張冬艷，鄒雪晶，宋 旸，吳德華

南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院1放療科，2肝病中心，廣東 廣州510515

腫瘤細胞與正常細胞的代謝方式截然不同已經(jīng)是眾所周知的事實［1］。腫瘤細胞表現(xiàn)出一種被稱為“Warburg effect”的獨特代謝表型，其以糖酵解增強和氧化磷酸化減少為特征［2-3］。盡管“Warburg effect”的潛在機制尚不清楚，腫瘤細胞為了適應(yīng)腫瘤內(nèi)部缺氧微環(huán)境可能是腫瘤細胞代謝重編程的重要原因［4］。

缺氧是快速生長的實體腫瘤的一個常見特征［5］，與腫瘤的轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后密切相關(guān)［6-7］。乏氧誘導因子1（HIF-1）是細胞應(yīng)對缺氧微環(huán)境的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子之一［8］。研究表明，在缺氧的條件下，激活的HIF-1α與下游靶基因啟動子區(qū)的乏氧反應(yīng)元件（HRE）結(jié)合，促進下游靶基因的轉(zhuǎn)錄激活［9］，包括葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白GLUTs）［10］、己糖激酶（HKs）、磷酸甘油酸激酶（PGK）等［11-14］。近兩年研究表明，除了蛋白編碼基因外，HIF-1α還能通過調(diào)控非編碼RNA的表達促進腫瘤細胞的代謝重編程［15］。然而，對這部分受HIF-1α調(diào)控的非編碼RNA如何調(diào)控腫瘤細胞代謝重編程目前仍知之甚少。

長鏈非編碼RNA（1ncRNA）是一類長度超過200個核苷酸，具有較弱甚至缺乏蛋白編碼能力的RNA［16］。LncRNA作為一種新的生物過程調(diào)節(jié)因子，可調(diào)控腫瘤細胞的增殖［17］、侵襲和轉(zhuǎn)移［18］，并且成為腫瘤的生物標志物或者潛在治療靶點［19］。我們的前期工作基礎(chǔ)提示1ncRNA UPK1A-AS1 是新發(fā)現(xiàn)的一個乏氧誘導的1ncRNA，其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用目前尚未見報道。盡管已有多個缺氧應(yīng)答相關(guān)1ncRNAs 被報道在HIF-1α通路的調(diào)控和腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用，UPK1A-AS1是否參與HIF-1α通路調(diào)控的肝癌代謝重編程至今尚不清楚。本研究通過構(gòu)建UPK1AAS1穩(wěn)定過表達肝癌細胞株，探討過表達UPK1A-AS1對肝癌細胞糖酵解的影響及其分子機制，現(xiàn)報告如下。

1 資料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 人肝癌細胞株MHCC-97H購自中國科學院上海細胞庫。

1.1.2 藥品與試劑 DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（Gibco）購自上海英濰捷基；UPK1A-AS1慢病毒過表達系統(tǒng)由上海吉凱基因構(gòu)建并包裝；葡萄糖及乳酸試劑盒由南京建成公司提供；Trizo1、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR熒光定量PCR試劑盒（TAKARA）從廣州瑞真公司購買；雙熒光素酶報告試劑盒（Promega）從上海優(yōu)寧維公司購買；蛋白提取試劑盒、蛋白酶抑制劑、放線菌酮CHX、蛋白酶體抑制劑MG132等購自碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 儀器 酶標儀（Bio TeK）；熒光定量PCR 系統(tǒng)（RocheLightCyc1er?480II）；蛋白印跡系統(tǒng)（Bio-RAD）。1.1.4 細胞培養(yǎng) 人肝癌細胞株MHCC-97H細胞用含10%血清的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，并置于含5% CO2，37 ℃的恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)（21%O2，常氧組），待細胞密度達到85%左右進行常規(guī)傳代和后續(xù)實驗，每1～2 d進行換液。對于乏氧（1%O2，乏氧組）處理的細胞，細胞作相應(yīng)處理后，置于含1%O2、5%CO2、94%N2的密閉細胞孵箱內(nèi)，并置于37 ℃的恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 葡萄糖試劑盒檢測肝癌細胞葡萄糖的攝取情況細胞作相應(yīng)處理后置于常氧及乏氧條件培養(yǎng)24 h，隨后根據(jù)試劑盒說明書，取2 μL培養(yǎng)基上清，加入葡萄糖試劑盒工作液中，37 ℃水浴10 min，利用酶標儀檢測各組A505nm值，根據(jù)說明書計算出葡萄糖攝取情況。

