徐 俊，史嘉煒，蔡欣玲，黃盛娜，李 剛，徐 燕

1上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海200021；2上海市浦東新區(qū)中醫(yī)醫(yī)院羅山分院，上海200136

動(dòng)脈粥樣硬化（AS）是一種高度特異性的細(xì)胞分子反應(yīng)為特征的炎癥進(jìn)程［1］。脂質(zhì)代謝紊亂、炎癥反應(yīng)、內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、血流剪應(yīng)力異常、氧化應(yīng)激等多種和動(dòng)脈粥樣硬化有關(guān)的致病因素都會(huì)造成冠脈的內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，產(chǎn)生炎癥-纖維增生性反應(yīng)［2］。早期研究表明，絲裂素活化蛋白激酶(MAPK)家族之一p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）通路與內(nèi)皮細(xì)胞損傷關(guān)系密切，是參與炎癥反應(yīng)的細(xì)胞內(nèi)的重要通路［3］。p38MAPK通過非磷酸化轉(zhuǎn)化為磷酸化狀態(tài)進(jìn)而促進(jìn)下游底物的磷酸化來快速實(shí)現(xiàn)信號(hào)傳遞，與核因子κB（NF-κB）共同促進(jìn)炎性介質(zhì)分泌（如：白介素-18、白介素-17、腫瘤壞死因子-α），介導(dǎo)炎癥因子對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，引發(fā)斑塊破裂、細(xì)胞凋亡，直接或間接損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)從而參與AS形成和冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的發(fā)生［4-6］。但是，p38MAPK信號(hào)通路活化及上游調(diào)控機(jī)制尚不清楚

目前臨床服用富心方的冠心病心絞痛患者經(jīng)過長期隨訪發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，服藥患者的動(dòng)脈血管內(nèi)皮損傷得到改善，各項(xiàng)臨床癥狀也逐漸好轉(zhuǎn)，富心方療效明顯，并且血清白介素-17、白介素-18表達(dá)下降，炎癥反應(yīng)受抑、與斑塊穩(wěn)定、臨床癥狀緩解等有關(guān)［7］。但是尚不清楚富心方是否是通過p38MAPK非磷酸化轉(zhuǎn)化為磷酸化狀態(tài)從而調(diào)控下游的炎性因子白介素-17和白介素-18，同時(shí)富心方是否也是通過調(diào)控p38MAPK上游的基因的表達(dá)從而減緩內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。

有研究通過孤兒核受體（NR4A1）敲除基因裸鼠的建立，發(fā)現(xiàn)NR4A1是調(diào)節(jié)單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞炎癥表型的新靶點(diǎn)，提出可能對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生很重要的觀點(diǎn)［8］，驗(yàn)證了NR4A1 的表達(dá)和NF-κB 的激活有關(guān)。而之前的研究已經(jīng)明確p38MAPK通過非磷酸化轉(zhuǎn)化為磷酸化狀態(tài)可促進(jìn)下游底物的磷酸化來快速實(shí)現(xiàn)信號(hào)傳遞，啟動(dòng)NF-κB，近期報(bào)道的NR4A1的過度表達(dá)限制了脂多糖對(duì)于小鼠肺內(nèi)內(nèi)皮屏障的破壞的研究［9］，進(jìn)一步提示調(diào)控炎性介質(zhì)分泌有關(guān)的NF-κB的上游因子NR4A1與p38MAPK之間有一定相關(guān)性，期待在本研究中得到解釋。

因此，本研究通過建立人動(dòng)脈血管內(nèi)皮祖細(xì)胞（HAECs）缺氧模型，以模擬受缺氧應(yīng)激活化后內(nèi)皮細(xì)胞受到的的損傷并還原缺氧內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)冠心病的影響［10-12］。然后結(jié)合高通量測序及蛋白驗(yàn)證技術(shù)進(jìn)行靶基因篩選，確定和內(nèi)皮細(xì)胞損傷有關(guān)的基因，且這些基因和動(dòng)脈粥樣硬化有關(guān)，并驗(yàn)證富心方作用于缺氧內(nèi)皮細(xì)胞以后和緩解或者修復(fù)內(nèi)皮細(xì)胞損傷有關(guān)的基因的表達(dá)，比如NR4A1和p38MAPK及其相關(guān)的基因，并利用近年來開發(fā)的軟件找到分析富心方對(duì)改善內(nèi)皮細(xì)胞損傷的療效和作用的靶基因，以探究中藥富心方治療冠心病動(dòng)脈粥樣硬化的作用機(jī)制，為進(jìn)一步闡明內(nèi)皮細(xì)胞損傷和修復(fù)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠13只，SPF級(jí)，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，生產(chǎn)許可號(hào)：SCXK（滬）2017-0005，體質(zhì)量180±20 g。

