肖書(shū)毓 俞瑩 陶津華

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院眼科 201203

單純皰疹病毒性角膜炎(herpes simplex keratitis，HSK)是臨床常見(jiàn)的致盲眼病，大多數(shù)感染的病毒是Ⅰ型單純皰疹病毒(herpes simplex virus-1，HSV-1)，1%～2%的臨床患者最終可致盲[1]。這些致盲病例中大多是因HSV-1潛伏感染重新激活而導(dǎo)致，因此HSK復(fù)發(fā)模型的建立對(duì)于疾病的研究至關(guān)重要。紫外燈照射是常用的誘導(dǎo)HSK復(fù)發(fā)的手段，但以往所報(bào)道的實(shí)驗(yàn)研究中，研究者多在角膜行病毒接種后腹腔內(nèi)注射中和HSV-1的異種血清抗體，以保證小鼠的存活，但異種抗HSV血清較難獲取；而且有研究表明，不予腹腔內(nèi)注射抗HSV血清會(huì)更貼近疾病自然發(fā)生時(shí)的機(jī)體免疫表現(xiàn)[2]。本研究探討未腹腔內(nèi)注射血清抗體的BALB/c小鼠復(fù)發(fā)性HSK模型的建立方法并對(duì)其進(jìn)行鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞 選取健康5周齡BALB/c雌性小鼠84只[上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司(No.20180006001983)，許可證號(hào)：SCXK(滬)2018-0006]，所有小鼠均飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。本研究經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批文號(hào)：PZSHUTCM190222039)，動(dòng)物使用符合美國(guó)視覺(jué)和眼科研究協(xié)會(huì)的動(dòng)物使用宣言規(guī)定。非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero)由上海中醫(yī)藥大學(xué)科技實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.1.2主要試劑及儀器 HSV-KOS病毒株、DMEM溶液(上海中醫(yī)藥大學(xué)科技實(shí)驗(yàn)中心病毒實(shí)驗(yàn)室提供)；林可霉素滴眼液(上海信誼藥廠有限公司)；熒光素鈉染色試紙(天津晶明新技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司)；戊巴比妥鈉(上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。裂隙燈顯微鏡(YZ5H1，武漢科爾達(dá)醫(yī)療科技有限公司)；低溫離心機(jī)(5810R，德國(guó)Eppendorf公司)；酶標(biāo)儀(T100，美國(guó)伯樂(lè)公司)；SZM系列體氏顯微鏡(深圳市方特科技有限公司)；手持紫外燈照射儀、紫外照射防護(hù)袋(上海熙浩實(shí)業(yè)有限公司)；倒置細(xì)胞顯微鏡(EVOS M5000，美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 任取12只小鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法按照紫外燈照射時(shí)間不同分為紫外燈照射3 min組、紫外燈照射2 min 45 s組和紫外燈照射2 min 30 s組，每組4只小鼠，確定最適紫外燈照射參數(shù)。將剩余72只小鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對(duì)照組、模型組和復(fù)發(fā)組，每組24只。

1.2.2紫外燈照射參數(shù)的篩選 右手拇指、食指抓取小鼠雙耳及頸后皮膚，小指固定尾部，使小鼠右眼正面向上。右手固定小鼠后套上紫外照射防護(hù)袋，防護(hù)袋有直徑0.6 cm小孔使小鼠僅右眼暴露于紫外燈照射下，將手持紫外燈置于距離小鼠右眼上方5 cm處，按照分組進(jìn)行不同時(shí)間的照射。于紫外燈照射后2 min和3 d，采用林可霉素滴眼液浸潤(rùn)熒光素鈉試紙行小鼠右眼染色，裂隙燈顯微鏡下觀察角膜染色情況并拍照，選擇最佳照射條件。

