倪術(shù)仁，連云嵐，趙思俊，李民生，郭景文*

強(qiáng)力腦清素片HPLC指紋圖譜的建立及質(zhì)量標(biāo)志物預(yù)測(cè)

倪術(shù)仁1，連云嵐2，趙思俊2，李民生2，郭景文2*

1. 山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西 晉中 030619 2. 山西省食品藥品檢驗(yàn)所，山西 太原 030031

建立強(qiáng)力腦清素片（Qiangli Naoqingsu Tablets，QNT）的HPLC指紋圖譜，為其有效質(zhì)量控制提供參考。建立QNT的HPLC指紋圖譜，測(cè)定采用Agilent C18色譜柱，檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm；流動(dòng)相為乙腈-水溶液，梯度洗脫。利用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)建立強(qiáng)力腦清素片的HPLC指紋圖譜，確定共有峰并進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)；基于指紋圖譜共有峰峰面積測(cè)定結(jié)果，采用聚類分析和主成分分析（PCA）等化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對(duì)不同批次的強(qiáng)力腦清素片進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)；采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選和分析QNT相關(guān)的作用靶點(diǎn)和通路，構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-網(wǎng)絡(luò)”預(yù)測(cè)QNT中潛在的質(zhì)量標(biāo)志物（Q-Marker）。QNP HPLC指紋圖譜確認(rèn)了11個(gè)共有峰，指認(rèn)6個(gè)共有峰，分別為刺五加浸膏中紫丁香苷、異嗪皮啶、刺五加苷E；五味子流浸膏中五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素。15批QNT片樣品相似度均大于0.95，相似度良好；15批QNT聚類為5類；主成分1～5是影響QNP質(zhì)量評(píng)價(jià)的主要因子。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選出5個(gè)活性成分為紫丁香苷、刺五加苷E、異嗪皮啶、五味子醇甲、五味子甲素；32個(gè)核心靶點(diǎn)分別為CA14、KIT、KDR、HPY5R、EGFR、MMP13等和13條關(guān)鍵通路為ErbB信號(hào)通路、Rap1信號(hào)通路、含血清素的神經(jīng)突觸等；基于Q-Marker“五原則”分析預(yù)測(cè)紫丁香苷、刺五加苷E、異嗪皮啶、五味子甲素、五味子醇甲為潛在的Q-Marker。通過指紋圖譜和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析預(yù)測(cè)QNT中的Q-Marker，所建立的方法操作便捷、結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于QNT的質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)，為全面控制QNT的質(zhì)量提供依據(jù)，為進(jìn)一步研究QNT的作用機(jī)制提供參考。

強(qiáng)力腦清素片；HPLC；指紋圖譜；相似度；聚類分析；主成分分析；中藥質(zhì)量標(biāo)志物；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；成分-靶點(diǎn)-網(wǎng)絡(luò)；質(zhì)量標(biāo)志物（Q-Marker）；紫丁香苷；異嗪皮啶；刺五加苷E；五味子醇甲；五味子甲素；五味子乙素

強(qiáng)力腦清素片（Qiangli Naoqingsu Tablets，QNT）是山西省亞寶藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司自主研發(fā)生產(chǎn)的獨(dú)家品種，該品種由中藥刺五加提取物刺五加浸膏、五味子提取物五味子流浸膏、鹿茸提取物鹿茸精配伍而成的中藥成方制劑，適應(yīng)癥有脾腎兩虛、心神失養(yǎng)引起的心悸失眠、食欲不振、神疲乏力、尿頻陽痿、神經(jīng)衰弱、非器質(zhì)性性功能衰退及婦女更年期綜合癥等。目前，QNT收錄于衛(wèi)生部中藥成方制劑十七冊(cè)（1998年），標(biāo)準(zhǔn)中僅收錄對(duì)刺五加薄層色譜檢驗(yàn)，且方法重現(xiàn)性低，未能全面整體控制質(zhì)量。雖有臨床報(bào)道但是作用機(jī)制尚不明確，這對(duì)于QNT治療更年期綜合征臨床定位、藥效學(xué)研究及產(chǎn)品二次開發(fā)提出了挑戰(zhàn)。根據(jù)國(guó)家目前對(duì)于醫(yī)藥行業(yè)的高度重視以及本著對(duì)人民安全用藥問題的關(guān)心，藥品的質(zhì)量控制勢(shì)在必行。