1.1.2 細(xì)胞 人動(dòng)脈血管內(nèi)皮祖細(xì)胞（HAEC，ATCC）。

1.1.3 藥物 富心方：包含黃芪、三七、山楂、水蛭、姜半夏等藥物，所有藥物均采用免煎顆粒劑，相當(dāng)于生藥劑量57 g/帖，由江陰天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn)提供（批號(hào)：18020311）。

1.1.4 試劑 蛋白預(yù)染（批號(hào)：SM1811, Marker Fermentas)；麗春紅S（批號(hào)：BYL40635）；NC膜（批號(hào)：HATF00010, mi11ipore）；PBS 磷酸鹽緩沖液（批號(hào)：BYL40657）；發(fā)光液（批號(hào)：WBKLS0100,Mi11ipore）；抗體P38（批號(hào)：#9212）、p-P38（批號(hào)：#4511）、GAPDH CST（批號(hào)：#5174，CST)；羊抗兔HRP標(biāo)記二抗（批號(hào)：A0208）、羊抗鼠HRP標(biāo)記二抗（批號(hào)：A0216，碧云天）；Human c-c-Fos ELISA Kit（批 號(hào)：CSB-E09261h）；Human NR4A1 ELISA Kit（批 號(hào)：MBS9340514）；Human mitogen activated protein kinase（MAPK）ELISAKit（批號(hào)：CSB-E09147h，CUSABIO）。

1.1.5 儀器 MK3酶標(biāo)儀（芬蘭雷勃）；Tanon-5200成像系統(tǒng)（Tanon）；Agi1ent高通量測序儀（Agi1ent）。

1.2 方法

1.2.1 藥物血清制備 13只雄性SPF級(jí)SD大鼠，隨機(jī)分成含藥血清組（8 只）與普通血清組（5 只），適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，含藥血清組開始灌胃給藥，1次/d，連續(xù)灌胃7 d，普通血清組采用等量生理鹽水灌胃，1次/d，連續(xù)灌胃7 d。采血前禁食12 h，末次灌胃1 h后進(jìn)行麻醉，腹主動(dòng)脈取血，4 ℃靜置4 h，3000 r/min 離心15 min分離血清，于56 ℃恒溫水浴鍋中30滅活血清，最后用微孔濾膜過濾除菌，-20 ℃分裝保存?zhèn)溆?。?dòng)物給藥劑量的換算公式：臨床用藥量×動(dòng)物等效劑量系數(shù)×培養(yǎng)基內(nèi)血清稀釋度［13］。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組干預(yù) 參照文獻(xiàn)方法［14］，HAEC細(xì)胞，然后放入37 ℃，5%CO2，常氧（21%）的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至3代（P3），然后隨機(jī)分成常氧培養(yǎng)的HAECs及缺氧培養(yǎng)的HAECs。對(duì)缺氧培養(yǎng)的HAECs進(jìn)行缺氧處理，即放入37 ℃，5%CO2，缺氧（2%）的細(xì)胞培養(yǎng)室按照設(shè)定的不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行培養(yǎng)。然后將培養(yǎng)好的細(xì)胞分成對(duì)照組（常氧培養(yǎng)的HAEC細(xì)胞+正常大鼠血清）、缺氧模型組（缺氧培養(yǎng)的HAEC細(xì)胞+正常大鼠血清）及給藥組（缺氧培養(yǎng)的HAEC細(xì)胞+富心方含藥血清），供高通量測序?qū)嶒?yàn)用。另將培養(yǎng)好的細(xì)胞分成下列各組供蛋白驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)用：A組：常氧培養(yǎng)的HAEC細(xì)胞+正常大鼠血清；B組：常氧培養(yǎng)的HAEC細(xì)胞+1%富心方含藥血清；C組：常氧培養(yǎng)的HAEC細(xì)胞+10%富心方含藥血清；D組：缺氧培養(yǎng)的HAEC細(xì)胞+正常大鼠血清；E組：缺氧培養(yǎng)的HAEC細(xì)胞+1%富心方含藥血清；F組：缺氧培養(yǎng)的HAEC細(xì)胞+10%富心方含藥血清。