1.2.3初次感染造模 空白對(duì)照組、模型組和復(fù)發(fā)組小鼠按照10 ml/kg經(jīng)腹腔內(nèi)注射戊巴比妥鈉行全身麻醉。采用文獻(xiàn)[1]描述的方法用醫(yī)用手術(shù)刀片在小鼠右眼角膜上皮劃開(kāi)#字，空白對(duì)照組術(shù)眼滴入5 μl生理鹽水，模型組和復(fù)發(fā)組小鼠術(shù)眼滴入HSV-1病毒懸液1×106PFU各5 μl，用無(wú)菌棉簽輕輕按摩術(shù)眼使病毒懸液充分吸收；麻醉時(shí)所有小鼠對(duì)側(cè)眼均用5 μl生理鹽水點(diǎn)眼以保持眼部濕潤(rùn)。造模后1 h觀察小鼠的復(fù)蘇情況，造模后1～3 d每只小鼠早晚分別用林可霉素滴眼液點(diǎn)眼1次，預(yù)防細(xì)菌感染，并且所有小鼠不予腹腔內(nèi)注射HSV-1異種血清抗體。HSV-1病毒懸液接種后第3天，用熒光素鈉試紙染色后在裂隙燈顯微鏡下觀察到角膜上皮點(diǎn)狀或樹(shù)枝狀缺損，標(biāo)志初次病毒感染造模成功。然后用DMEM溶液沾濕的無(wú)菌棉棒在72只小鼠的右眼上擦拭，將棉棒放入DMEM溶液試管中震蕩，離心半徑15 cm，4 ℃條件下2 000 r/min離心5 min，吸出200 μl上清液放入48孔板的Vero細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)觀察。

1.2.4復(fù)發(fā)感染造模 初次感染后5周，裂隙燈顯微鏡下檢查小鼠雙眼角膜，排除HSK的自發(fā)性復(fù)發(fā)。然后對(duì)復(fù)發(fā)組24只小鼠進(jìn)行紫外燈照射(紫外線B-302 nm)復(fù)發(fā)造模處理。給予小鼠右眼2 min 45 s的紫外燈復(fù)發(fā)照射，照射劑量為2.104 mJ/cm2，將無(wú)菌棉球在紫外燈復(fù)發(fā)照射前置于1 ml DMEM培養(yǎng)液中，在紫外燈照射前和照射后1～7 d，每天用無(wú)菌棉棒在72只小鼠的右眼上擦拭，將角膜擦拭液相對(duì)應(yīng)地放入48孔板的Vero細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)觀察來(lái)確定病毒活化脫落。

1.2.5小鼠眼表病變表現(xiàn)及評(píng)價(jià) 參照Ando計(jì)分法及Trousdale計(jì)分法[3-4]，裂隙燈顯微鏡照相和解剖顯微鏡下檢查并評(píng)價(jià)角膜基質(zhì)混濁和瞼緣炎的嚴(yán)重程度，采用0～4分評(píng)分法[1]。(1)角膜基質(zhì)混濁的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn) 0分：角膜基質(zhì)清晰透明；1分：角膜基質(zhì)稍混濁；2分：角膜基質(zhì)中度混濁，可透見(jiàn)后部虹膜特征；3分：角膜基質(zhì)重度混濁不透明，但仍可判斷瞳孔緣的位置；4分：角膜基質(zhì)完全混濁，不能看到后部特征。(2)瞼緣炎評(píng)分標(biāo)準(zhǔn) 0分：無(wú)病變；1分：輕度眼瞼腫脹；2分：中度眼瞼腫脹和眼球分泌物；3分：眼瞼嚴(yán)重腫脹，中度眼周皮膚脫落和病變；4分：眼瞼嚴(yán)重腫脹，嚴(yán)重的眼周皮膚脫落和病變。眼表病變總評(píng)分=角膜基質(zhì)混濁程度評(píng)分+瞼緣炎評(píng)分。

1.2.6復(fù)發(fā)性HSK的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)及鑒定指標(biāo) 采用文獻(xiàn)[5]的方法和標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)紫外燈照射后的角膜擦拭液進(jìn)行Vero細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞形態(tài)學(xué)發(fā)生漂浮、聚攏、變形等改變(cytopathic effect，CPE病變)且角膜熒光染色觀察到角膜深層或淺層病變即可確定為HSK復(fù)發(fā)。鑒定指標(biāo)包括小鼠眼表病變?cè)u(píng)分、角膜染色病變表現(xiàn)及CPE病變陽(yáng)性率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad 7.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件(序列號(hào)：GPS-0320559-LFUL-95242)和Excel軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。本研究中計(jì)量資料經(jīng)W檢驗(yàn)證實(shí)符合正態(tài)分布，以mean±SD表示，組間均數(shù)經(jīng)Levene檢驗(yàn)證實(shí)方差齊。采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，空白對(duì)照組、模型組和復(fù)發(fā)組小鼠紫外燈照射后不同時(shí)間點(diǎn)眼表癥狀評(píng)分比較采用重復(fù)測(cè)量?jī)梢蛩胤讲罘治?，多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)。模型組與復(fù)發(fā)組小鼠角膜擦拭液細(xì)胞培養(yǎng)CPE病變陽(yáng)性率比較采用卡方檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 紫外燈照射后小鼠角膜表現(xiàn)

