尚延春 張海英 柴巍巍

河南省洛陽正骨醫(yī)院(河南省骨科醫(yī)院),河南 鄭州 450000

骨質(zhì)疏松癥是常見的內(nèi)分泌疾病，可增加全身骨折的風險。據(jù)統(tǒng)計[1]，我國50歲以上居民的骨質(zhì)疏松癥發(fā)病率已高達19.2 %，且呈上升趨勢。目前治療骨質(zhì)疏松癥的常用藥物有雙膦酸鹽、降鈣素、雌激素等[2]，雖有一定作用但副作用大，仍需優(yōu)化。異補骨脂素是補骨脂的重要成分，被證實具有抗骨質(zhì)疏松作用[3]。有實驗證實[4]，核心結(jié)合因子α1(core binding factor α 1，Runx 2)/人基質(zhì)金屬蛋白酶-13(matrix metalloproteinase-13，MMP13)信號通路可參與骨質(zhì)疏松大鼠骨組織破壞病變。但是異補骨脂素是否能通過上述信號通路途徑治療骨質(zhì)疏松癥尚未可知。鑒于此，本研究將設(shè)計進行大鼠對照試驗以探討上述問題。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物：50只SD大鼠，均為雌性，7周齡，180～220 g，平均(205.42±10.12)g，SPF級，均購自河南省實驗動物中心，合格證號：SCXK(豫)20180001。

1.1.2實驗藥物：異補骨脂素干粉，購自上海純優(yōu)生物科技有限公司，純度≥98 %。

1.1.3試劑與儀器：維酸鉀購自博士德生物工程有限公司；血鈣甲基百里酚藍(methyl thymol blue，MTB)法檢測試劑盒、血磷鉬酸法測定試劑盒、血清骨鈣素(bone gla protein，BGP)、尿膠原砒啶交聯(lián)N末端肽(N-terminal telopeptides of typeⅠcollagen，NTX)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒均購自美國OXTEX公司；蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色試劑盒、脫氧核苷酸(deoxynucleotide，DNA)提取試劑盒、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量試劑盒均購自美國Bio-Rad公司；兔抗鼠Runx 2、MMP13單克隆抗體、山羊抗兔Runx 2、MMP13多克隆抗體均購自美國Invitrogen 公司；Runx 2、MMP13及內(nèi)參(β-actin)均由深圳晶美生物科技公司設(shè)計合成。DPX型雙能X射線骨密度儀購自Lunar公司；UH4150型紫外/可見分光光度計購自天美(中國)科學儀器有限公司；7600型全自動生化分析儀購自日本ATACH公司；BX53型光學顯微鏡購自日本Olympus公司；9700型聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)擴增儀購自美國ABI公司。

1.2 方法

1.2.1建模、分組與干預：將50只SD大鼠采用隨機數(shù)字表分為為5組：正常對照組、模型空白組、異補骨脂素低濃度組、異補骨脂素中濃度組、異補骨脂素高濃度組，每組10只。除正常對照組外，均采用維甲酸灌胃建立骨質(zhì)疏松癥大鼠模型：取維酸鉀和1 %羧甲基纖維素鈉，混合均勻并配置成終濃度為含7 %維酸鉀的混懸液，1 mL/100 g灌胃，每天1次，持續(xù)2周[5]。與此同時，正常對照組大鼠每天灌胃1 %羧甲基纖維素鈉+蒸餾水，共2 mL，每天1次。建模成功后，異補骨脂素低濃度組、異補骨脂素中濃度組、異補骨脂素高濃度組分別給予25、50、100 mg/kg異補骨脂素(溶于2 mL生理鹽水中)灌胃，正常對照組和模型空白組給予2 mL生理鹽水灌胃，每天1次，每周停用1 d，持續(xù)3個月。

1.2.2骨密度檢測：分別于治療前后采用雙能X射線骨密度儀檢測大鼠股骨近端、L4～6腰椎骨骨密度，取平均值。

1.2.3骨代謝檢測：分別于治療后取大鼠尾靜脈血3 mL檢測骨代謝指標，其中血鈣、血磷分別采用MTB法、鉬酸法測得；BGP和NTX均采用ELISA法檢測。

1.2.4骨結(jié)構(gòu)變化檢測：治療后將實驗大鼠斷頭處死，取股骨干骺端組織1 mm3。常規(guī)脫鈣、切片、脫蠟、水化，給予蘇木精染色。以鹽酸酒精分化，以氨水返藍，持續(xù)5 s后以自來水沖洗1 min。伊紅染色，梯度濃度乙醇脫水，固定封片后鏡檢。