中藥指紋圖譜作為中藥材真?zhèn)舞b別、中藥及中藥制劑質(zhì)量控制的有效手段，已成為國(guó)內(nèi)外廣泛接受的中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)模式[1]。中藥指紋圖譜是一種綜合的、可量化的鑒定手段，具有整體性和模糊性的特點(diǎn)，能夠反映中藥外表特征及其制劑內(nèi)在質(zhì)量的穩(wěn)定性和均一性，得到的能夠標(biāo)示該中藥材及中藥制劑特性的共有峰的圖譜，突出中藥材及中藥制劑的完整面貌[2-5]。目前，模式識(shí)別方法在指紋圖譜等多維數(shù)據(jù)分析中有很大優(yōu)勢(shì)，也是其重要的分析手段[6-8]。其中聚類分析與主成分分析（PCA）法廣泛應(yīng)用于鑒定與樣品分類研究中[9-10]。中藥指紋圖譜法一般采用相似度評(píng)價(jià)，可同時(shí)采用PCA，根據(jù)PCA得到各成分的貢獻(xiàn)率，驗(yàn)證指紋圖譜方法，對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)。中藥材與中藥復(fù)方制劑所含成分較多，具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn)，導(dǎo)致研究其作用機(jī)制比較困難。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)走在研究中藥的前沿，主要融合了系統(tǒng)性生物學(xué)及多向藥理學(xué)的思想，從多種角度探索藥物與疾病的關(guān)聯(lián)，強(qiáng)調(diào)從藥物、靶點(diǎn)與疾病間相互作用的整體性和系統(tǒng)性出發(fā)，有助于反映及闡釋中藥的活性成分與靶點(diǎn)之間的作用關(guān)系[11-12]。目前，對(duì)指紋圖譜標(biāo)志成分的科學(xué)性證明很少，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)驗(yàn)證的幾乎沒有，故將中藥指紋圖譜和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)這2種方法的結(jié)合是除實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證以外最好的解決方案，為類似的研究提供新的思路，打破以往理化分析與藥理研究相脫節(jié)的問題。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent1260型高效液相色譜，安捷倫科技有限公司；MS204S型1/10萬電子分析天平、XSE105DU型千分之一分析天平，梅特勒托利多儀器有限公司；LC-350A超聲儀，濟(jì)寧市中區(qū)魯超儀器廠。

1.2 試藥

對(duì)照品五味子醇甲（批號(hào)110875-201412，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.4%）、五味子甲素（批號(hào)110764-201915，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.5%）、五味子乙素（批號(hào)110765- 201813，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.1%）、紫丁香苷（批號(hào)11574- 201605，質(zhì)量分?jǐn)?shù)95.2%）、刺五加苷E（批號(hào)111713- 201804，質(zhì)量分?jǐn)?shù)97.9%）、異嗪皮啶（批號(hào)110837- 201608，質(zhì)量分?jǐn)?shù)100%）均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。15批（批號(hào)190303、190203、181103、190404、190801、190804、190901、190906、191205、200201、200301、200302、200401、200402、200403，編號(hào)S1～S15）QNP樣品，山西省亞寶藥業(yè)有限公司提供。