1.2.2 乳酸試劑盒檢測肝癌細胞乳酸生成情況 細胞作相應(yīng)處理后置于常氧及乏氧條件培養(yǎng)24 h，隨后根據(jù)試劑盒說明書，取2 μL 培養(yǎng)基上清，加入酶工作液中，37 ℃水浴10 min，隨后加入適量終止液終止酶促反應(yīng)，利用酶標儀檢測各組A530nm值，根據(jù)說明書計算出乳酸生成情況。

1.2.3 實時定量PCR（qRT-PCR）檢測基因的表達情況利用Trizo1抽提肝癌細胞總RNA，純化后用紫外分光光度儀檢測RNA濃度。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將500 ng RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。利用染料法（SYBR Green I）將反應(yīng)體系置于熒光定量PCR 系統(tǒng)進行定量PCR 分析，βactin作為內(nèi)參。本實驗所用引物由上海生工公司設(shè)計并合成，引物序列見表1。

表1 qRT-PCR檢測差異表達基因的引物序列Tab.1 Primer sequence of qRT- PCR for differentially expressed genes

1.2.4 Western b1ot法檢測蛋白表達 細胞作相應(yīng)處理后，去除培養(yǎng)基，用PBS洗細胞2遍，加入100 μL含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液，用細胞刮子收集細胞，冰上靜置30 min，每10 min渦旋震蕩10 s，4 ℃14 000 g×15 min離心，上清即為總蛋白。用BCA法定量后，取30 μg進行電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉，孵育相應(yīng)的一抗和二抗后用化學發(fā)光法（ECL）顯影并記錄。

1.2.5 雙熒素酶報告實驗檢測HRE活性 將帶螢火蟲熒光的HRE質(zhì)粒與帶海腎熒光的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入細胞，用雙熒光素酶報告試劑盒中的裂解液收取細胞，根據(jù)試劑盒說明書檢測螢火蟲及海腎熒光值，海腎熒光為內(nèi)對照。

1.2.6 免疫沉淀法檢測HIF-1α的泛素化修飾情況 細胞作相應(yīng)處理后，PBS 洗細胞2 遍，取適量含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的WIP裂解液（碧云天）冰上裂解細胞30 min，每10 min緩慢重懸細胞裂解液，14 000 g離心5 min，取上清，加入相應(yīng)一抗，4 ℃旋轉(zhuǎn)搖床孵育過夜，加入適量ProteinA/GAgarose，孵育1～4 h，用預(yù)冷的PBS 洗脫未與抗體及磁珠結(jié)合的蛋白質(zhì)，2×1oading buffer洗脫蛋白質(zhì)，行后續(xù)Western b1ot。

1.2.7 統(tǒng)計學處理 采用SPSS22.0軟件進行統(tǒng)計學分析，結(jié)果用均數(shù)±標準差表示，兩組間比較用獨立t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 UPK1A-AS1對肝癌細胞的糖酵解的影響

將UPK1A-AS1過表達組（UPK1A-AS1）和對照組（NC）肝癌細胞置于常氧和乏氧條件下培養(yǎng)24 h，結(jié)果顯示，常氧條件下，與對照組相比，過表達UPK1A-AS1能促進培養(yǎng)基由紅色變成黃色，該現(xiàn)象是培養(yǎng)基酸化的結(jié)果（圖1A），而乳酸產(chǎn)生增加是培養(yǎng)基酸化的主要原因之一，提示過表達UPK1A-AS1可能促進肝癌細胞乳酸的形成；缺氧能增加肝癌細胞的乳酸生成，導致培養(yǎng)基由紅轉(zhuǎn)黃，而過表達UPK1A-AS1能加重該現(xiàn)象（圖1A）。糖酵解以葡萄糖消耗和乳酸生成增加為特點，葡萄糖及乳酸檢測實驗發(fā)現(xiàn)，缺氧能促進肝癌細胞葡萄糖消耗及乳酸的形成，而過表達UPK1A-AS1能進一步增強乏氧誘導的糖酵解反應(yīng)（圖1B、C）。

圖1 UPK1A-AS1對肝癌細胞糖酵解的影響Fig.1 Effect of UPK1A-AS1 on glycolysis of HCC cells.A:Alteration of medium color after corresponding treatments. B: Glucose consumption of HCC cells after corresponding treatments.C:Lactate production of HCC cells with corresponding treatments.**P＜0.01,***P＜0.001.