1.2.5骨組織Runx 2、MMP 13 mRNA檢測：取股骨干骺端組織常規(guī)提取總核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)，測定其濃度與純度。Runx 2上游引物：5’-ACTGATCGTTGCTAGCTAGGCT-3’，下游引物：5’-CTGACTGCTAGCTAGTTTGATC-3’；MMP13上游引物：5’-CTCGATCGATAAACTAGCTGGA-3’，下游引物：5’-CCGGATCGATGGTTCAGTAGTT-3’；β-actin上游引物：5’-TTAAACTAGCTAGTTTAGCTAA-3’，下游引物：5’-CTCTCGATCAGTCTAGTCATGG-3’。PCR反應：94 ℃(5 min)→94 ℃(40 s)→51 ℃(40 s)→72 ℃(1 min)，35個循環(huán)，72 ℃(10 min)。分析目的基因的相對表達強度。

1.2.6骨組織Runx 2、MMP 13蛋白表達檢測：取股骨干骺端組織BCA蛋白定量，上樣。電泳分離并轉(zhuǎn)膜，洗膜后以脫脂牛奶封閉10 min。加入一抗，4 ℃過夜；洗脫后加入辣根過氧化物酶標記的二抗，漂洗。染膜，暗室內(nèi)曝光，分析目的蛋白的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 26.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料組間比較采用單因素方差分析(F檢驗)，每兩組間比較采用SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 異補骨脂素對骨質(zhì)疏松癥大鼠骨密度的影響

建模和干預期間正常對照組、模型空白組、異補骨脂素低濃度組、異補骨脂素中濃度組、異補骨脂素高濃度組分別有1、3、2、2、1只死亡，多死于灌胃時不慎穿破食道，有2只大鼠死亡原因未明。治療前后采用雙能X線骨密度儀測量骨密度，正常對照組骨密度均無明顯變化(P<0.05)，余四組骨密度均下降(P<0.05)。治療后與正常對照組比較，其余四組骨密度均下降(P<0.05)；與模型空白組比較，異補骨脂素三個濃度組的骨密度均升高(P<0.05)，且呈濃度依賴。見表1。

表1 異補骨脂素對骨質(zhì)疏松癥大鼠骨密度的影響Table 1 Effect on bone mineral density in rats with osteoporosis

2.2 異補骨脂素對骨質(zhì)疏松癥大鼠骨代謝的影響

分別采用MTB法、鉬酸法、ELISA測定治療后各組大鼠的骨代謝。與正常對照組比較，模型空白組血鈣無明顯變化(P>0.05)，異補骨脂素三個濃度組的血鈣均升高(P<0.05)，且呈濃度依賴；各組血磷均相近(P>0.05)；與正常對照組比較，其余四組BGP均下降(P<0.05)，NTX均升高(P<0.05)；與模型空白組比較，異補骨脂素三個濃度組的BGP均升高(P<0.05)，NTX均下降(P<0.05)，且呈濃度依賴。見表2。

表2 異補骨脂素對骨質(zhì)疏松癥大鼠骨代謝的影響Table 2 The effects on bone metabolism in rats with osteoporosis

2.3 異補骨脂素對骨質(zhì)疏松癥大鼠骨結(jié)構(gòu)的影響

通過HE染色觀察骨質(zhì)疏松癥大鼠的骨結(jié)構(gòu)，正常對照組可見骨小梁形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，髓腔相對小，且腔內(nèi)造血細胞豐富；模型空白組骨小梁數(shù)目顯著減少，形態(tài)結(jié)構(gòu)破壞嚴重，骨髓腔內(nèi)造血細胞數(shù)量顯著減少，脂肪細胞顯著增多；異補骨脂素低濃度組骨小梁數(shù)目明顯減少，形態(tài)結(jié)構(gòu)破壞明顯，骨髓腔內(nèi)造血細胞數(shù)量明顯減少，脂肪細胞明顯增多；異補骨脂素中濃度組骨小梁數(shù)目減少，形態(tài)結(jié)構(gòu)遭破壞，骨髓腔內(nèi)造血細胞數(shù)量減少，脂肪細胞增多；異補骨脂素高濃度組骨小梁數(shù)目輕微減少，形態(tài)結(jié)構(gòu)輕微受損，骨髓腔內(nèi)造血細胞數(shù)量輕微減少，可見少量脂肪細胞。見圖1。

圖1 骨質(zhì)疏松大鼠骨結(jié)構(gòu)HE染色(×50)注：A：正常對照組；B：模型空白組；C：異補骨脂素低濃度組；D：異補骨脂素中濃度組；E：異補骨脂素高濃度組。Fig.1 HE staining of bone structure in osteoporotic rats (×50)

2.4 異補骨脂素對骨質(zhì)疏松大鼠骨組織Runx 2、MMP 13 mRNA表達的影響

采用qRT-PCR方法檢測骨質(zhì)疏松癥大鼠骨組織Runx 2、MMP 13 mRNA表達。與正常對照組比較，其余四組Runx 2 mRNA表達水平均下降(P<0.05)，與模型空白組比較，異補骨脂素三個濃度組的Runx 2 mRNA表達水平均升高(P<0.05)，且呈濃度依賴；MMP13 mRNA變化趨勢正相反。見表3。