五味子、刺五加藥材，均來自亳州市亳東藥業(yè)有限公司，經(jīng)山西省食品藥品檢驗(yàn)所郭景文主任藥師鑒定，五味子為木蘭科五味子屬植物五味子(Turcz.) Baill.的干燥成熟果實(shí)，刺五加為五加科五加屬植物刺五加(Rupr. et Maxim.) Harms的干燥根和根莖或莖；五味子流浸膏，批號(hào)191101，山西亞寶藥業(yè)有限公司；刺五加浸膏，批號(hào)20200101，黑龍江林海雪原藥業(yè)有限公司。

1.3 試劑

甲醇，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；純化水；乙腈，色譜純，北京迪科馬科技有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Agilent-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；體積流量1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL；流動(dòng)相為水-乙腈，梯度洗脫：0～10 min，8%乙腈；10～50 min，8%～21%乙腈；50～55 min，21%～24%乙腈；55～60 min，24%～35%乙腈；60～65 min，35%～40%乙腈；65～70 min，40%～45%乙腈；70～75 min，45%～50%乙腈；75～90 min，50%～54%乙腈；90～95 min，54%～58%乙腈；95～105 min，58%～62%乙腈；105～120 min，62%～75%乙腈。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

分別取五味子醇甲、五味子乙素、五味子甲素、紫丁香苷、刺五加苷E、異嗪皮啶對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇分別制成分別含五味子醇甲20 μg/mL、五味子醇乙19 μg/mL、五味子甲素21 μg/mL、紫丁香苷22 μg/mL、刺五加苷E 16 μg/mL、異嗪皮啶40 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取QNP適量，除去包衣，研細(xì)，取1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率250 W、頻率50 kHz）30 min，放冷，稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，0.45微孔濾膜濾過，棄初濾液，即得QNT供試品溶液。

取五味子藥材、刺五加藥材、五味子流浸膏、刺五加浸膏適量，按照QNT供試品溶液制備方法制備各藥材溶液。

根據(jù)處方藥味稱取缺五味子流浸膏的其他藥材及缺刺五加浸膏的其他藥材，按比例加輔料攪拌均勻，按照供試品溶液制備方法制備陰性樣品供試品溶液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 參照峰選擇 刺五加浸膏是QNT的君藥，紫丁香苷是刺五加浸膏的主要成分之一，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，峰面積大，色譜峰保留時(shí)間穩(wěn)定，故選擇紫丁香苷作為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間。

2.4.2 精密度試驗(yàn) 取QNT，按“2.3”項(xiàng)下方法制備同一供試品溶液（S1），按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算共有峰相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間。結(jié)果顯示共有峰的相對(duì)峰面積RSD＜0.8%，相對(duì)保留時(shí)間RSD＜0.10%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取QNT，按“2.3”項(xiàng)下方法制備同一供試品溶液（S1），分別于0、2、4、8、12、18、24、72 h進(jìn)樣，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算共有峰相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間。結(jié)果顯示共有峰的相對(duì)峰面積RSD＜1.0%，相對(duì)保留時(shí)間RSD＜0.50%，表明QNT供試品溶液于室溫下放置72 h穩(wěn)定性良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次樣品（S1），按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備9份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算共有峰相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間。結(jié)果顯示共有峰的相對(duì)峰面積RSD＜1.1%，相對(duì)保留時(shí)間RSD＜1.1%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5 指紋圖譜的建立與相關(guān)性分析

2.5.1 QNT指紋圖譜的建立 取QNT 15批，按按照“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。通過中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件（2012年版），以批號(hào)190303樣品圖譜為參照?qǐng)D譜，采用中位數(shù)法，得到15批QNT的指紋圖譜，見圖1。

2.5.2 QNT相似度分析 將15批QNT的指紋圖譜均導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件（2012版），計(jì)算相似度，結(jié)果S1～S15樣品的相似度分別為0.996、0.995、0.999、0.995、0.996、0.993、0.995、0.994、0.990、0.995、0.993、0.986、0.996、0.988、0.987。15批QNT的指紋圖譜相似度均＞0.95，表明QNT質(zhì)量均一穩(wěn)定。

