張敏倩,劉功良*,費永濤,白衛(wèi)東,艾連中,俞劍燊

1(仲愷農(nóng)業(yè)工程學院 輕工食品學院,廣東 廣州,510225) 2(上海理工大學 醫(yī)療器械與食品學院,上海,200093)3(上海金楓酒業(yè)股份有限公司,上海,200120)

海藻糖是一種甜度較低的非還原性二糖,在生物細胞中與蛋白質(zhì)或脂質(zhì)之間形成的氫鍵在脅迫條件下具有穩(wěn)定細胞膜和蛋白質(zhì)結構的特性[1-2]。相較葡萄糖等其他糖類,化學性質(zhì)穩(wěn)定,可以通過影響細胞壁的合成而對細胞的生長和毒力產(chǎn)生影響[3]。由于海藻糖的特殊性,在食品領域不僅可以作為食品添加劑與其他甜味劑混合使用來降低甜味劑產(chǎn)生齲齒的副作用,還可以防止食品中的蛋白質(zhì)在干燥或冷凍環(huán)境中發(fā)生變性[4]；在化妝品領域,海藻糖由于自身所具有的保濕性而廣泛應用于化妝品中,可有效地緩解皮膚的干燥問題[5]；在醫(yī)學領域,可制成衍生物用于抗癌劑[6]、抗腫瘤劑[7]中,作為功能糖可防止代謝綜合癥[8]、緩解亨廷頓病[9]和有助于治療許多涉及氧化應激和自噬功能障礙的慢性疾病[10]；在農(nóng)業(yè)領域,海藻糖可增強農(nóng)作物的抗逆性[11-12],運用轉基因技術培育耐鹽堿型農(nóng)作物、抗凍果蔬等[13]。

目前主要通過化學合成、微生物發(fā)酵和提取、酶合成方法制備海藻糖[11,14]。其中酶合成法大多與基因工程技術聯(lián)用[15-18],雖然該方法可有效提高海藻糖的合成率,但應用于食品等領域因涉及轉基因問題,需要引起人們的特別重視。從食品級微生物如釀酒酵母或面包酵母中提取或通過發(fā)酵的方法來合成海藻糖的研究受到廣泛重視[19-20]。研究表明,在干燥、高溫、高滲透等惡劣環(huán)境下,酵母內(nèi)的應激物代謝機制導致其胞內(nèi)海藻糖積累量會明顯上升[21-23],改變細胞培養(yǎng)條件是提高海藻糖產(chǎn)量的關鍵之一。

因此,為實現(xiàn)利用食品級微生物并通過微生物發(fā)酵這一途徑合成海藻糖的目的,本研究以從蜂蜜中分離并經(jīng)保藏的耐高糖酵母LGL-2為研究對象,由于該酵母具有耐高滲的特性,應激物代謝更為活躍使其具有高產(chǎn)海藻糖的能力[24],并通過單因素和響應面試驗確定其高產(chǎn)海藻糖的最優(yōu)培養(yǎng)條件,為該菌株的產(chǎn)業(yè)化應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株

蜂蜜接合酵母LGL-2,保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心,菌種保藏號為：CCTCC M 2016787。

1.2 試劑與儀器

葡萄糖,廣東環(huán)凱微生物科技股份有限公司；無水亞硫酸鈉、蒽酮,天津市福晨化學試劑廠；濃硫酸,天津市大茂化學試劑廠；苯酚,西隴科學股份有限公司；3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid,DNS),天津市永大化學試劑有限公司；酒石酸鉀鈉,天津市百世化工有限公司；以上試劑均為分析純。

高速冷凍離心機(Neo15R),上海力申科學儀器有限公司；雙光束紫外可見分光光度計(TU-1901),北京普析通用儀器有限責任公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌種的活化與擴培

從超低溫冰箱中取出蜂蜜接合酵母LGL-2,于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min。制備糖質(zhì)量濃度為700 g/L的試管斜面固體培養(yǎng)基,挑取1環(huán)酵母在培養(yǎng)基斜面劃線培養(yǎng)96 h,直至出現(xiàn)菌落。從斜面中挑取2環(huán)活化的菌株于10 mL糖質(zhì)量濃度為400 g/L的培養(yǎng)液中,28 ℃、180 r/min恒溫搖床培養(yǎng)48 h后,將10 mL發(fā)酵液倒入90 mL糖質(zhì)量濃度為400 g/L的培養(yǎng)液中,28 ℃、180 r/min恒溫搖床培養(yǎng)48 h,即成接種液。

