梁 答，吳曉林，白 俊，張麗萍，尹崇高，鐘 偉

濰坊醫(yī)學院1附屬醫(yī)院關(guān)節(jié)外一科//矯形骨科，2基礎(chǔ)醫(yī)學院病理學教研室，3護理學院，山東 濰坊261053

骨肉瘤目前仍是兒童和青少年惡性腫瘤死亡率很高的疾病，患者的5年生存率一直保持在60%～70%［1］。約18%的患者在臨床表現(xiàn)時可以發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移，大多數(shù)轉(zhuǎn)移發(fā)生在肺部［2］。早期轉(zhuǎn)移是骨肉瘤治療的難點。因此，有必要了解骨肉瘤的發(fā)病機制，以制定有效的治療策略。

垂體腫瘤轉(zhuǎn)化基因1（PTTG1）是一種參與促進中期姐妹染色單體分離的安全蛋白［3］，在有絲分裂過程中通過保護染色體穩(wěn)定性發(fā)揮重要作用［4］。據(jù)報道，PTTG1除了具有保護蛋白功能外［5］，還有促進惡性細胞增殖和促進腫瘤生長的作用［6］。PTTG1通過整合素局灶性粘附激酶信號轉(zhuǎn)導上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和MMPs的改變直接參與肺癌細胞的侵襲［7］。PTTG1在人乳腺癌組織和細胞中表達上調(diào)［8］。然而，PTTG1是否能通過其他方式影響骨肉瘤細胞的侵襲和增殖還有待于進一步研究。

MiRNA通過抑制mRNA翻譯或促進mRNA降解而充當基因表達的負調(diào)節(jié)劑［9］。研究表明miRNA的異常表達與骨肉瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)［10-12］。為了研究PTTG1影響骨肉瘤細胞侵襲和增殖的機制，我們通過生物信息學預(yù)測網(wǎng)站starbase 和miRmap 發(fā)現(xiàn)miR-300 和PTTG1可能結(jié)合。且在GEO數(shù)據(jù)集GSE28423中，我們發(fā)現(xiàn)與正常的骨組織相比miR-300在骨肉瘤細胞中表達降低。MiR-300與PTTG1在骨肉瘤中相互作用未見有報道，因此我們選定miR-300繼續(xù)下一步研究。MiRNA作為基因表達的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，是生物標志物開發(fā)的有希望的候選者。因此，充分了解miR-300在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展中的具體作用及其與PTTG1之間的關(guān)系至關(guān)重要。

1 材料和方法

1.1 材料

逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR Green rea1-time PCR Master Mix（博日科技有限公司）；PTTG1、β-Actin抗體均（艾博抗貿(mào)易有限公司）；雙熒光素酶報告基因載體、PTTG1敲減質(zhì)粒及其對照質(zhì)粒、PTTG1過表達質(zhì)粒及其對照質(zhì)粒、miR-300過表達及其對照質(zhì)粒由吉凱基因構(gòu)建；實驗細胞系hFOB1.19、293T、MG63（ATCC）。

1.2 網(wǎng)上在線microRNA分析工具

用starBase、miRmap預(yù)測網(wǎng)站預(yù)測可能與PTTG1互補結(jié)合的miRNA；NCBI 下載骨肉瘤中miRNA 表達的GEO數(shù)據(jù)集GSE28423。GSE28423數(shù)據(jù)集包含19個骨肉瘤細胞系，4個正常骨組織的miRNA的表達情況，利用正常骨組織作為對照，進行骨肉瘤細胞的差異miRNA表達分析。選定可以與PTTG1互補結(jié)合而且在骨肉瘤組織中表達降低的miR-300 為研究對象；在線預(yù)測miR-300 與PTTG1 存在的結(jié)合位點。利 用miRpath（http：//diana.imis.athena-innovation.gr/DianaToo1s/index.php）進行miR-300 的信號相關(guān)通路篩選。