2.5.3 共有峰的指認(rèn)及相關(guān)分析 使用指紋圖譜分析結(jié)果，將對(duì)照品、QNT樣品的指紋圖譜進(jìn)行疊加，分別指認(rèn)成分，使用指紋圖譜分析結(jié)果，將QNT、對(duì)照品、中間體和陰性樣品的指紋圖譜進(jìn)行疊加見圖2、3。采用對(duì)照品指認(rèn)出6個(gè)共有峰，結(jié)果見表1。由表1可知，QNT中存在共有峰6個(gè)。

2.5.4 QNT聚類分析 以不同批號(hào)QNT的11個(gè)共有峰峰面積為原始數(shù)據(jù)，Origin 9軟件對(duì)QNT樣品進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，采用組間平均數(shù)連結(jié)，以?shī)A角余弦為樣品相似度的距離公式，聚類分析見圖4。由圖4可知，QNT樣品被分為5大類，I類包括190404；II類包括200302、200402、200403；III類包括200201、200401；IV類包括191203、190901、190906、190801、190804、190303、191205；V類包括181103、200301。結(jié)果表明，QNT從共有峰相對(duì)峰面積來看，I類相對(duì)于其他4類五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素相對(duì)峰面積極小；II類相對(duì)峰面積基本一致；III類五味子甲素相對(duì)峰面積?。籌V類五味子乙素相對(duì)峰面積小；V類五味子在甲素的相對(duì)峰面積相對(duì)于III類小。

圖1 15批QNT樣品的指紋圖譜

1-紫丁香苷 2-刺五加苷E 3-異嗪皮啶 4-五味子醇甲 5-五味子甲素 6-五味子乙素 S1-樣品（190303）

S1-樣品（190303） a-五味子流浸膏 b-刺五加浸膏 c-五味子藥材 d-刺五加藥材 e-刺五加浸膏陰性樣品 f-五味子流浸膏陰性樣品

表1 QNT指紋峰指認(rèn)

圖4 聚類分析樹狀圖

通過結(jié)果分析各批次的樣品中紫丁香苷、異嗪皮啶、刺五加苷E相對(duì)峰面積差異性極小，五味子流浸膏中的有效成分相對(duì)峰面積5類差異性大。進(jìn)一步與企業(yè)調(diào)研核實(shí)與制劑所用原藥材產(chǎn)地來源、采收季節(jié)以及原藥材批間質(zhì)量差異等有關(guān)。通過聚類分析發(fā)現(xiàn)，QNT各批號(hào)的樣品之間的相關(guān)性與相似度分析結(jié)果較為一致。

2.5.5 QNT共有峰PCA PCA法是一種應(yīng)用廣泛的多元統(tǒng)計(jì)方法，用以簡(jiǎn)化數(shù)據(jù)，快速實(shí)現(xiàn)模式或關(guān)系的可視化識(shí)別[13]。SPSS 19.0軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，以主成分的特征值及貢獻(xiàn)率為依據(jù)，對(duì)15批不同批次的QNT的11個(gè)共有峰（變量）進(jìn)行PCA，結(jié)果見表2。由表2可知，主成分個(gè)數(shù)的提取原則為其對(duì)應(yīng)的特征值大于1，故提取前5個(gè)（A1～A5）作為主成分，其累計(jì)貢獻(xiàn)值達(dá)到88.05%，其中第1主成分（紫丁香苷）貢獻(xiàn)率24.183%；第2成分（刺五加苷E）貢獻(xiàn)率21.557%；第3主成分（異嗪皮啶）的貢獻(xiàn)率19.537%；第4主成分（五味子醇甲）的貢獻(xiàn)率12.996%；第5主成分（五味子甲素）的貢獻(xiàn)率9.799%，所以選這5個(gè)主成分進(jìn)行評(píng)價(jià)QNT的質(zhì)量，它代表了待研究中藥成方制劑中有效成分含量的88.05%的信息量。