1.3.2 酵母細胞中海藻糖的提取

將100 mL發(fā)酵液分成2份,參照酵母細胞中海藻糖的提取方法[25],利用高溫使酵母的細胞壁破裂,使其胞內(nèi)海藻糖流出。處理完后取1 g酵母泥加入10 mL去離子水,經(jīng)水浴和離心即得酵母海藻糖提取液。

1.3.3 海藻糖的測定

蒽酮-硫酸比色法結合DNS比色法測得的非還原糖含量與高效液相色譜法測得的結果相似[26],可用來簡便地測量海藻糖含量。

1.3.3.1 DNS比色法測還原糖

取1 mL待測液,采用DNS法[27]測定發(fā)酵液中的還原糖質(zhì)量濃度(ρ1),單位為mg/mL。

1.3.3.2 蒽酮-硫酸比色法測總糖

取待測溶液2 mL,參照蒽酮-硫酸比色法[28]檢測發(fā)酵液中的吸光度A。

1.3.3.3 海藻糖的含量計算

標準曲線方程如表1所示。

表1 比色法的標準曲線方程及相關系數(shù)Table 1 Standard curve equation and correlation coefficient of colorimetry

海藻糖的含量按公式(1)計算：

(1)

式中：ρ,海藻糖含量,mg/g；f,海藻糖提取液的稀釋倍數(shù)；m,所得酵母泥的干質(zhì)量,g；10,酵母泥的稀釋倍數(shù)。

1.3.4 單因素試驗

1.3.4.1 發(fā)酵時間對蜂蜜接合酵母積累海藻糖的影響

以體積分數(shù)為10%的接種量將蜂蜜接合酵母接種在糖質(zhì)量濃度為400 g/L的培養(yǎng)液中,在28 ℃,180 r/min的搖床中分別培養(yǎng) 48、60、72、84 和96 h,發(fā)酵結束后按照1.3.2和1.3.3小節(jié)中的方法對酵母胞內(nèi)海藻糖進行提取和測定。

1.3.4.2 接種量對蜂蜜接合酵母積累海藻糖的影響

分別以體積分數(shù)為4%、6%、8%、10%和12%的接種量,將蜂蜜接合酵母接種在糖質(zhì)量濃度為400 g/L的培養(yǎng)液中,在28 ℃,180 r/min的搖床中培養(yǎng)84 h,發(fā)酵結束后按照1.3.2和1.3.3小節(jié)中的方法對酵母胞內(nèi)海藻糖進行提取和測定。

1.3.4.3 培養(yǎng)溫度對蜂蜜接合酵母積累海藻糖的影響

以最適接種量將蜂蜜接合酵母接種在糖質(zhì)量濃度為400 g/L的培養(yǎng)液中,分別在20、24、28、30 和32 ℃和180 r/min的搖床中分別培養(yǎng)84 h,發(fā)酵結束后按照1.3.2和1.3.3小節(jié)中的方法對酵母胞內(nèi)海藻糖進行提取和測定。

1.3.4.4 葡萄糖初始質(zhì)量濃度對蜂蜜接合酵母積累海藻糖的影響

以最適接種量將蜂蜜接合酵母接種在糖質(zhì)量濃度分別為300、400、500、600和700 g/L的培養(yǎng)液中,在最適溫度和180 r/min的搖床中分別培養(yǎng)84 h,發(fā)酵結束后按照1.3.2和1.3.3小節(jié)中的方法對酵母胞內(nèi)海藻糖進行提取和測定。

1.3.4.5 轉速對蜂蜜接合酵母積累海藻糖的影響

以最適接種量將蜂蜜接合酵母接種在最適糖質(zhì)量濃度的培養(yǎng)液中,以最適溫度,在搖床轉速分別為90、120、150、180和210 r/min的搖床中分別培養(yǎng)84 h,發(fā)酵結束后按照1.3.2和1.3.3小節(jié)中的方法對酵母胞內(nèi)海藻糖進行提取和測定。