紫外燈照射3 min組小鼠照射后2 min角膜染色可見(jiàn)輕度水腫，3 h后水腫消失，照射后3 d角膜染色可見(jiàn)少量色素沉著；紫外燈照射2 min 45 s組小鼠照射后2 min角膜染色可見(jiàn)輕度水腫，3 h后水腫消失，照射后3 d角膜染色未見(jiàn)色素沉著，角膜透明；紫外燈照射2 min 30 s組小鼠照射后2 min角膜無(wú)水腫，照射后3 d角膜染色未見(jiàn)色素沉著，角膜透明(圖1)。故選取照射時(shí)長(zhǎng)2 min 45 s為紫外燈照射最適條件。

圖1 紫外燈照射后不同時(shí)間點(diǎn)小鼠角膜染色圖 A：照射后2 min，紫外燈照射3 min組小鼠角膜輕度水腫 B：照射后3 d，紫外燈照射3 min組小鼠角膜可見(jiàn)輕度染色 C：照射后2 min，紫外燈照射2 min 45 s組小鼠角膜輕度水腫 D：照射后3 d，紫外燈照射2 min 45 s組小鼠角膜透明，未見(jiàn)色素沉著 E：照射后2 min，紫外燈照射2 min 30 s組小鼠角膜未見(jiàn)水腫 F：照射后3 d，紫外燈照射2 min 30 s組小鼠角膜透明，未見(jiàn)色素沉著Figure 1 Corneal staining of mice in different groups at different time points after ultraviolet light irradiation A：Two minutes after ultraviolet light irradiation，the 3 minutes group mice showed slight corneal edema B：Three days after ultraviolet light irradiation，a small amount of pigmentation was found in the cornea of 3 minutes group C：Two minutes after ultraviolet light irradiation，the 2 minutes 45 seconds group mice showed slight corneal edema D：Three days after ultraviolet light irradiation，no pigmentation was found，and the cornea was transparent in the 2 minutes 45 seconds group E：Two minutes after ultraviolet light irradiation，no corneal edema was found in the 2 minutes 30 seconds group F：Three days after ultraviolet light irradiation，no pigmentation was found，and the cornea was transparent in the 2 minutes 30 seconds group

2.2 初次病毒感染后和紫外燈照射后小鼠眼表表現(xiàn)

復(fù)發(fā)組小鼠初次病毒感染后3 d右眼出現(xiàn)角膜混濁，角膜呈點(diǎn)狀染色，分泌物增多。初次病毒感染后1周，復(fù)發(fā)組小鼠右眼角膜逐漸恢復(fù)光滑。初次病毒感染后5周，模型組和復(fù)發(fā)組小鼠眼瞼輕度腫脹，角膜透明。紫外燈照射后3 d，空白對(duì)照組小鼠角膜透明、光滑，復(fù)發(fā)組小鼠角膜水腫 、混濁，出現(xiàn)地圖樣或樹(shù)枝狀染色(圖2)。復(fù)發(fā)組有75%(18/24)的小鼠出現(xiàn)較明顯的眼表感染癥狀。

圖2 初次病毒感染后和紫外燈照射后小鼠角膜染色圖 A：初次病毒感染后3 d復(fù)發(fā)組小鼠角膜呈點(diǎn)狀染色 B：紫外燈照射后3 d，空白對(duì)照組小鼠角膜光滑、透明 C：紫外燈照射后3 d，復(fù)發(fā)組小鼠角膜混濁，呈現(xiàn)地圖樣染色，中度眼周皮膚脫落 D：紫外燈照射后3 d，復(fù)發(fā)組小鼠角膜出現(xiàn)樹(shù)枝狀染色，輕度眼周皮膚脫落Figure 2 Corneal staining of mice in different groups after ultraviolet light irradiation and initial viral infection A：Three days after the initial viral infection，the cornea of the mice in the recurrence group showed punctate staining B：Three days after ultraviolet light irradiation，the cornea of the mice in the blank control group showed smooth and transparent C：Three days after ultraviolet light irradiation，the cornea of the mice in the recurrence group showed opacity，geographic staining，and moderate periocular skin exfoliation D：Three days after ultraviolet light irradiation，the corneal staining of the mice in the recurrence group showed dendritic staining and mild periocular skin exfoliation