2.6 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果

2.6.1 化合物-靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 通過檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)及分析平臺(tái)TCMSP、BAT MAN-TCM、Pub Chem、Swiss Target Predict中紫丁香苷、刺五的32個(gè)靶點(diǎn)，利用候選化合物與靶點(diǎn)的關(guān)系構(gòu)建的化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)（圖5）。

表2 PCA特征值

2.6.2 蛋白-蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將篩選出的112個(gè)靶點(diǎn)，導(dǎo)入STRING（https:// string-db. org/）進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，選擇物種“Homo sapiens”，蛋白交互評(píng)分參數(shù)評(píng)分值＞0.7，隱藏?zé)o關(guān)聯(lián)的節(jié)點(diǎn)，得到的蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖（圖6），結(jié)果共獲得31個(gè)節(jié)點(diǎn)，39個(gè)邊。

2.6.3 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析為了進(jìn)一步闡釋候選靶點(diǎn)的可能作用，用DAVID軟件（https://david.ncifcrf.gon/）將網(wǎng)絡(luò)合并后獲取的核心蛋白靶點(diǎn)進(jìn)行GO分析，進(jìn)一步對(duì)核心蛋白加苷E、異嗪皮啶、五味子醇甲、五味子甲素5個(gè)候選化合物的作用靶點(diǎn)，共得到與5個(gè)化合物相關(guān)靶點(diǎn)基因進(jìn)行KEGG基因與信號(hào)通路富集分析，相關(guān)信息見圖7、8。

圖5 化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

圖6 核心靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

2.6.4 成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 根據(jù)篩選得到的5個(gè)成分、23個(gè)靶點(diǎn)和13條通路，運(yùn)用Cytoscape 3.6.1軟件構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)果見圖9將相互作用關(guān)系整合并導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1中，并可視化得到“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖，如圖8所示。根據(jù)Cytoscape 3.6.1軟件對(duì)網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行分析，以化合物、靶點(diǎn)蛋白、信號(hào)通路的連接度為參考，發(fā)現(xiàn)紫丁香苷、刺五加苷E、異嗪皮啶、五味子醇甲、五味子甲素的連接度相對(duì)比較高，均可能是QNT發(fā)揮藥效的活性物質(zhì)；PRKCA、EGFR、GSK3B、BRAF、PIK3CA、ERBB2、SRC、MET靶點(diǎn)的連接度比較高，可能是QNT發(fā)揮作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)；13條信號(hào)通路連接差異性不大，可能是QNT的關(guān)鍵信號(hào)通路。

圖8 KEGG富集通路分析結(jié)果

結(jié)合篩選結(jié)果單獨(dú)的活性成分可能只針對(duì)某一節(jié)點(diǎn)，而2種或以上的組合能產(chǎn)生協(xié)同作用，可能針對(duì)的是整個(gè)網(wǎng)絡(luò)。在中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究制定技術(shù)要求中含量測(cè)定的測(cè)定指標(biāo)一般為根據(jù)中藥的功能主治或活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇出的活性成分，而QNT的功能主治為心神失養(yǎng)、脾腎兩虛，臨床上治療更年期綜合征，同時(shí)本研究所測(cè)定的5活性成分為度值較高同時(shí)在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究中常見且易獲取的成分，故選其為含量測(cè)定指標(biāo)，在一定程度上更具有代表性。

4 討論

中藥質(zhì)量是中藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的生命線，但目前中藥質(zhì)量研究方面存在的諸多問題，在一定程度上制約了中藥產(chǎn)業(yè)的健康與可持續(xù)發(fā)展。為提升我國(guó)中藥產(chǎn)品質(zhì)量和質(zhì)量控制水平，劉昌孝院士提出中藥質(zhì)量標(biāo)志物（Q-marker）概念[14]。中藥質(zhì)量標(biāo)志物是存在于中藥材和中藥產(chǎn)品（如中藥飲片、中藥煎劑、中藥提取物、中成藥制劑）中固有的或加工制備過程中形成的、與中藥的功能屬性密切相關(guān)的化學(xué)物質(zhì)，具有傳遞性和溯源性。傳遞性與追溯性貫穿于藥材到產(chǎn)品的整個(gè)過程，必須受到密切關(guān)注，建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)能夠推動(dòng)傳遞性和追溯性的研究[15]。