1.3.5 Box-Behnken響應面試驗

選取發(fā)酵時間、培養(yǎng)溫度、葡萄糖初始質(zhì)量濃度3個因素,借助實驗設計軟件Design-Expert(Version 8.0.6),以海藻糖的產(chǎn)量為響應值,設計3因素3水平的響應面優(yōu)化實驗。再擬定回歸方程確定蜂蜜接合酵母積累海藻糖的最佳參數(shù)。利用響應面模型優(yōu)化的最佳培養(yǎng)條件進行發(fā)酵實驗,以海藻糖最高產(chǎn)量的試驗組進行驗證實驗。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個實驗重復3次,取平均值。采用SPSS 17.0進行單因素方差分析與顯著性差異分析,運用Origin 9.0軟件進行作圖,Design-Expert 8.0.6進行Box-Behnken試驗設計。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 發(fā)酵時間對蜂蜜接合酵母積累海藻糖的影響

由圖1可知,在酵母的發(fā)酵時間由48 h增加到84 h的過程中,酵母積累代謝產(chǎn)生的海藻糖隨發(fā)酵時間的增加而明顯增多,發(fā)酵84 h時,海藻糖積累量達到最大值,此時的海藻糖含量為65.27 mg/g；當發(fā)酵時間大于84 h時,隨著發(fā)酵時間的增加，海藻糖的積累量不再呈上升趨勢,因此,選取84 h為蜂蜜接合酵母的最佳發(fā)酵時間。根據(jù)以往研究,該酵母在50 h左右進入平穩(wěn)期,開始積累代謝產(chǎn)物,84 h時代謝產(chǎn)物積累量達到最大,菌體開始進入衰亡期。王玲等[29]研究了菠蘿果酒酵母菌的生長曲線,發(fā)現(xiàn)在對數(shù)生長期時海藻糖幾乎沒有積累,但當?shù)竭_穩(wěn)定期時,酵母細胞內(nèi)的海藻糖-6-磷酸合成酶的活性大幅度提高,本實驗結果與其一致,解釋了海藻糖含量在48～84 h內(nèi)的激增原因。

圖1 發(fā)酵時間對蜂蜜接合酵母積累海藻糖的影響Fig.1 Effects of fermentation time on trehalose production in yeast

2.1.2 接種量對蜂蜜接合酵母積累海藻糖的影響

由圖2可知,當酵母的接種量從4%(體積分數(shù))提升到10%時,酵母積累代謝產(chǎn)生的海藻糖隨著接種量的提高而逐漸增加,接種量為10%時海藻糖積累量達到最大值,此時的海藻糖含量為68.22 mg/g；當接種量大于10%時,海藻糖的積累量隨著接種量的提高反而明顯下降,因此,選取10%接種量為蜂蜜接合酵母的最佳接種量。當接種的酵母數(shù)量過多時,在基質(zhì)濃度一定的培養(yǎng)環(huán)境中,酵母菌得不到足夠的營養(yǎng)物質(zhì),反而會導致其生長代謝受限制,同時,海藻糖作為細胞的代謝產(chǎn)物有可能作為供能物質(zhì)而被消耗,致使海藻糖含量降低；當接種的酵母數(shù)量過少時,菌體的群體數(shù)量相對減少,導致整體的發(fā)酵速度緩慢,積累代謝產(chǎn)生海藻糖的量也隨之減少。柴麗紅等[30]以釀酒酵母為實驗材料,研究了接種量對其海藻糖積累量的影響,發(fā)現(xiàn)當接種量為10%時,酵母中海藻糖產(chǎn)量達到最大值,說明過高或過低的接種量都會導致海藻糖的產(chǎn)量下降。