2.2 UPK1A-AS1對糖酵解相關(guān)基因表達的轉(zhuǎn)錄激活作用

過表達UPK1A-AS1后，檢測糖酵解相關(guān)基因的表達變化，結(jié)果顯示，與對照組相比，過表達UPK1A-AS1能明顯上調(diào)糖酵解相關(guān)基因（GLUT1、HK1、HK2、PGK1）的表達（圖2A，P＜0.01）。Western b1ot 結(jié)果顯示，缺氧能上調(diào)HIF-1α的蛋白表達，而過表達UPK1AAS1 能增加缺氧對HIF-1α的蛋白表達的促進作用（圖2B）。由于HIF-1α能通過與糖酵解相關(guān)基因啟動子區(qū)的HRE反應(yīng)元件結(jié)合，促進上述糖酵解相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄激活。因此，我們利用HRE報告載體檢測UPK1AAS1對糖酵解相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄活性的影響，結(jié)果顯示缺氧能促進HRE的轉(zhuǎn)錄活性，而過表達UPK1A-AS1能增強缺氧對HRE轉(zhuǎn)錄活性的促進作用（圖2C，P＜0.01）；反之，干擾UPK1A-AS1能逆轉(zhuǎn)乏氧對HRE轉(zhuǎn)錄活性的促進作用（圖2D，P＜0.01）。

2.3 UPK1A-AS1對HIF-1α蛋白穩(wěn)定性的影響

我們利用放線菌酮處理肝癌細胞以抑制蛋白質(zhì)的合成，結(jié)果顯示，與對照組相比，過表達UPK1A-AS1能明顯延長HIF-1α的半衰期（圖3A）。免疫共沉淀結(jié)果顯示，過表達UPK1A-AS1能降低HIF-1α的泛素化修飾水平（圖3B）。

2.4 UPK1A-AS1通過HIF-1α調(diào)控肝癌細胞的糖酵解

將肝癌細胞分為對照組（NC）、UPK1A-AS1穩(wěn)定過表達組（UPK1A-AS1）、HIF-1α 敲除組（si-HIF-1α）、UPK1A-AS1穩(wěn)定過表達聯(lián)合HIF-1α敲除組（UPK1AAS1+si-HIF-1α），將這4組細胞置于常氧和乏氧條件下培養(yǎng)24 h，檢測葡萄糖消耗、乳酸生成、HRE轉(zhuǎn)錄活性及糖酵解相關(guān)基因的表達變化。結(jié)果顯示，與圖1A結(jié)果一致，過表達UPK1A-AS1能促進缺氧誘導的培養(yǎng)基酸化，而敲除HIF-1α能逆轉(zhuǎn)這種現(xiàn)象（圖4A）。過表達UPK1A-AS1 能增強缺氧誘導的糖酵解增加，而干擾HIF-1α能消除過表達UPK1A-AS1對肝癌細胞糖酵解的促進作用（圖4B、C，P＜0.05）。與圖2C的結(jié)果一致，過表達UPK1A-AS1能增加HRE的轉(zhuǎn)錄活性，而敲除HIF-1α能消除UPK1A-AS1對HRE的轉(zhuǎn)錄活性的增強作用（圖4D，P＜0.05）。過表達UPK1A-AS1能促進糖酵解相關(guān)基因的mRNA（圖4 E～G，P＜0.01）及蛋白（圖4H）水平的表達，而干擾HIF-1α能逆轉(zhuǎn)UPK1A-AS1對糖酵解相關(guān)基因的上調(diào)作用。

圖2 UPK1A-AS1對糖酵解相關(guān)基因表達的影響Fig.2 UPK1A-AS1 upregulates expression of glycolysis-related genes.A:Expression of glycolysis-related genes in HCC cells overexpressing UPK1A-AS1 detected by qRT-PCR.B:Western blotting showing the expression of HIF-1α protein in HCC cells with UPK1A-AS1 overexpression under both normoxic and hypoxic conditions.C,D:HRE luciferase activities in HCC cells with UPK1A-AS1 overexpression(C)and downregulation(D).**P＜0.01,***P＜0.001.