圖9 “成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)

刺五加主治脾腎陽虛、腰膝酸軟、體虛乏力、失眠多夢(mèng)、食欲不振，刺五加可增強(qiáng)機(jī)體的適應(yīng)性，提高機(jī)體免疫力，具有抗癌作用，且本身幾乎無毒性，長(zhǎng)期用藥不會(huì)出現(xiàn)不良反應(yīng)[16-17]。紫丁香苷、刺五加苷E、異嗪皮啶是從刺五加中分離得到的苯丙素類、木脂素類及香豆素類化合物，具有不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)，具有抗腫瘤、抗氧化、抗疲勞等廣泛的藥理活性，是刺五加發(fā)揮藥效作用的物質(zhì)[18-19]。五味子為木蘭科五味子屬植物五味子(Turcz.) Baill.的干燥成熟果實(shí)。習(xí)稱“北五味子”[20]。五味子中五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素具有改善記憶，保護(hù)受損細(xì)胞，鎮(zhèn)靜催眠作用[21-22]。

本實(shí)驗(yàn)在優(yōu)化供試品溶液制備方式時(shí)，以QNT樣品色譜圖中色譜峰數(shù)量、分離效果以及定量測(cè)定目標(biāo)成分紫丁香苷、刺五加苷E、異嗪皮啶、五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素，綜合提取率為指標(biāo)，顯示以甲醇為提取溶劑超聲提取時(shí)出峰較多，色譜峰分離效果較佳。

在優(yōu)化色譜條件時(shí)，首先對(duì)比考察了0.2%磷酸水-30%乙腈與乙腈-水流動(dòng)相系統(tǒng)，結(jié)果乙腈-水流動(dòng)相系統(tǒng)優(yōu)于0.2%磷酸水- 30%乙腈，最終確定以乙腈-水為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，色譜圖基線平穩(wěn)，峰形較好，分離度較高。成方制劑中鹿茸精由于無法通過高效液相色譜法測(cè)定，后期將采用薄層色譜法對(duì)其進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，填補(bǔ)目前國(guó)內(nèi)外對(duì)鹿茸精的研究空白。

綜上所述，初步預(yù)測(cè)紫丁香苷、異嗪皮啶、刺五加苷E、五味子醇甲、五味子甲素為QNT潛在的Q-Marker。指紋圖譜采用相似度評(píng)價(jià)、聚類分析和PCA 3種方法評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示PCA與指紋圖譜技術(shù)相結(jié)合可以綜合評(píng)價(jià)中藥飲片的質(zhì)量?jī)?yōu)劣及中藥成方制劑質(zhì)量控制，避免了以單一成分含量來評(píng)價(jià)飲片質(zhì)量好壞的弊端。

本實(shí)驗(yàn)所建立的指紋圖譜是科學(xué)有效的，通過對(duì)QNT潛在Q-Marker的預(yù)測(cè)，為提升相關(guān)藥物質(zhì)量控制水平提供系統(tǒng)的科學(xué)數(shù)據(jù)，為中藥質(zhì)量標(biāo)志物的量化評(píng)價(jià)與分級(jí)辨識(shí)提供了創(chuàng)新思路與方法，為有力提升中藥質(zhì)量控制水平提供重要的理論與方法支撐，為后期深入研究QNT的作用機(jī)制提供參考，也為QNT的質(zhì)量控制提供了更全面的參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 羅國(guó)安, 王義明, 曹進(jìn), 等. 建立我國(guó)現(xiàn)代中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系的研究 [J]. 世界科學(xué)技術(shù)—中藥現(xiàn)代化, 2002, 4(4): 5-11.