圖2 接種量對蜂蜜接合酵母積累海藻糖的影響Fig.2 Effects of inoculum on trehalose production in yeast

2.1.3 培養(yǎng)溫度對蜂蜜接合酵母積累海藻糖的影響

由圖3可知,當培養(yǎng)溫度在20～28 ℃范圍內(nèi)上升時,酵母積累代謝產(chǎn)生的海藻糖隨著培養(yǎng)溫度的上升而逐漸增加,培養(yǎng)溫度為28 ℃時海藻糖積累量達到最大值,此時的海藻糖含量為71.10 mg/g；當培養(yǎng)溫度達到32 ℃時,海藻糖的積累量沒有明顯的變化,但超過32 ℃后,海藻糖累積量隨著培養(yǎng)溫度的升高反而明顯下降,考慮能耗問題,選取28 ℃為蜂蜜接合酵母的最佳培養(yǎng)溫度。過低的溫度會抑制酵母細胞內(nèi)與海藻糖合成相關酶的活性,導致海藻糖的積累量降低；而這些酶的活性會隨著溫度的升高而增強,逐漸積累海藻糖；但過高的溫度也會影響酵母的生長繁殖,因此,要在適當范圍內(nèi)提高培養(yǎng)溫度。趙玉巧[31]在5 L發(fā)酵罐中研究溫度對釀酒酵母積累海藻糖的影響,發(fā)現(xiàn)在37 ℃時海藻糖產(chǎn)量達到最高為182 mg/g,而菌體生物量則在27 ℃時達到最大,說明海藻糖積累的最適溫度與菌株的最適生長溫度不一致,這與海藻糖需要在苛刻環(huán)境下才會在微生物體內(nèi)大量積累的結論相吻合[32]。

圖3 培養(yǎng)溫度對蜂蜜接合酵母積累海藻糖的影響Fig.3 Effects of culture temperature on trehalose production in yeast

2.1.4 葡萄糖初始質(zhì)量濃度對蜂蜜接合酵母積累海藻糖的影響

由圖4可知,當發(fā)酵液的起始糖質(zhì)量濃度由300 g/L升高至400 g/L時,酵母積累代謝產(chǎn)生的海藻糖隨著葡萄糖初始質(zhì)量濃度的升高而逐漸增加,發(fā)酵液的起始糖質(zhì)量濃度為400 g/L時海藻糖積累量達到最大值,此時的海藻糖含量為42.47 mg/g；當葡萄糖初始質(zhì)量濃度高于400 g/L時,海藻糖的積累量隨著糖質(zhì)量濃度的提高反而明顯下降,因此,選取400 g/L為蜂蜜接合酵母的最佳葡萄糖初始濃度。海藻糖是重要的抗高滲保護劑,在一定范圍內(nèi)的高滲環(huán)境脅迫下,蜂蜜接合酵母會應激產(chǎn)生更多的海藻糖來對抗外界的不良環(huán)境；但當發(fā)酵液的糖質(zhì)量濃度過高時,外界的高滲透壓就會對酵母細胞產(chǎn)生毒害作用,使酵母的活性減弱,影響酵母的生長。彭酈等[23]研究了起始糖質(zhì)量濃度對釀酒酵母生物量和海藻糖積累量的影響,發(fā)現(xiàn)糖質(zhì)量濃度對細胞數(shù)量的增長影響不大,而在180～400 g/L的糖質(zhì)量濃度范圍內(nèi),酵母胞內(nèi)海藻糖的積累量隨著糖質(zhì)量濃度的提高而增加。

圖4 葡萄糖初始質(zhì)量濃度對蜂蜜接合酵母積累海藻糖的影響Fig.4 Effects of glucose initial concentration on trehalose production in yeast

2.1.5 轉速對蜂蜜接合酵母積累海藻糖的影響

由圖5可知,搖床的轉速由90 r/min升高至210 r/min時,酵母積累代謝產(chǎn)生的海藻糖隨著搖床轉速的增加而逐漸增加,搖床轉速為210 r/min時海藻糖積累量達到最大值,此時的海藻糖含量為42.99 mg/g；雖然海藻糖含量在210 r/min時達到最大,但與轉速在180 r/min時相差不大,考慮成本等問題,選用180 r/min為最適搖床轉速。搖床轉速的增加有利于加速氧的溶解,發(fā)酵前期為酵母的生長期,氧氣的快速溶解有利于酵母的大量生長繁殖,因此,發(fā)酵后期海藻糖的積累量也增多；當搖床轉速達到180 r/min時,酵母的生長量已經(jīng)達到了極限,因此,再增加轉速對酵母的生長繁殖影響不大。鄭輝杰等[33]研究了搖床轉速對釀酒酵母積累海藻糖的影響,發(fā)現(xiàn)海藻糖的產(chǎn)量隨著搖床轉速的增加而增加,即使轉速達到240 r/min,對海藻糖的積累并無不利的影響。

