì)量介于58.6～130.2kD。PpNHXs蛋白等電點介于5.53～8.83，其中蛋白PpNHX2～PpNHX5呈酸性，其他呈堿性。PpNHXs蛋白不穩(wěn)定指數(shù)介于34.62～45.61，僅有PpNHX1和PpNHX3的不穩(wěn)定指數(shù)大于40，說明桃PpNHXs蛋白家族中不穩(wěn)定蛋白居多。PpNHXs蛋白的親水指數(shù)在0.058～0.593之間，說明桃PpNHXs家族的蛋白均為疏水蛋白。

2.2 桃PpNHXs基因結(jié)構(gòu)分析

利用桃基因組數(shù)據(jù)庫GDR提供的PpNHXs蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1），結(jié)果顯示，PpNHXs具有清晰的親緣遠近關(guān)系，PpNHX1、PpNHX4～PpNHX7親緣關(guān)系較近，其與PpNHX2和PpNHX3親緣關(guān)系較遠。根據(jù)提供的PpNHXs家族gDNA和cDNA序列繪制每個成員的基因結(jié)構(gòu)，結(jié)果（圖2）顯示，7個PpNHXs基因的外顯子數(shù)在13～23之間不等，外顯子數(shù)目較多。其中，PpNHX1、PpNHX4～PpNHX7外顯子數(shù)目相近，基因長度差異較小。

2.3 桃PpNHXs蛋白跨膜結(jié)構(gòu)分析

使用在線網(wǎng)站TMHMM Server分析桃PpNHXs蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域，并利用軟件IBS繪制PpNHXs蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)模型（圖3）。結(jié)果顯示，PpNHX1～PpNHX7均具有跨膜結(jié)構(gòu)域，符合NHX家族跨膜蛋白的特征。PpNHX1、PpNHX4和PpNHX7具有11個跨膜區(qū)域;PpNHX3、PpNHX5和PpNHX6具有10個跨膜區(qū)域;PpNHX2具有12個跨膜區(qū)域，為跨膜區(qū)域個數(shù)最多的成員。

PpNHXs家族成員的N端、C端在膜兩端的分布存在差異，PpNHX1、PpNHX4和PpNHX7的N端和C端分布于跨膜兩側(cè);PpNHX2、PpNHX3、PpNHX5和PpNHX6的N端和C端分布于跨膜同側(cè)。根據(jù)20種氨基酸的疏水性和親水性，對7個桃PpNHXs氨基酸序列進行分析，發(fā)現(xiàn)7個桃PpNHXs跨膜結(jié)構(gòu)域（N端）均有較大比例的疏水氨基酸異亮氨酸（I）、亮氨酸（L）、苯丙氨酸（F）、纈氨酸（V）和丙氨酸（A）（表3）。

2.4 桃PpNHXs基因家族成員啟動子分析

利用Plantcare軟件對桃PpNHXs基因家族上游啟動子元件進行預測，分析統(tǒng)計與光信號、激素、逆境脅迫及分生組織表達相關(guān)的順式作用元件（圖4）。在7個桃PpNHXs基因家族的啟動子區(qū)域，均具有與光信號相關(guān)的元件;其中，PpNHX2的光信號元件最少，為4個;PpNHX5具有的光信號元件最多，為21個。與激素相關(guān)的作用元件有生長素、脫落酸、赤霉素、水楊酸、茉莉酸甲酯;PpNHX2具有5種與激素相關(guān)的作用元件，PpNHX4具有與赤霉素和生長素相關(guān)的作用元件，PpNHX5具有與脫落酸和水楊酸相關(guān)的作用元件，PpNHX4和PpNHX5為家族中具有激素元件最少的成員。與逆境相關(guān)的作用元件有厭氧誘導、干旱誘導、低溫、防御和應激反應;PpNHX3和PpNHX5均具有4種逆境相關(guān)元件;PpNHX6只具有厭氧誘導相關(guān)元件，為家族中具有逆境相關(guān)元件最少的成員。PpNHX4、PpNHX5和PpNHX7基因的啟動子上含有與分生組織表達相關(guān)的順式作用元件;PpNHX6和PpNHX7的啟動子上含有與胚乳表達相關(guān)的順式作用元件。

通過分析桃PpNHXs基因家族上游啟動子元件，發(fā)現(xiàn)PpNHXs家族與光信號、激素、逆境脅迫及分生組織表達有密切關(guān)系，說明PpNHXs基因家族在生長發(fā)育、激素調(diào)控、抵抗逆境脅迫方面發(fā)揮重要調(diào)控作用。

2.5 桃PpNHXs基因家族成員的表達分析

2.5.1 組織特異性 對7個桃PpNHXs基因家族成員進行qRT-PCR分析，結(jié)果表明（圖5），PpNHX1～PpNHX7在山桃根、莖、葉、花和果實均有表達;PpNHX1在莖中相對表達量較高，PpNHX2在根和莖中相對表達量較高，PpNHX3在各組織表達量相對均勻;PpNHX4、PpNHX5和PpNHX7主要在莖中表達，其次在花中;PpNHX6在果實中相對表達量最高。