1.3 細胞培養(yǎng)

hFOB1.19使用含有10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基，293T、MG63 使用含有10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基。細胞轉(zhuǎn)染依照Lipofectamine 2000說明書進行操作。PTTG1敲低對照質(zhì)粒序列由吉凱基因構(gòu)建合成，PTTG1 敲低序列5'-GACCCUGGAUGUUGAAUUG-3'。細胞經(jīng)轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒后分組。MG63組：正常培養(yǎng)，不做任何處理；Scr/MG63組：轉(zhuǎn)入PTTG1敲低對照質(zhì)粒；SiPTTG1/MG63組：轉(zhuǎn)入PTTG1敲低質(zhì)粒；MG63/NC組：轉(zhuǎn)入miR-300過表達對照質(zhì)粒；MG63/miR-300組：轉(zhuǎn)入miR-300過表達質(zhì)粒；MG63/miR-300+PTTG1組：共轉(zhuǎn)染miR-300過表達及PTTG1過表達質(zhì)粒。

1.4 qRT-PCR

RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄參考本課題組已發(fā)表文獻［13］。通過得到的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行qRT-PCR。U6的上游引物為GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT，下游引物為CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT；miR-300上游引物：AGGGTATACAAGGGCAGACT，下游引物：GAGAGGAGAGGGAGAGGAGA，莖 環(huán) 結(jié) 構(gòu) ：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCA CTGGATACGACAGTGTG；miR-300 表達使用U6 作為內(nèi)參，使用2-ΔΔCt分析的方法進行分析。

1.5 Western b1ot檢測

將各組細胞提取總蛋白質(zhì)，檢測蛋白質(zhì)濃度并進行凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗4 ℃過夜、TBST洗膜、二抗孵育、TBST洗膜、顯影、曝光。實驗重復3次?？贵w配制如下：β-Actin（1∶1 000）、PTTG1（1∶500）。

1.6 Transwe11 侵襲實驗

制備含有基質(zhì)膠的Transwe11小室，細胞接種后培養(yǎng)48 h，用棉簽取出內(nèi)側(cè)未侵入的細胞。用4%多聚甲醛固定，吉姆薩試劑染色，在光學顯微鏡下隨機選取3個區(qū)域進行計數(shù)。所有實驗均重復3次，取均值作為最終結(jié)果。

1.7 CCK8細胞增殖實驗

制備細胞懸液接種到96孔板中，每孔約100 μL、2×103細胞，培養(yǎng)24 h后每孔加入含10%CCK8的培養(yǎng)基10 μL。分別測定轉(zhuǎn)染24、48、72、96 h后的細胞吸光度值A(chǔ)450nm，計算結(jié)果。

1.8 雙熒光素酶檢測實驗

將miR-300 過表達質(zhì)粒及其對照質(zhì)粒分別與PTTG1的3'UTR野生型（pGL3-PTTG1 3'UTR-WT）報告載體和突變型（pGL3-PTTG1 3'UTR-MUT）報告載體共轉(zhuǎn)染入293T細胞中，轉(zhuǎn)染報告載體48 h，吸取培養(yǎng)基上清，再用PBS洗滌細胞；向培養(yǎng)孔中加入PLB裂解液，裂解15 min；收集裂解液并進行熒光素酶活性測定，以螢火蟲熒光素酶活性值與海腎熒光素酶活性值的比值作為相對熒光素酶活性。

1.9 統(tǒng)計學方法

采用SPSS22.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量結(jié)果使用均數(shù)±標準差表示，兩組間均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 PTTG1在骨肉瘤細胞MG63中高表達以及PTTG1在骨肉瘤細胞中敲減成功

用Western b1ot檢測人成骨細胞hFOB1.19及骨肉瘤細胞MG63中PTTG1的表達情況，結(jié)果顯示，PTTG1在骨肉瘤細胞MG63中表達（1.53±0.08）較高，在人成骨細胞hFOB1.19中表達（1.00±0.07）較低，且差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.0002，圖1A）。RNA 干擾技術(shù)敲低PTTG1后，通過Western b1ot檢測骨肉瘤細胞MG63中PTTG1的表達情況，結(jié)果顯示，與Scr/MG63組（1.00±0.10）相比，PTTG1在SiPTTG1/MG63組中表達（0.40±0.06）明顯降低，且差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.0007，圖1B）。

圖1 PTTG1在骨肉瘤細胞MG63中高表達以及PTTG1在骨肉瘤細胞中敲減成功Fig.1 Detection of PTTG1 expression of in MG63 cells and PTTG1 was successfully knocked down in osteosarcoma cells. A: PTTG1 expression was higher in MG63 cells and lower in hFOB1.19 cells, *P＜0.05 vs hFOB1.19 group. B: After the knockdown of PTTG1, the expression of PTTG1 in MG63 cell was significantly reduced,*P＜0.05 vs Scr/MG63 group.