圖5 轉速對蜂蜜接合酵母積累代謝產(chǎn)生海藻糖的影響Fig.5 Effects of rotational speed on trehalose production inyeast

2.2 響應面優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗結果,綜合考慮各因素對海藻糖積累量的影響,選取發(fā)酵時間、葡萄糖初始質(zhì)量濃度、培養(yǎng)溫度作為試驗因素,海藻糖含量作為響應值設計試驗,共17個設計點。響應面的實驗設計及結果見表2。

表2 響應面實驗結果Table The response surface with results

使用Design-Expert(Version8.0.6)軟件對以海藻糖含量為響應值進行二次多項式回歸擬合分析,得到回歸方程預測模型：Y=47.77+21.14A-3.95B-12.75C-1.23AB-2.94AC+10.47BC+9.88A2-4.00B2-15.32C2。

對模型進行方差分析得到的結果見表3。由表3可知,模型的P<0.05,表明該模型顯著以及各因素對響應值有顯著影響；失擬項P值為0.269 3>0.05,表明失擬項不顯著,二次模型是合理的；R2=0.877 2,表明因變量與所考察的自變量之間的線性關系顯著,該模型能解釋87.72%響應值的變化。從F值的大小可知,各因素對海藻糖產(chǎn)量影響的強弱順序為：A-發(fā)酵時間>C-葡萄糖初始濃度>B-培養(yǎng)溫度,單因素A、C的P值遠遠小于0.05,說明發(fā)酵時間和葡萄糖初始質(zhì)量濃度對蜂蜜接合酵母積累代謝海藻糖的產(chǎn)量有顯著影響。各因素交互作用的響應面及等高線見圖6。

表3 響應面方差分析Table 3 Analysis of variance in the response surface

圖6 各因素交互作用對蜂蜜接合酵母中海藻糖產(chǎn)量影響的響應面圖Fig.6 Response surface diagram of the effects of interaction of various factors on trehalose yield in yeast

2.3 驗證實驗

根據(jù)所建立的數(shù)學模型,用Design-Expert 8.0.6軟件對方程進行求解,得到蜂蜜接合酵母積累代謝產(chǎn)生海藻糖的最佳發(fā)酵條件為：發(fā)酵時間96 h,培養(yǎng)溫度24 ℃,葡萄糖初始質(zhì)量濃度300 g/L。結合響應面試驗中海藻糖最高產(chǎn)量的試驗組進行驗證實驗,結果表4所示,優(yōu)化后的海藻糖含量為92.32 mg/g。安寧[25]以釀酒酵母SC2為實驗菌株,對其進行紫外和硫酸二乙酯逐級誘變處理,胞內(nèi)海藻糖含量由48.1 mg/g提高至64.3 mg/g,后續(xù)實驗可研究蜂蜜接合酵母LGL-2通過誘變、融合、基因重組等方法選育出海藻糖產(chǎn)量更高的菌株。

表4 驗證試驗設計及結果Table 4 Verify test design and results

3 結論

本文以蜂蜜接合酵母LGL-2為實驗菌株,通過單因素試驗,確定發(fā)酵時間、葡萄糖初始質(zhì)量濃度與培養(yǎng)溫度是影響海藻糖的積累量的主要因素。通過響應面優(yōu)化試驗,得到最佳發(fā)酵條件為：發(fā)酵時間96 h、種量10%、葡萄糖初始質(zhì)量濃度300 g/L、溫度24 ℃、轉速180 r/min。經(jīng)優(yōu)化后海藻糖的產(chǎn)量達到了92.32 mg/g,相比優(yōu)化前提高了29.34%。本實驗結果中24 ℃并非該酵母的最適生長溫度,但從驗證實驗中可知該溫度下的海藻糖產(chǎn)量更高,說明了低溫與高滲環(huán)境對酵母的應激物代謝機制具有一定影響。