2.5.2 桃PpNHXs響應鹽脅迫的表達分析 由圖6可知，離體枝條葉片經(jīng)過NaCl溶液處理后，7個PpNHXs基因均出現(xiàn)不同變化。鹽處理下的PpNHX1和PpNHX2基因在0～1.5h變化趨勢是一致的，均為先升高后降低然后趨于平穩(wěn);PpNHX5、PpNHX6和PpNHX7的相對表達量與對照組相比均明顯降低;PpNHX3的相對表達量高于對照組;PpNHX4的相對表達量0～0.5h高于對照，1h后低于對照。

3 討論與結(jié)論

本研究共鑒定出7個PpNHXs基因家族成員，與擬南芥（8個）、水稻（5個）和葡萄（8個）的NHX家族成員數(shù)量相近[21-23]。通過對擬南芥、水稻、胡楊和桃基因組NHX家族成員親緣關(guān)系進行分析，發(fā)現(xiàn)每種植物的NHX家族成員在系統(tǒng)進化樹中分布均勻，相同植物的NHX基因家族成員聚在同一個分支的現(xiàn)象較少，說明不同植物間NHX家族成員多為直系同源基因，如PpNHX1和PeNHX4、PpNHX4和AtNHX3;相比于其他基因家族如MYB、SAUR、NAC等擁有50～100個家族成員，不同植物基因組NHX家族成員個數(shù)較少，主要是NHX家族發(fā)生復制事件較少，即旁系同源基因（如AtNHX7和AtNHX8）對數(shù)較少。

通過系統(tǒng)發(fā)育樹分析發(fā)現(xiàn)，PpNHX2、PpNHX3與其他5個PpNHXs成員親緣關(guān)系較遠;通過分析基因外顯子數(shù)目、基因長度，發(fā)現(xiàn)PpNHX2、PpNHX3與其他5個PpNHXs成員在基因結(jié)構(gòu)上差異較大。PpNHX2、PpNHX3在桃基因組上具有結(jié)構(gòu)和序列特異性，這種特異性預示著基因功能的特異性，為后續(xù)的基因功能分析奠定了基礎(chǔ)。

NHX基因家族最明顯的結(jié)構(gòu)特征為跨膜結(jié)構(gòu)域[18]。NHX跨膜結(jié)構(gòu)集中分布在疏水性較強的N端，而親水性較強的長序列C端分布在不同細胞器中，具有感知信號、調(diào)控蛋白等功能[24]。在擬南芥AtNHXs基因家族中共鑒定出8個AtNHXs成員;根據(jù)在亞細胞器的定位可以分為3類，液泡膜NHX（AtNHX1～AtNHX4）、內(nèi)膜NHX（AtNHX5和AtNHX6）和質(zhì)膜NHX（AtNHX7和AtNHX8）[25]。PpNHX2定位在質(zhì)膜上，這與系統(tǒng)發(fā)育樹中親緣關(guān)系較近的AtNHX7、AtNHX8蛋白定位一致;系統(tǒng)進化樹中唯一與AtNHX5、AtNHX6親緣關(guān)系近的PpNHX3定位在高爾基體上，這與AtNHX5、AtNHX6蛋白定位一致;PpNHX1、PpNHX4～PpNHX7與AtNHX1～AtNHX4具有較近的親緣關(guān)系，但PpNHX1、PpNHX4～PpNHX7蛋白定位均未在液泡膜上，與AtNHX1～AtNHX4的蛋白定位不一致。本研究認為至少存在1～2個PpNHX在液泡膜上，調(diào)節(jié)細胞液泡Na+的平衡和滲透壓，但該結(jié)論需后續(xù)試驗進行驗證。

在桃PpNHXs組織表達分析中，7個PpNHXs表達具有特異性，表明7個PpNHXs在不同組織具有各自功能特點;但PpNHXs普遍在根和莖組織表達較高，因根和莖是植物抵御外界有害物質(zhì)進入和運輸至體內(nèi)各部的重要關(guān)口，較多的PpNHXs分布在根和莖組織內(nèi)對提高桃抗逆性具有重要作用。通過分析桃PpNHXs啟動子順式作用元件，發(fā)現(xiàn)大量與激素、抵抗逆境相關(guān)的元件。通過鹽脅迫處理，發(fā)現(xiàn)每個PpNHX的表達出現(xiàn)明顯變化，說明7個PpNHXs均參與體內(nèi)耐鹽代謝;PpNHX1～PpNHX3的表達量高于對照，說明其可能正向調(diào)控耐鹽代謝途徑;PpNHX4的表達量先高于對照，1h后低于對照，說明其可能正向參與體內(nèi)耐鹽代謝，只是基因表達的持續(xù)性不如基因PpNHX1～PpNHX3。PpNHX5～PpNHX7表達出現(xiàn)降低的現(xiàn)象，說明其可能負向調(diào)控體內(nèi)耐鹽代謝。

綜上，本研究對桃PpNHXs基因家族進行全基因鑒定、生物信息分析、跨膜結(jié)構(gòu)分析和表達分析，發(fā)現(xiàn)該基因家族結(jié)構(gòu)特點明顯、功能多樣，尤其與抵抗逆境聯(lián)系密切。本研究結(jié)果可為進一步研究和利用桃PpNHXs基因家族奠定基礎(chǔ)。