2.2 敲低PTTG1后，骨肉瘤細胞MG63的體外侵襲和增殖能力下降

敲低PTTG1后，Transwe11侵襲實驗檢測各組細胞的侵襲能力，結(jié)果顯示，與對照組穿過下室的細胞數(shù)量（466.67±18.80）相比，敲低PTTG1組的穿過下室的細胞數(shù)量（267.00±9.09）明顯降低（圖2A、B）。運用CCK8細胞增殖實驗檢測各組細胞的增殖能力，結(jié)果顯示，與對照組在72 h、96 h（72 h：0.66±0.04，96 h：0.95±0.03）的增殖能力相比，敲低PTTG1 組在72 h、96 h（72 h：0.44±0.04，96 h：0.67±0.06）的增殖能力明顯降低（圖2C）。

2.3 miR-300是PTTG1的靶基因

網(wǎng)上預(yù)測軟件starBase 與miRmap 預(yù)測可能與PTTG1 互補結(jié)合的miRNA，NCBI 下載骨肉瘤中miRNA 表達的GEO 數(shù)據(jù)集GSE28423 并篩選出1og2FC＜-1、P＜0.05的miRNA，三者取交集，分析選定可以與PTTG1互補結(jié)合而且在骨肉瘤組織中表達降低的miR-300為研究對象（圖3A、B）。qRT-PCR檢測人成骨細胞hFOB1.19及骨肉瘤細胞MG63中miR-300的表達情況，發(fā)現(xiàn)miR-300在骨肉瘤細胞MG63中表達（0.48±0.06）較低，在人成骨細胞hFOB1.19中表達（1.00±0.06）較高（P=0.0004，圖3C）。轉(zhuǎn)染miR-300過表達質(zhì)粒后，qRT-PCR檢測骨肉瘤細胞MG63中miR-300的表達情況，結(jié)果顯示，與MG63/NC組（1.00±0.10）相比，MG63/miR-300組miR-300的表達（2.30±0.12）明顯升高，且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.0001，圖3D）。

2.4 miR-300在多種癌相關(guān)信號通路富集并且和PTTG1靶向結(jié)合

KEGG 通路富集分析表明miR-300 主要富集于Wnt信號通路、TGF-β信號通路等多種癌相關(guān)信號通路（圖4A）。轉(zhuǎn)染miR-300過表達質(zhì)粒后，Western b1ot檢測骨肉瘤細胞MG63中PTTG1的表達情況，結(jié)果顯示，與MG63/NC 組（1.00±0.10）相比，PTTG1 在MG63/miR-300組中的表達（0.48±0.08）明顯降低（P=0.0007，圖4B）。在線預(yù)測miR-300與PTTG1存在的結(jié)合位點，采用雙熒光素酶檢測miR-300能否與PTTG1靶向結(jié)合。結(jié)果顯示，miR-300過表達質(zhì)粒與pGL3-PTTG1 3'-UTR-WT報告載體共轉(zhuǎn)染后，細胞的熒光素酶活性顯著降低。miR-300與PTTG1 mRNA的3'UTR可靶向結(jié)合（圖4C）。

圖2 敲低PTTG1抑制MG63細胞的體外侵襲和增殖能力Fig.2 Knockdown of PTTG1 inhibits invasion and proliferation of MG63 cells.A,B:Invasion of transfected PTTG1 knockdown control group and knockdown group were determined by Transwell,Giemsa staining,scale bar=100 μm,Mean±SD,n=3,*P＜0.05 vs Scr/MG63 group;C:CCK8 assay detected the proliferation ability of each group,*P＜0.05 vs Scr/MG63 group.

圖3 miR-300是PTTG1的靶基因Fig.3 MiR-300 is the target gene of PTTG1.A:Venny plot of predicted genes;B:Expression of miR-300 in OS cell line and Human Bone tissue;C:Expression of miR-300 in hFOB1.19 and MG63 cells;D:Transfection efficiency of miR-300 in MG63 cells.*P＜0.05.

2.5 miR-300靶向調(diào)控PTTG1抑制骨肉瘤細胞MG63體外侵襲和增殖能力

圖4 miR-300與PTTG1靶向結(jié)合Fig.4 Targeted binding of MiR-300 to PTTG1.A:KEGG analysis of miR-300;B:After overexpression of miR-300,PTTG1 expression in MG63 cells was low;C:The binding sites of miR-300 and PTTG1.*P＜0.05.