1.2.3 高通量RNA測序篩選差異基因 對(duì)各組樣品提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，構(gòu)建文庫，產(chǎn)生DNA簇，采用Agi1ent高通量測序儀上機(jī)測序，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。對(duì)得到的差異表達(dá)基因(DEGs)進(jìn)行GO功能、京都基因與基因組百科全書數(shù)據(jù)庫（KEGG）分析，確定富心方作用的靶基因及相關(guān)信號(hào)通路?；贏miGO和String數(shù)據(jù)庫篩選出已確認(rèn)作用于內(nèi)皮細(xì)胞損傷修復(fù)的DEGs，分析相互作用，并用于ELISA法和Western b1ot法對(duì)這些基因在各組的蛋白表達(dá)水平驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中。

1.2.4 ELISA 法測定c-Fos、NR4A1、p38MAPK 含量將各組HAECs以5×106/mL的密度接種于96孔板中，A組：常氧培養(yǎng)的HAEC細(xì)胞+正常大鼠血清；B組：常氧培養(yǎng)的HAEC細(xì)胞+1%富心方含藥血清；C組：常氧培養(yǎng)的HAEC細(xì)胞+10%富心方含藥血清；D組：缺氧培養(yǎng)的HAEC細(xì)胞+正常大鼠血清；E組：缺氧培養(yǎng)的HAEC細(xì)胞+1%富心方含藥血清；F組：缺氧培養(yǎng)的HAEC細(xì)胞+10%富心方含藥血清，各組持續(xù)觀察處理24、48 h。收集各組上清液，按照ELISA試劑盒說明操作，檢測各組HAEC細(xì)胞培養(yǎng)液上清中c-Fos、NR4A1、p38MAPK的表達(dá)。

1.2.5 Western b1ot法測定p38，p-p38蛋白表達(dá) 將需要抽提的蛋白的細(xì)胞洗滌、裂解、加熱、離心后取上清；置于酶標(biāo)板中測定吸光度并換算濃度；將蛋白轉(zhuǎn)移至膜上并封閉后，加入第一抗體（p-p38 1∶1000、p38 1∶1000、GAPDH 1/2000），室溫孵育2 h，用TBST洗滌3次，加入1∶1000稀釋HRP標(biāo)記的二抗，與膜37 ℃孵育1 h。用TBST 洗滌3 次，5 min/次。配制ECL 發(fā)光液，根據(jù)用量，取ECL發(fā)光液A和B等量混勻，加在膜的正面暗室避光5 min。倒掉顯色液，用紙小心吸取顯色液，在上面蓋上一層平整的透明紙。將其放入成像系統(tǒng)中進(jìn)行掃描、觀察、分析p38，p-p38蛋白含量變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法

采用SPSS24.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析，組間比較使用LSD檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生物信息學(xué)分析富心方改善內(nèi)皮細(xì)胞損傷的靶點(diǎn)基因

2.1.1 通過高通量基因篩選和富心方作用有關(guān)的基因與對(duì)照組比較，缺氧模型組共有7134 個(gè)DEGs（1og2（fo1dchange）＞1，P＜0.05）；與模型組比較，富心方給藥組共有762個(gè)DEGs（1og2（fo1dchange）＞1，P＜0.05，表1）；從二者交叉部分篩選出682個(gè)DEGs。對(duì)缺氧HAECs使用富心方后，缺氧條件下發(fā)生變化又能受到富心方調(diào)控的DEGs中既存在顯著差異的上調(diào)基因也存在顯著差異的下調(diào)基因。