[2] 祁航, 謝濤, 呂東峰, 等. 玉泉丸HPLC指紋圖譜的建立及6個(gè)成分定量分析 [J]. 中草藥, 2019, 50(23): 5753-5759.

[3] Gao S M, Liu J S, Wang M,. Quantitative and HPLC fingerprint analysis combined with chemometrics for quality evaluation ofprocessed with different methods [J]., 2019, 11(2): 160-168.

[4] 吳建雄, 秦建平, 劉峰, 等. 坤寧顆粒的HPLC指紋圖譜研究 [J]. 現(xiàn)代藥物與臨床, 2020, 35(3): 447-449.

[5] 李文兵, 許玲, 盧君蓉, 等. 基于HPLC指紋圖譜的枇杷葉蜜炙前后標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量控制研究 [J]. 中草藥, 2020, 51(13): 3444-3450.

[6] 王璠, 歐陽臻, 郭蘭萍, 等. 蒼術(shù)綜合化學(xué)模式識(shí)別 [J]. 中國(guó)中藥雜志, 2014, 39(13): 2536-2541.

[7] 沈莉, 趙燕燕, 謝洪平, 等. 升麻的1H-NMR指紋圖譜-模式識(shí)別研究 [J]. 中國(guó)中藥雜志, 2013, 38(2): 217-222.

[8] 張?jiān)? 陳健, 李洋, 等. 經(jīng)典名方溫經(jīng)湯標(biāo)準(zhǔn)湯劑HPLC指紋圖譜建立及9種成分含量測(cè)定 [J]. 中草藥, 2020, 51(18): 4664-4672.

[9] 吳偉建, 王燕, 王斌, 等. 基于聚類、主成分和判別分析的海龍紅外指紋圖譜研究 [J]. 中國(guó)藥學(xué)雜志, 2013, 48(18): 1540-1545.

[10] 高森, 王蘋, 唐鋮, 等. 基于HPLC指紋圖譜、多指標(biāo)成分含量測(cè)定及化學(xué)計(jì)量學(xué)的濕熱痹片質(zhì)量評(píng)價(jià) [J]. 中草藥, 2020, 51(21): 5454-5461.

[11] 謝培山. 中藥色譜指紋圖譜鑒別的概念、屬性、技術(shù)與應(yīng)用 [J]. 中國(guó)中藥雜志, 2001, 26(10): 653-655.

[12] 張慧, 陳燕, 汪佳楠, 等. 指紋圖譜技術(shù)在中藥配方顆粒質(zhì)量評(píng)價(jià)及過程控制中的應(yīng)用 [J]. 中國(guó)中藥雜志, 2018, 43(19): 3822-3827.

[13] 周文霞, 程肖蕊, 張永祥. 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué): 認(rèn)識(shí)藥物及發(fā)現(xiàn)藥物的新理念 [J]. 中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志, 2012, 26(1): 4-9.

[14] 劉昌孝, 陳士林, 肖小河, 等. 中藥質(zhì)量標(biāo)志物(Q-Marker): 中藥產(chǎn)品質(zhì)量控制的新概念 [J]. 中草藥, 2016, 47(9): 1443-1457.

[15] 張鐵軍, 許浚, 韓彥琪, 等. 中藥質(zhì)量標(biāo)志物(Q- marker)研究: 延胡索質(zhì)量評(píng)價(jià)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究 [J]. 中草藥, 2016, 47(9): 1458-1467.

[16] 李慶勇, 付玉杰, 呂欣, 等. 超聲波法提取刺五加() 中丁香甙的研究[J]. 植物研究, 2003, 23(2): 182-184.

[17] 曹先蘭, 李珠蓮. 刺五加國(guó)外實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中草藥, 1980, 11(6): 277-281.

[18] 葉紅軍, 吳遠(yuǎn), 房家智, 等. 刺五加皂甙對(duì)胃癌細(xì)胞膜電位和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響 [J]. 中華消化雜志, 2002, 22(1): 48-49.