2.3 各組小鼠紫外燈照射后不同時(shí)間點(diǎn)眼表病變癥狀評(píng)分

紫外燈照射后1 d，復(fù)發(fā)組小鼠眼表病變癥狀評(píng)分較空白對(duì)照組小鼠高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.047)，復(fù)發(fā)組小鼠眼表病變癥狀評(píng)分較模型組小鼠略高，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。紫外燈照射后3 d，復(fù)發(fā)組小鼠眼表病變癥狀評(píng)分較空白對(duì)照組、模型組小鼠高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002、0.003)。紫外燈照射后7 d，復(fù)發(fā)組小鼠眼表病變癥狀評(píng)分較空白對(duì)照組小鼠高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.024)；復(fù)發(fā)組小鼠眼表病變癥狀評(píng)分較模型組小鼠略高，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.069)(表1)。

表1 各組小鼠紫外燈照射后不同時(shí)間點(diǎn)眼表癥狀評(píng)分比較(mean±SD,分)Table 1 Comparison of ocular symptom score among different groups after ultraviolet light irradiation at different time points (mean±SD,score)組別眼數(shù)紫外燈照射后不同時(shí)間點(diǎn)眼表癥狀評(píng)分0d1d3d7d空白對(duì)照組240.167±0.3730.333±0.4710.000±0.0000.167±0.373模型組241.500±0.5001.500±0.7640.833±0.3731.000±0.577復(fù)發(fā)組240.833±0.3732.667±0.943a5.167±2.267ab3.000±1.155a 注:F組別=48.84,P<0.01;F時(shí)間=5.00,P<0.01.與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)空白對(duì)照組比較,aP<0.05;與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)模型組比較,bP<0.05(重復(fù)測(cè)量?jī)梢蛩胤讲罘治?LSD-t檢驗(yàn)) Note:Fgroup=48.84,P<0.01;Ftime=5.00,P<0.01.Compared with the blank control group,aP<0.05;Compared with the model group,bP<0.05(Repeated measurement two-way ANOVA,LSD-t test)

2.4 小鼠角膜擦拭液細(xì)胞培養(yǎng)CPE病變表現(xiàn)

小鼠角膜擦拭液細(xì)胞培養(yǎng)后5 d，復(fù)發(fā)組共有17只小鼠角膜擦拭液樣本的細(xì)胞培養(yǎng)出現(xiàn)CPE病變，細(xì)胞培養(yǎng)液未變色(圖3)，陽(yáng)性率為71%(17/24)，模型組CPE病變陽(yáng)性率為8%(2/24)，細(xì)胞培養(yǎng)液顏色變黃，復(fù)發(fā)組CPE病變陽(yáng)性率明顯高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=19.601，P=0.001)(表2)。

圖3 小鼠角膜擦拭液細(xì)胞培養(yǎng)CPE病變圖(×200，標(biāo)尺=200 μm) 空白對(duì)照組、模型組和復(fù)發(fā)組紫外燈照射前小鼠角膜擦拭液細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，培養(yǎng)基顏色無(wú)變化；紫外燈照射后空白對(duì)照組小鼠角膜擦拭液細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，培養(yǎng)基顏色變黃，模型組小鼠角膜擦拭液細(xì)胞形態(tài)部分皺縮、變形，培養(yǎng)基顏色變黃，復(fù)發(fā)組小鼠角膜擦拭液細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)皺縮、聚攏改變，培養(yǎng)基顏色無(wú)變化Figure 3 CPE lesions of Vero cells cultured in corneal wiping fluid from mice of different groups (×200，bar=200 μm) In the blank control group，model group and recurrence group，the Vero cells was in a long spindle shape，and the color of the medium had no change before ultraviolet light irradiation；in the blank control group after ultraviolet light irradiation，the Vero cells was in a long spindle shape，and the culture medium turned yellow；in the model group after ultraviolet light irradiation，the Vero cells was partially shrunk and deformed，and the culture medium turned yellow；in the recurrence group after ultraviolet light irradiation，the Vero cells showed shrunk and gathered，and the color of the medium did not change