2.1.2 GO富集分析 GO 分析顯示，682個(gè)缺氧條件下發(fā)生變化又能受到富心方調(diào)控的DEGs中，缺氧作用可下調(diào)其中273個(gè)DEGs，且該273個(gè)DEGs在富心方作用后上調(diào)，這些DEGs涉及到522項(xiàng)GO-terms，其中生物學(xué)過程402項(xiàng)、細(xì)胞組成成分49項(xiàng)、分子功能71項(xiàng)，上述DEGs參與的各組基因功能中富集程度前20項(xiàng)（圖1）；缺氧作用下上調(diào)其中409個(gè)DEGs，且該409個(gè)DEGs在富心方作用后下調(diào)，這些DEGs 涉及到347 項(xiàng)GOterms，其中生物學(xué)過程222項(xiàng)、細(xì)胞組成成分30項(xiàng)、分子功能95項(xiàng)，上述DEGs參與的各組基因功能中富集程度前20項(xiàng)（圖2）。

表1 高通量測序所得差異基因篩選結(jié)果Tab.1 Screening results of DEGs from high-throughput sequencing

2.1.3 通過KEGG分析與基因功能篩選富心方作用的靶基因 基于AmiGO（amigo.geneonto1ogy.org）和String（https：//string-db.org/）數(shù)據(jù)庫及文獻(xiàn)檢索對(duì)上述DEGs進(jìn)行篩選，綜合考慮DEGs的差異表達(dá)水平及現(xiàn)有對(duì)其與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)程度的研究，確定了與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的73 個(gè)靶點(diǎn)基因（表2）?；贙EGG 數(shù)據(jù)庫（https：//www.kegg.jp），將73個(gè)靶點(diǎn)DEGs進(jìn)行KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)，其中大多數(shù)基因主要富集于MAPK信號(hào)通路（圖3）及其關(guān)聯(lián)通路，推測富心方調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞損傷與MAPK信號(hào)通路有關(guān)，選擇通路中差異表達(dá)水平最高的c-Fos、NR4A1、p38MAPK進(jìn)行后續(xù)研究。

圖1 GO富集分析顯示受到缺氧作用下調(diào)后經(jīng)富心方作用上調(diào)的DEGs 主要作用的生物學(xué)過程（A）、細(xì)胞組成成分（B）及分子功能（C）的GO-termsFig.1 Go enrichment analysis shows that BP(A),CC(B) and GO terms of MF (C) are the main effects of DEGs down-regulated by hypoxia and up-regulated by Fuxinfang. BP: Biological processes; CC:Composition of the cell;MF:Molecular functions.

圖2 GO富集分析顯示受到缺氧作用上調(diào)后經(jīng)富心方作用下調(diào)的DEGs主要作用的生物學(xué)過程（A）、細(xì)胞組成成分（B）及分子功能（C）的GO-termsFig.2 GO enrichment analysis shows that BP(A),CC(B)and go terms of MF(C)are the main effects of DEGs upregulated by hypoxia and down-regulated by Fuxinfang.BP: Biological processes; CC: Composition of the cell;MF:Molecular functions.

缺氧條件下的動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中的c-Fos、NR4A1、p38MAPK的基因表達(dá)明顯上調(diào)并和MAPK信號(hào)通路（圖3）有關(guān)，然而富心方加入后這些缺氧處理過的內(nèi)皮細(xì)胞中的c-Fos、NR4A1、p38MAPK基因表達(dá)出現(xiàn)明顯下調(diào)（P＜0.05）。

表2 高通量基因篩選所得與富心方逆轉(zhuǎn)缺氧對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞損傷作用的靶基因Tab.2 Target genes screened by high-throughput gene screening involved in Fuxinfang-induced reverse of hypoxia damage in endothelial cells

續(xù)表2

圖3 MAPK信號(hào)通路圖中c-Fos（AP-1）、NR4A1（Nur77）、p38MAPK基因主要參與的環(huán)節(jié)(紅色標(biāo)記)Fig.3 Key links(red)involving c-Fos(AP-1),NR4A1(Nur77)and p38MAPK genes in MAPK signal pathway.