Transwe11 侵襲實驗結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染過表達miR-300 質(zhì)粒（126.00±17.57）相比，共轉(zhuǎn)染過表達miR-300和過表達PTTG1質(zhì)粒后，骨肉瘤細胞MG63的穿膜細胞數(shù)（320.00±12.47）明顯增多（P=0.0003，圖5A、B）。CCK8檢測結(jié)果顯示與轉(zhuǎn)染過表達miR-300（48 h：0.37±0.03；72 h：0.43±0.02；96 h：0.55±0.02）相比，共轉(zhuǎn)染過表達miR-300和過表達PTTG1質(zhì)粒后，骨肉瘤細胞MG63 的增殖能力（48 h：0.48±0.02；72 h：0.66±0.04；96 h：0.79±0.06）明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.0077，圖5C）。

3 討論

骨肉瘤是一種來源于間充質(zhì)組織的惡性骨腫瘤［14］。盡管骨肉瘤的治療方法有手術(shù)切除，輔助化療和放療，但是對于轉(zhuǎn)移性或復發(fā)性疾病的患者生存率仍然低于20%［15-16］。因此，研究骨肉瘤的侵襲轉(zhuǎn)移的分子機制，控制腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生，有助于提高患者生存率，對骨肉瘤的診斷、治療和預(yù)后評估等具有重要的臨床意義［17］。

人類PTTG 家族至少含有3 種同源蛋白PTTG1、PTTG2和PTTG3，其中PTTG1已被詳細研究［18］。PTTG1是一種多功能蛋白，在控制有絲分裂、細胞轉(zhuǎn)化、DNA修復和胎兒發(fā)育等方面發(fā)揮作用［19］。最重要的是，PTTG1在大多數(shù)正常組織中的表達受到限制。相反，它在各種內(nèi)分泌相關(guān)腫瘤中大量表達，例如垂體、乳腺腫瘤和甲狀腺，以及非內(nèi)分泌相關(guān)的癌癥，包括消化、呼吸和神經(jīng)系統(tǒng)［20,1］。本研究通過Western b1ot、Transwe11侵襲和CCK8實驗得出，PTTG1基因可以促進MG63的侵襲和增殖能力，使得腫瘤細胞的自我更新和分化能力增強。前期研究發(fā)現(xiàn)通過抑制PTTG1的表達能夠抑制骨肉瘤的發(fā)展［21］，與本研究得出的結(jié)論一致。

越來越多的證據(jù)表明，miRNA在調(diào)節(jié)癌細胞的發(fā)展中起著重要的作用［22］。例如：miR-26a、miR-29b、miR-155-5p、miR-148a-3p 等miRNA 在調(diào)節(jié)骨肉瘤進展中具有重要作用［23-25］；本研究還證明了miR-300可與PTTG1靶向結(jié)合，進而對骨肉瘤細胞的侵襲，轉(zhuǎn)移和增殖能力產(chǎn)生影響。而且有研究發(fā)現(xiàn)miR-300表達水平的改變與腫瘤進展相關(guān)，miR-300能夠通過靶向cu11in 4B 抑制胰腺癌的發(fā)生發(fā)展［26］；miR-300 可通過靶向Twist抑制頭，頸鱗狀細胞癌和乳腺癌細胞的上皮向間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移［27］；miR-300能夠通過靶向ROS1抑制肺鱗狀細胞癌細胞的增殖和侵襲［28］，表明miR-300具有在多種腫瘤中均具有抑制作用［29］。本研究可以作為miR-300在腫瘤中發(fā)揮作用的一個有效補充。

綜上所述，本研究證實，miR-300 通過負向調(diào)控PTTG1 影響骨肉瘤細胞MG63 的侵襲，轉(zhuǎn)移和增殖。我們的研究結(jié)果為骨肉瘤發(fā)生和發(fā)展的分子機制提供了新的見解，為臨床提供了可能治療骨肉瘤的新靶點。

圖5 miR-300靶向調(diào)控PTTG1并抑制骨肉瘤細胞MG63體外侵襲和增殖能力Fig.5 miR-300 targets PTTG1 and inhibits the invasion and proliferation of MG63 cells.A,B:Invasion ability in different transfected cells,Giemsa staining,scale bar=100 μm,Mean±SD,n=3;C:CCK8 assay for detecting the proliferation and statistical analysis of each group.*P＜0.05.