表2 模型組與復(fù)發(fā)組小鼠角膜擦拭液細(xì)胞培養(yǎng)CPE病變陽(yáng)性率比較Table 2 Comparison of the number of CPE lesion in Vero cells cultured in corneal wiping fluid between model group and recurrence group組別樣本量CPE病變數(shù)未有CPE病變數(shù)CPE病變陽(yáng)性率(%)模型組242228復(fù)發(fā)組2417771χ2值19.601P值0.001 注:(χ2檢驗(yàn)) CPE病變:細(xì)胞形態(tài)學(xué)發(fā)生漂浮、聚攏、變形等改變 Note:(χ2test) CPE lesion:the morphological changes of cells such as floating,agglomeration and deformation occurred

3 討論

HSV-1在世界范圍內(nèi)流行，據(jù)統(tǒng)計(jì)約90%的人攜帶該病毒[6-7]。面對(duì)如此龐大的感染人群，建立一個(gè)可靠的動(dòng)物模型對(duì)于研究疾病潛伏期/再激活、控制復(fù)發(fā)的機(jī)制和測(cè)試治療性疫苗和藥物療效至關(guān)重要。HSK的小鼠復(fù)發(fā)模型相比其他動(dòng)物模型更有優(yōu)勢(shì)，小鼠復(fù)發(fā)模型中的臨床特征可模擬人類疾病中觀察到的許多癥狀[3]。

以往研究中病毒性角膜炎復(fù)發(fā)造模時(shí)通常會(huì)在模型初次感染病毒之后注射人抗HSV血清以中和病毒，減少HSV-1病毒感染后急性眼病引起的小鼠死亡和角膜損傷，保證小鼠的存活[1]。但抗HSV血清獲取困難，增加了造模的不便。有研究顯示臨床上成年人血清抗體陽(yáng)性率較高，但對(duì)疾病診斷和評(píng)估意義不大[8]；還有研究顯示免疫血清的注射可能調(diào)節(jié)先天性和獲得性皰疹免疫[2]，我們認(rèn)為抗體注射改變了病毒感染的自然過(guò)程，從而改變?cè)俅伪┞队诓《究乖?即重新激活的病毒)后對(duì)HSV-1的記憶免疫反應(yīng)。因此，造模過(guò)程中避免使用血清抗體能更貼近自然的臨床情況。本研究結(jié)果顯示,未給予腹腔內(nèi)抗HSV血清注射不會(huì)影響小鼠的存活率，且未對(duì)模型后續(xù)的建立和處理造成影響。HSK的病程始于HSV-1的初次感染，隨后是病毒進(jìn)入感覺(jué)神經(jīng)和自主神經(jīng)節(jié)的潛伏期，復(fù)發(fā)的基礎(chǔ)是病毒的潛伏和復(fù)發(fā)因素的影響，與是否注入抗HSV血清并無(wú)密切關(guān)系。

HSK復(fù)發(fā)的機(jī)制為機(jī)體免疫力下降，潛伏的病毒在小鼠模型中激活，沿三叉神經(jīng)逆行至靶組織引起發(fā)病[9]。在小鼠體內(nèi)潛伏感染的HSV-1幾乎不會(huì)自發(fā)激活，紫外燈照射法是HSK復(fù)發(fā)模型采用的誘導(dǎo)復(fù)發(fā)手段之一，此法既會(huì)導(dǎo)致淚液中病毒的重新激活和部分脫落，又會(huì)導(dǎo)致HSK的復(fù)發(fā)[10]。因?yàn)樵摲椒ㄏ鄬?duì)安全、有效，并且與人感染情況相近，故常規(guī)采用此法。為排除紫外燈照射法對(duì)BALB/c小鼠角膜的影響，本研究專門(mén)設(shè)置了紫外燈照射時(shí)間篩選實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示紫外燈照射在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間下對(duì)于角膜的影響僅是短暫的輕度水腫，照射后3 d角膜染色無(wú)異常，眼表?yè)p傷恢復(fù)。在此研究中確定了紫外燈照射時(shí)長(zhǎng)為2 min 45 s，相較于其他研究的3 min照射時(shí)長(zhǎng)更短，可避免照射時(shí)紫外燈對(duì)于眼表?yè)p傷的影響。