將上述與富心方改善內(nèi)皮細(xì)胞損傷相關(guān)的DEGs上傳String數(shù)據(jù)庫，通過Cytoscape v3.6.1軟件構(gòu)建蛋白質(zhì)之間相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI網(wǎng)絡(luò)），分析富心方作用下HAECs中c-Fos、NR4A1及p38MAPK彼此相關(guān)性，及與其他DEGs 的相互作用（圖4）。結(jié)果顯示，c-Fos、NR4A1及p38MAPK顯示最強(qiáng)的相關(guān)性（粉色），在這三色粉色的圓圈外圍又有14個(gè)紫色的圓圈，其中包含很多和血管增生，血管損傷修復(fù)相關(guān)的基因的相關(guān)性。

圖4 富心方治療后的差異基因的PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.4 PPI network of different genes after Fuxinfang treatment.The pink nodes are p38 (MAPK1), NR4A1 and c-Fos genes, and the purple,yellow and green nodes identify other important genes.

2.2 富心方對(duì)c-Fos-NR4A1-p38通路作用的體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

2.2.1 富心方對(duì)c-Fos、NR4A1、p38MAPK蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組A組比較，B、C兩組內(nèi)c-Fos、NR4A1、p38MAPK蛋白表達(dá)水平未見明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而缺氧作用下HAECs中c-Fos、NR4A1、p38MAPK的表達(dá)顯著升高（P＜0.05，圖5）；與缺氧模型組比較，富心方含藥血清干預(yù)2%O2缺氧處理的HAECs 24 h后，10%富心方含藥血清能明顯下調(diào)缺氧誘導(dǎo)的HAECs中c-Fos、p38MAPK的表達(dá)（P＜0.05）；富心方含藥血清干預(yù)48 h后，1%、10%富心方含藥血清均能明顯下調(diào)缺氧誘導(dǎo)的HAECs中c-Fos、NR4A1、p38MAPK的表達(dá)（P＜0.05）。與缺氧模型組比較，在相同給藥時(shí)長下，10%富心方含藥血清給藥組中c-Fos、NR4A1、p38MAPK蛋白表達(dá)水平降低程度較1%富心方含藥血清給藥組更明顯（P＜0.05）；在相同給藥濃度下，給藥48 h c-Fos、NR4A1、p38MAPK蛋白表達(dá)水平降低程度較給藥24 h更明顯（P＜0.05）。

2.2.2 富心方對(duì)p38，p-p38蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組A組比較，B、C兩組內(nèi)p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表達(dá)水平未見明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而缺氧誘導(dǎo)HAEC細(xì)胞后p38MAPK磷酸化蛋白（p-p38）的表達(dá)水平顯著增高（P＜0.05，圖6）；與缺氧模型組比較，10%富心方含藥血清劑量組能明顯降低缺氧誘導(dǎo)的HAEC細(xì)胞p-p38MAPK蛋白的表達(dá)水平（P＜0.05）；與缺氧模型組比較，1%富心方含藥血清劑量組內(nèi)p-p38MAPK蛋白表達(dá)水平未見明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但是各組間p38MAPK蛋白表達(dá)未見明顯變化，且差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖5 富 心 方 含 藥 血 清 對(duì)c-Fos（A）、NR4A1（B）、p38MAPK（C）的影響Fig.5 Effect of Fuxinfang serum on c-Fos (A), NR4A1 (B),and p38MAPK (C) expressions. A: HAECs in normal culture. B: HAECs in normoxia treated with 1% Fuxinfang containing serum.C:HAECs in normoxia treated with 10%Fuxinfang containing serum.D:HAECs in hypoxic culture.E: HAECs in hypoxic culture treated with 1% Fuxinfang containing serum. F: HAECs in hypoxic culture treated with 10% Fuxinfang containing serum. *P＜0.05 vs A;▲P＜0.05 vs D.

圖6 富心方含藥血清對(duì)HAECs 中p38MAPK（A、C）、pp38MAPK（B、D）蛋白表達(dá)的影響Fig.6 Effect of Fuxinfang serum on c-Fos(A),NR4A1(B),and p38MAPK (C) expressions. A: HAECs in normal culture. B:HAECs in normoxia treated with 1% Fuxinfang containing serum. C: HAECs in normoxia treated with 10% Fuxinfang containing serum.D:HAECs in hypoxic culture.E:HAECs in hypoxic culture treated with 1% Fuxinfang containing serum.F: HAECs in hypoxic culture treated with 10% Fuxinfang containing serum.*P＜0.05 vsA;▲P＜0.05 vs D.