圖3 UPK1A-AS1對HIF-1α蛋白穩(wěn)定性的影響Fig.3 UPK1A-AS1 stabilizes HIF-1α protein expression. A: Half-life of HIF-1α protein after UPK1A-AS1 overexpression detected by Western blotting. B: Ubiquitinated HIF-1αexamined by immunoprecipitation and Western blotting.

3 討論

缺氧是大多數(shù)實體腫瘤普遍存在的現(xiàn)象，其能導致腫瘤的局部和全身進展，并與治療反應(yīng)及預(yù)后不良顯著相關(guān)［20］。已有研究證實，缺氧通過調(diào)節(jié)多種蛋白表達增強“Warburg effect”，而1ncRNAs是否也參與了這一過程尚不清楚。鑒于1ncRNAs在基因表達中的關(guān)鍵作用，1ncRNAs在缺氧相關(guān)腫瘤惡性進展中的關(guān)鍵作用已受到廣泛關(guān)注并進行深入研究［21］。近年來，研究已發(fā)現(xiàn)一些 缺 氧 反 應(yīng) 的1ncRNAs，包 括1ncRNA-EFNA3［22］、1ncRNA-UCA1［23］、1ncRNA-AK058003［24］等。這些缺氧調(diào)節(jié)的1ncRNAs大多具有功能特征，并在一系列癌癥類型中對腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有深遠影響。然而，只有少數(shù)缺氧調(diào)控的1ncRNAs被充分研究，大多數(shù)缺氧反應(yīng)的1ncRNAs在腫瘤中對代謝重編程的作用及機制尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn)，乏氧誘導的1ncRNA UPK1A-AS1促進肝癌細胞的糖酵解水平，并闡明了UPK1A-AS1調(diào)控肝癌細胞糖酵解的潛在分子機制，為深入理解缺氧微環(huán)境/HIF-1α—1ncRNA—肝癌代謝重編程的相互作用提供新的理論基礎(chǔ)。

圖4 UPK1A-AS1通過HIF-1α調(diào)控肝癌細胞的糖酵解Fig.4 UPK1A-AS1 modulates glycolysis in HCC cells in a HIF-1α-dependent manner.A:Medium color after corresponding treatments. B: Glucose consumption of HCC cells after corresponding treatments. C: Lactate production of HCC cells corresponding treatments. D: HRE luciferase activities after corresponding treatments. E: UPK1A-AS1 expression level after corresponding treatments. F, G: Expression levels of HK1 (F) and PGK1 (G) examined by qRT-PCR. H: Western blotting showing expression levels of HIF-1α and its targets HK1 and HK2 in HCC cells.*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001.

我們課題組采用基因芯片分方法篩選在乏氧條件下受HIF-1α表達調(diào)控的基因，以期從HIF-1α-腫瘤代謝的角度深入探討肝癌的發(fā)病機制。通過芯片驗證并結(jié)合生物信息學分析，在篩選1ncRNAs 中，我們發(fā)現(xiàn)UPK1A-AS1的表達變化最顯著（未發(fā)表資料）。因此，我們錨定UPK1A-AS1做深入探討。我們首先構(gòu)建慢病毒UPK1A-AS1過表達系統(tǒng)，在培養(yǎng)細胞的過程中發(fā)現(xiàn)，過表達UPK1A-AS1能促進培養(yǎng)基的酸化，提示過表達UPK1A-AS1可能促進肝癌細胞乳酸的形成。乳酸是糖酵解的主要產(chǎn)物，因此，我們猜測UPK1A-AS1能促進肝癌細胞的“Warburg effect”。隨后，我們通過葡萄糖消耗實驗、乳酸生成實驗、糖酵解相關(guān)基因的表達實驗，發(fā)現(xiàn)UPK1A-AS1確實能促進肝癌細胞的糖酵解。本研究率先發(fā)現(xiàn)1ncRNA UPK1A-AS1在缺氧促進糖酵解過程中起著重要作用，提示1ncRNAs也可能是調(diào)節(jié)“Warburg effect”的關(guān)鍵分子。