本研究中初次病毒感染后3 d，復(fù)發(fā)組小鼠右眼角膜出現(xiàn)混濁，角膜呈現(xiàn)點(diǎn)狀染色，標(biāo)志著復(fù)發(fā)組小鼠初次病毒感染成功。紫外燈照射后3 d，角膜呈現(xiàn)地圖狀和樹(shù)枝狀染色改變，右眼分泌物增多，部分小鼠出現(xiàn)雙眼同時(shí)感染的情況，推測(cè)病毒在潛伏時(shí)會(huì)出現(xiàn)眼位遷移，這也提示我們?cè)谂R床上應(yīng)注意疾病的早期預(yù)防，防止遷移發(fā)病。目前大多學(xué)者認(rèn)為HSV-1感染人體后可在三叉神經(jīng)元中潛伏，易形成終生潛伏感染狀態(tài)[11]；也有研究認(rèn)為，角膜亦可能是病毒潛伏的場(chǎng)所和HSK復(fù)發(fā)的另一個(gè)潛在根源[12]。觀察感染小鼠角膜擦拭液對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)的影響是鑒定小鼠HSK復(fù)發(fā)的一個(gè)依據(jù)，在HSV-1的作用下，Vero細(xì)胞形態(tài)會(huì)發(fā)生CPE病變，這被認(rèn)為是確認(rèn)病毒再活化的依據(jù)[1]。在紫外燈照射后，復(fù)發(fā)組小鼠角膜擦拭液細(xì)胞培養(yǎng)出現(xiàn)CPE病變，細(xì)胞培養(yǎng)液未變色，顯示細(xì)胞因病毒感染未過(guò)度生長(zhǎng)，培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)未耗竭；空白對(duì)照組小鼠角膜擦拭液細(xì)胞培養(yǎng)未出現(xiàn)CPE病變，因細(xì)胞過(guò)度生長(zhǎng)，培養(yǎng)液營(yíng)養(yǎng)耗竭，顏色變黃。復(fù)發(fā)組較模型組小鼠細(xì)胞培養(yǎng)CPE病變陽(yáng)性率更高，說(shuō)明誘導(dǎo)HSK復(fù)發(fā)建模成功。

此外，并非所有HSV-1潛伏感染的小鼠在紫外燈照射后都會(huì)在淚膜中檢測(cè)到病毒脫落，但這并不意味著它們不能被成功激活[13]，可能是病毒數(shù)量過(guò)低，通過(guò)角膜擦拭液的細(xì)胞培養(yǎng)無(wú)法檢測(cè)到。復(fù)發(fā)大多會(huì)造成角膜基質(zhì)層的損傷，導(dǎo)致嚴(yán)重且反復(fù)發(fā)作的臨床表現(xiàn)，包括角膜混濁、新生血管形成等[14]。每天用裂隙燈顯微鏡檢查角膜染色表現(xiàn)，角膜呈現(xiàn)樹(shù)枝狀、地圖狀等表現(xiàn)結(jié)合眼表病變癥狀評(píng)分可幫助評(píng)判HSK的復(fù)發(fā)。隨著疾病發(fā)展，復(fù)發(fā)組小鼠眼表病變癥狀評(píng)分逐漸升高，在紫外燈照射后3 d，復(fù)發(fā)組小鼠眼部表現(xiàn)明顯，眼表病變癥狀評(píng)分最高；紫外燈照射后7 d，眼表病變癥狀評(píng)分開(kāi)始下降；模型組及空白對(duì)照組小鼠眼表病變癥狀評(píng)分相對(duì)較低。紫外燈照射后，眼表的表現(xiàn)和角膜擦拭液細(xì)胞培養(yǎng)CPE病變陽(yáng)性率2個(gè)指標(biāo)結(jié)合可鑒定復(fù)發(fā)模型的建立是否成功。復(fù)發(fā)組小鼠中細(xì)胞培養(yǎng)CPE病變陽(yáng)性率為71%，裂隙燈顯微鏡下觀察復(fù)發(fā)組中75%小鼠有眼部表現(xiàn)，部分小鼠有眼表表現(xiàn)而未觀察到細(xì)胞的CPE病變，故2個(gè)指標(biāo)綜合計(jì)算復(fù)發(fā)建模成功率可達(dá)71%。此造模方法的免疫學(xué)評(píng)價(jià)還有待進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果顯示紫外燈照射可成功誘導(dǎo)未注射中和血清抗體的HSK小鼠復(fù)發(fā)，造模成功率高，制作過(guò)程簡(jiǎn)便可控，是研究復(fù)發(fā)性HSK合適的模型。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明肖書(shū)毓：實(shí)驗(yàn)操作、論文撰寫(xiě)、數(shù)據(jù)整理、統(tǒng)計(jì)分析；俞瑩：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和指導(dǎo)、論文修改、經(jīng)費(fèi)支持；陶津華：文獻(xiàn)查找