缺氧損傷后c-Fos、NR4A1、p38MAPK、p-p38MAPK表達(dá)上調(diào)，而不同濃度的富心方含藥血清作用48 h后均可抑制缺氧造成的上調(diào)，與模型組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖7）。

3 討論

AS是一種慢性的復(fù)雜的炎性過程，過程中伴隨著內(nèi)皮細(xì)胞損傷［15］。目前公認(rèn)AS是引起冠心病的主要原因，而內(nèi)皮細(xì)胞損傷相關(guān)的一系列病變則被認(rèn)為是AS的加劇因素［16-17］。c-Fos與NR4A1可以介導(dǎo)p38MAPK引發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞損傷、破壞內(nèi)膜完整性，繼發(fā)炎性反應(yīng)、平滑肌細(xì)胞增生、泡沫細(xì)胞形成等各種病變，這些都會(huì)加速冠狀動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生［18-19］。冠心病基本病機(jī)為“本虛標(biāo)實(shí)”，本虛以心氣虧虛，心血不足為主，標(biāo)實(shí)以血瘀、痰濁為主［20］。冠心病的病情與動(dòng)脈粥樣硬化的程度直接相關(guān)。本研究所用“富心方”為海派中醫(yī)丁氏內(nèi)科第四代主要傳承人、上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院徐燕教授傳承發(fā)揚(yáng)流派特色，結(jié)合現(xiàn)代疾病譜變化，創(chuàng)制的臨床治療冠心病心絞痛的有效驗(yàn)方，該方具有補(bǔ)氣活血、化痰通絡(luò)的功效。本方以黃芪、三七為君，補(bǔ)氣以行血，血行以載氣；細(xì)辛、水蛭、降香三藥為臣，分別發(fā)揮散寒通脈、破血逐瘀、化瘀理氣之功效，以助君藥活血化瘀止痛之效。本方氣、血、痰同治，扶正、祛邪兼顧，共奏補(bǔ)氣行血，消痰化瘀止痛之效。

之前關(guān)于p38MAPK與動(dòng)脈粥樣硬化的研究往往只觀察p38MAPK對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化與內(nèi)皮細(xì)胞損傷的獨(dú)立影響［21-23］，而本次研究則率先發(fā)現(xiàn)了富心方介導(dǎo)c-Fos-NR4A1-p38通路對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞損傷作用的可能性。因此，為了驗(yàn)證本研究的假設(shè)，在我們建立的缺氧誘導(dǎo)HAECs損傷模型中，初步探討了缺氧與內(nèi)皮細(xì)胞損傷之間的關(guān)系，以及加入富心方后的對(duì)c-Fos-NR4A1-p38通路的調(diào)控作用，說明了富心方改善受損HAECs的作用機(jī)制。

圖7 富心方在HAECs中介導(dǎo)c-Fos-NR4A1-p38通路的細(xì)胞通路示意圖Fig.7 Schematic diagram of c-Fos-NR4A1-p38 pathway mediated by Fuxinfang in HAECs.Fuxinfang can improve HAECs injury by inhibiting the expression of c-Fos and affecting the regulation of NR4A1 by p38MAPK.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示c-Fos、NR4A1、p38MAPK在缺氧條件下明顯上調(diào)，富心方則可以逆轉(zhuǎn)缺氧誘導(dǎo)的上調(diào)。既往研究發(fā)現(xiàn),c-Fos受缺氧應(yīng)激調(diào)控與活化的c-Jun氨基末端激酶（JNK）形成復(fù)合物AP-1［24-25］，AP-1結(jié)合到位于NR4A1 啟動(dòng)子上的AP-1 反應(yīng)元件，提高NR4A1在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)［26-28］。與AP-1結(jié)合后的NR4A1可以通過影響NF-κB 及其激酶IκB 激酶i（IKKi）、NF-κB 誘導(dǎo)激酶（NIK）的表達(dá)發(fā)揮調(diào)控p38MAPK促內(nèi)皮損傷的能力［29-30］。該作用可以催生易破裂的新生血管、促進(jìn)脂質(zhì)及各種炎細(xì)胞浸潤、誘發(fā)斑塊內(nèi)出血、破壞內(nèi)膜完整性，造成內(nèi)皮細(xì)胞損傷，從而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化病變的發(fā)展［19,31-33］。有驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明使用MAPK抑制劑可以抑制c-Fos-NR4A1-p38通路對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞損傷作用的［34-35］。所以我們推測，受缺氧應(yīng)激誘導(dǎo)，c-Fos-NR4A1-p38通路活化促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞損傷，加重冠狀動(dòng)脈粥樣硬化，并提出富心方可以通過有效抑制c-Fos-NR4A1-p38通路改善內(nèi)皮細(xì)胞損傷的假設(shè)。