表3 異補骨脂素對骨質(zhì)疏松大鼠骨組織Runx 2、MMP 13 mRNA表達的影響Table 3 Effects on the expressions of Runx 2 and MMP 13 mRNA in bone tissues of osteoporotic rats

2.5 異補骨脂素對骨質(zhì)疏松大鼠骨組織Runx 2、MMP13 蛋白表達的影響

采用Western blotting方法檢測骨質(zhì)疏松大鼠骨組織Runx 2、MMP 13 蛋白表達。與正常對照組比較，其余四組Runx 2 蛋白表達水平均下降(P<0.05)；與模型空白組比較，異補骨脂素三個濃度組的Runx 2 蛋白表達水平均升高(P<0.05)，且呈濃度依賴；MMP 13 蛋白表達趨勢正相反。見表4和圖2。

圖2 異補骨脂素對骨質(zhì)疏松大鼠骨組織Runx2、MMP13 蛋白表達的影響注：A：正常對照組；B：模型空白組；C：異補骨脂素低濃度組；D：異補骨脂素中濃度組；E：異補骨脂素高濃度組。Fig.2 Effects on the expressions of Runx2 and MMP13 proteins in bone tissues of osteoporotic rats

表4 異補骨脂素對骨質(zhì)疏松大鼠骨組織Runx 2、MMP13 蛋白表達的影響Table 4 Effects on the expressions of Runx 2 and MMP13 proteins in bone tissues of osteoporotic rats

3 討論

補骨脂中含有豐富的異補骨脂素，在既往的大鼠實驗研究[6]中證實補骨脂注射液可促進成骨細胞的增殖，抑制成骨細胞的凋亡。該藥物還可促進體外培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細胞的增殖與分化，并且還可促進BGP的分泌，減少鈣鹽沉積，證實異補骨脂素是抗骨質(zhì)疏松的有效成分[7]。本次研究采用維甲酸與1 %羧甲基纖維素鈉混合灌胃建立骨質(zhì)疏松癥大鼠模型，相較于常規(guī)去卵巢造模方法可減輕對大鼠造成的傷害，符合實驗動物福利原則，與劉穎等[8]報道的造模方法一致。但有研究[9]認為，該方法建模成功率不理想，可能是由于維酸鉀與1 %羧甲基纖維素鈉混合灌胃對骨吸收和骨形成的影響不顯著，作用緩慢。本研究發(fā)現(xiàn)治療后異補骨脂素三個濃度組的骨密度和骨代謝均顯著改善，作用效果呈濃度依賴性。

Runx 2是轉(zhuǎn)錄因子Runxx家族的重要成員之一，是一種特異性轉(zhuǎn)錄因子，可參與骨組織的形成和重建。Runx 2決定著多能干細胞向成骨細胞的分化，并且還可促進軟骨的血管化，加快軟骨細胞的成熟，與破骨細胞與細胞外基質(zhì)的形成也密切相關(guān)[10-11]。MMP13是靶向軟骨降解的主要酶，主要局限于結(jié)締組織，具有特異性切割I(lǐng)I型膠原作用，在骨骼發(fā)育和軟骨重建中均有參與[12]。有報道發(fā)現(xiàn)[13-14]，通過調(diào)控骨組織Runx 2/MMP13信號通路的基因與蛋白表達可促進骨細胞的增殖，誘導其向成骨細胞分化，改善骨代謝和骨微結(jié)構(gòu)，是骨質(zhì)疏松癥臨床治療研究的新靶點。本研究推測異補骨脂素可對骨組織Runx 2/MMP13信號通路產(chǎn)生調(diào)控作用，對骨代謝的調(diào)控作用、骨結(jié)構(gòu)的保護作用很可能均通過此途徑實現(xiàn)。

本研究中異補骨脂素三個濃度組的骨結(jié)構(gòu)破壞減輕，可見異補骨脂素可減輕骨質(zhì)疏松癥大鼠的骨結(jié)構(gòu)破壞，且呈濃度依賴性。此外，異補骨脂素三個濃度組的骨組織Runx 2 mRNA及蛋白表達均高于模型空白組，MMP13 mRNA與蛋白表達均低于模型空白組，推測異補骨脂素可調(diào)控骨質(zhì)疏松大鼠骨組織Runx 2/MMP13信號通路，促進Runx 2基因及蛋白表達，抑制MMP13基因及蛋白表達，從而實現(xiàn)骨保護作用。Jian Wang等[15]研究發(fā)現(xiàn)異補骨脂素對骨質(zhì)疏松癥大鼠模型療效理想，且發(fā)現(xiàn)該藥物可減輕其氧化應激反應；Ge L等[16]指出異補骨脂素可通過激活成骨細胞的生物學活性改善骨代謝，也證實該藥物在骨質(zhì)疏松癥治療方面有良好的應用前景。

綜上所述，在骨質(zhì)疏松癥大鼠中采用異補骨脂素治療可提高大鼠的骨密度，改善骨代謝，并且可上調(diào)Runx 2 mRNA及蛋白表達、下調(diào)MMP13 mRNA及蛋白表達。