HIF-1復合體由HIF-1α和HIF-1β組成。在常氧的條件下，HIF-1α第402和564位脯氨酸殘基經(jīng)脯氨酸羥化酶羥基化，羥基化后的HIF-1α被泛素化E3 連接酶VHL識別并被泛素化修飾，經(jīng)泛素化修飾的HIF-1α通過蛋白酶體途徑快速降解［4］。在缺氧的條件下，脯氨酸羥化酶的活性被抑制，導致HIF-1α累積并與HIF-1β結(jié)合，形成活化的HIF-1復合體，與下游靶基因啟動子區(qū)的HRE結(jié)合，促進下游靶基因的轉(zhuǎn)錄激活［25］。大量研究表明1ncRNA能參與調(diào)控HIF-1α的表達，而大部分研究發(fā)現(xiàn)1ncRNA從表觀遺傳學水平、轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控HIF1A mRNA的表達來調(diào)控HIF-1α的表達［26-27］。本研究中我們發(fā)現(xiàn)，1ncRNA UPK1A-AS1能通過延長HIF-1α的半衰期來穩(wěn)定其表達。HIF-1α被泛素化修飾后通過蛋白酶體途徑降解，由于過表達UPK1A-AS1能增加HIF-1α的穩(wěn)定性，我們猜測UPK1A-AS1可能通過減少HIF-1α的泛素化修飾來阻止HIF-1α被蛋白酶體降解，從而穩(wěn)定HIF--1α的表達。免疫共沉淀結(jié)果驗證了我們的猜想，過表達UPK1A-AS1能降低HIF-1α的泛素化修飾水平。我們的結(jié)果表明：1ncRNA UPK1A-AS1通過減少HIF-1α的泛素化修飾，使HIF-1α不被蛋白酶體降解，從而穩(wěn)定HIF-1α的蛋白表達；累積的HIF-1α與下游糖酵解相關(guān)基因（GLUT1、HK1、HK2、PGK1等）的啟動子區(qū)HRE反應(yīng)元件結(jié)合，促進上述基因的轉(zhuǎn)錄激活，從而增強缺氧誘導的肝癌細胞糖酵解能力。

HIF-1α及其靶基因控制著腫瘤進展所必須的生物學過程。近幾十年來，HIF-1α及其靶基因如LDHA、GLUT1、HK1等介導腫瘤的代謝重編程［11］，從而促進腫瘤適應(yīng)殘酷的微環(huán)境并獲得快速進展，也因其在腫瘤進展中的深刻影響，HIF-1α及其靶基因一直被認為是潛在的抗癌藥物治療靶點［28-29］。然而，HIF-1α信號網(wǎng)絡(luò)的復雜性和靶向蛋白與蛋白的相互作用使HIF-1α抑制劑的設(shè)計非常具有挑戰(zhàn)性［30］。近年來，越來越多研究者認為靶向1ncRNAs是一種很有前途的癌癥治療策略。由于1ncRNA UPK1A-AS1在HIF-1α介導的肝癌糖代謝重編程中的重要作用，其作為肝癌治療的特異性靶點具有很大的發(fā)展?jié)摿?。但是?ncRNA UPK1A-AS1是否真的能成為肝癌治療的特異性靶點仍有待深入研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)1ncRNA UPK1A-AS1能加強缺氧誘導的肝癌細胞糖酵解反應(yīng)，進一步機制研究發(fā)現(xiàn)1ncRNA UPK1A-AS1通過降低HIF-1α的泛素化修飾，阻止HIF-1α通過蛋白酶體快速降解，從而導致HIF-1α的累積；累積的HIF-1α與下游糖酵解相關(guān)基因（GLUT1、HK1、HK2、PGK1等）的啟動子區(qū)HRE反應(yīng)元件結(jié)合，促進上述基因的轉(zhuǎn)錄激活，從而增強缺氧誘導的肝癌細胞糖酵解能力；且1ncRNA UPK1A-AS1完全依賴于HIF-1α發(fā)揮其對缺氧誘導糖酵解的增強作用。