內(nèi)皮細(xì)胞損傷是一個(gè)復(fù)雜的過程，c-Fos-NR4A1-p38通路在這其中發(fā)揮了重要作用［36］。為驗(yàn)證富心方對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用是否涉及到c-Fos-NR4A1-p38通路，我們檢測了各組c-Fos、NR4A1、p38MAPK、p-p38MAPK的蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)缺氧損傷后c-Fos、NR4A1、p38MAPK、p-p38MAPK表達(dá)上調(diào)，而不同濃度的富心方含藥血清作用48 h后均可抑制缺氧造成的上調(diào)，與模型組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示富心方可能通過c-Fos-NR4A1-p38通路抑制缺氧誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷。

其次，不同濃度、給藥時(shí)間造成的藥效改變也是必須考慮的因素。給藥24 h情況下，僅10%富心方含藥血清組下調(diào)的缺氧誘導(dǎo)的c-Fos、p38MAPK表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且該組c-Fos、p38MAPK表達(dá)抑制的程度較48 h 10%富心方含藥血清組更小，推測富心方調(diào)控c-Fos-NR4A1-p38通路的作用存在時(shí)間依賴性；在給藥48 h情況下，1%富心方含藥血清逆轉(zhuǎn)的缺氧誘導(dǎo)的c-Fos、NR4A1、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表達(dá)程度較10%富心方含藥血清的效果更小，推測富心方調(diào)控c-Fos-NR4A1-p38通路的作用存在濃度依賴性。

富心方含藥血清雖然對(duì)p38MAPK的直接影響不強(qiáng)，但p38MAPK是經(jīng)由磷酸化為p-p38MAPK來實(shí)際發(fā)揮對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷作用，故而抑制p-p38MAPK的表達(dá)才可以切實(shí)的改善內(nèi)皮細(xì)胞損傷［37］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)富心方含藥血清可以抑制p38MAPK磷酸化為p-p38MAPK，阻止p38MAPK對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。從c-Fos和NR4A1表達(dá)量改變趨勢看，符合推論。另一方面，本研究尚未對(duì)“富心方調(diào)控c-Fos-NR4A1-p38通路”假設(shè)進(jìn)行更詳細(xì)的求證研究，包括阻斷c-Fos表達(dá)是否可以觀察到富心方改善內(nèi)皮細(xì)胞損傷作用的下降等。此外，本研究首次驗(yàn)證了富心方具有的多靶點(diǎn)作用和介導(dǎo)c-Fos-NR4A1-p38通路作用于缺氧受損的內(nèi)皮細(xì)胞。

綜上所述，缺氧應(yīng)激可誘導(dǎo)HEAC細(xì)胞的c-Fos、NR4A1、p-p38MAPK基因及蛋白表達(dá)，從而促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷。驗(yàn)證了富心方對(duì)c-Fos-NR4A1-p38通路的影響，說明了富心方對(duì)于冠心病動(dòng)脈粥樣硬化患者的內(nèi)皮修復(fù)作用，至少是通過c-Fos-NR4A1-p38改善內(nèi)皮細(xì)胞的缺氧損傷，為在臨床上廣泛應(yīng)用此方防治冠心病提供了理論支持。