[19] 張玥秀, 吳兆華, 高慧援,等. 刺五加莖葉化學(xué)成分的分離與鑒定 [J]. 沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào), 2010, 27(2): 110-112.

[20] 史琳, 王志成, 馮敘橋. 五味子化學(xué)成分及藥理作用的研究進(jìn)展[J]. 藥物評(píng)價(jià)研究, 2011, 34(3): 208-212.

[21] Zhu H, Zhang L, Wang G,. Sedative and hypnotic effects of supercritical carbon dioxide fluid extraction fromin mice [J]., 2016, 24(4): 831-838.

[22] Sowndhararajan K, Deepa P, Kim M,. An overview of neuroprotective and cognitive enhancement properties of lignans from[J]., 2017, 97: 958-968.

Establishment of fingerprint and Q-marker prediction of Qiangli Naoqingsu Tablets

NI Shu-ren1, LIAN Yun-lan2, ZHAO Si-jun2, LI Min-sheng2, GUO Jing-wen2

1. Shanxi University of Traditional Chinese Medicine, Jinzhong 030619, China 2. Shanxi Institute of Food and Drug Control, Taiyuan 030031, China

To study the fingerprint of Qiangli Naoqingsu Tablets (QNT, 強(qiáng)力腦清素片) and provide reference for its effective quality control.The fingerprint of QNT was determined by HPLC using Agilent C18column at the detection wavelength of 220 nm. The mobile phase was acetonitrile-water solution with gradient elution. The HPLC fingerprint of QNT was established by using the Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint of TCM. Based on the results of common peak area determination of fingerprint, the quality of different batches of QNT was evaluated by the stoichiometric method such as cluster analysis and principal component analysis (PCA). Network pharmacology was used to screen and analyze QNT-related targets and pathways, and “component-target-network” was constructed to predict the potential Q-marker in QNT.Eleven common peaks and six common peaks were identified by HPLC fingerprint, namely syringin, isofraxidin, and eleutheroside E inextract, schisandrol, schizandrin A, and schisandrin B influid extract. The similarity of 15 batches of QNT was greater than 0.95, and the similarity was good. Fifteen batches of QNT were clustered into five types. Principal components 1—5 were the main factors affecting the quality evaluation of QNT.Five active components were screened including syringin, isofraxidin, eleutheroside E, schisandrol, and schizandrin A; The 32 core targets were CA14, KIT, KDR, HPY5R, EGFR, MMP13 and so on; And the 13 key pathways were ErbB signaling pathway, RAP1 signaling pathway, serotonin-containing synapse, etc. Based on the “Five Principles” of Q-marker, the analysis and prediction of syringin, acanthopyrin E, isofraxidin, schisandrol, and schizandrin A were potential Q-markers.Q-marker in QNT is predicted by fingerprint and network pharmacology analysis, which provides basis for the overall control of QNT quality and provides reference for further research on the mechanism of action of QNT.

Qiangli Naoqingsu Tablets; HPLC; fingerprints; similarity; cluster analysis; principal component analysis; quality markers of traditional Chinese medicine; network pharmacology; component-target network; Q-marker; syringin; isofraxidin; acanthopyrin E; schisandrol; schizandrin A; schisandrin B

R286.02

A

0253 - 2670(2021)04 - 1011 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.04.013

2020-09-12

國(guó)家藥典委員藥品標(biāo)準(zhǔn)制修訂研究課題（2019Z061）

倪術(shù)仁（1993—），女，研究生，研究方向?yàn)橹兴幏治雠c質(zhì)量控制。Tel: 18435170856 E-mail: 18435170856@163.com

郭景文，本科，主任藥師，研究方向?yàn)橹兴帢?biāo)準(zhǔn)研究與持續(xù)提高。Tel: (0351)2026057 E-mail: guojw2009@126.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]