孟慶雯，劉華江，黃 珊，楊珊珊，楊 洋

(海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，?？?570100)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是世界范圍內(nèi)常見的心血管疾病，亦是導(dǎo)致心源性猝死的主要原因，AMI發(fā)病率及病死率高，且總體呈上升趨勢[1]，對于治療AMI新型藥物的研究一直是研究的重點(diǎn)。桔梗皂苷D是桔梗的主要化學(xué)成分，具有抗炎、降血脂、抗腫瘤等藥理作用[2]。已有研究表明，桔梗皂苷D對乳腺癌等有治療作用[3-4]，但其對AMI的作用尚未有明確研究，本文探討了桔梗皂苷D對AMI的影響及機(jī)制，旨在為AMI的臨床治療提供幫助，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

桔梗皂苷D(上海展舒化學(xué)科技有限公司，純度大于98%)；戊巴比妥(江蘇艾康生物醫(yī)藥研發(fā)有限公司)；TUNEL細(xì)胞凋亡試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)公司)；ELISA檢測試劑盒(天津安諾瑞康生物技術(shù)有限公司)；血管緊張素1(AT1)、心錨重復(fù)蛋白(CARP)、裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cleaved caspase-3)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)、Bax、Bcl-2、GAPDH一抗、山羊抗體二抗(沈陽萬類生物技術(shù)有限公司)；BCA蛋白定量試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1大鼠AMI造模

結(jié)扎冠狀動脈前降支構(gòu)建大鼠AMI模型，具體步驟為：腹腔注射50 mg/kg劑量的戊巴比妥溶液麻醉SD大鼠，同時(shí)使用面罩通氣支持呼吸，于左側(cè)第3或4肋間隙開胸暴露心臟，打開心包，結(jié)扎大鼠左冠狀動脈前降支，通過心電圖ST-T 改變檢測心肌梗死。假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎，術(shù)畢后逐層縫合關(guān)胸。

1.2.2動物給藥及分組

假手術(shù)組大鼠作為對照，造模成功的AMI大鼠分為AMI組、桔梗皂苷D低、中、高劑量組，其中桔梗皂苷D低、中、高劑量組分別按25、50、100 mg/kg的給藥劑量灌胃給藥，每天1次，給藥4周；假手術(shù)組和AMI組給予相同體積和頻次的生理鹽水。

1.2.3心臟功能檢測

各組大鼠給藥結(jié)束后腹腔注射戊巴比妥麻醉，使用超聲顯像儀行超聲心動圖檢查，分別檢測左心室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)、左心室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)、左心室短軸縮短率(LVFS)和左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)，比較各組大鼠上述指標(biāo)。

1.2.4蘇木素-伊紅(HE)染色

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后解剖獲取各組大鼠心肌梗死區(qū)域組織，于組織固定液中固定24 h，清洗后經(jīng)70%、80%、90%、95%的乙醇及無水乙醇梯度水化，再浸入二甲苯溶液中2次，分別于硬石蠟和軟石蠟中浸泡30 min，并于石蠟液中冷卻凝固。于切片機(jī)上制備組織切片，然后將切片置于二甲苯中脫蠟，依次經(jīng)100%、95%、90%、80%、75%的乙醇水化后，使用蘇木素染色5 min，伊紅染色2 min，清洗去除染色液后經(jīng)90%、95%、100%的乙醇浸泡1 min，并將切片置于二甲苯中2次，每次1 min，滴加中性樹脂封片后于光學(xué)顯微鏡下觀察心肌梗死情況，并拍照記錄。

1.2.5TUNEL檢測大鼠心肌細(xì)胞凋亡

取心肌組織石蠟切片用二甲苯及各梯度乙醇脫蠟至水，然后使用無菌蒸餾水水化5 min后，用0.1 mmol/L枸櫞酸緩沖液(pH 6.0)進(jìn)行熱修復(fù)，分別經(jīng)過3%H2O2甲醇液、0.1% TritonX-100、20%牛血清、TUNEL 反應(yīng)混合液、POD轉(zhuǎn)化劑孵育及磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗后，DAB 溶液顯色，并在顯微鏡下觀察，終止后用邁耶蘇木精染核，PBS 沖洗后，甘油封片劑封片，顯微鏡下觀察并拍攝圖像。

1.2.6Western blot

給藥結(jié)束后，取各組大鼠心肌梗死區(qū)域組織于液氮保存，然后取大鼠心肌組織50 mg，加入250 μL RIPA蛋白裂解液和2.5 μL的PMSF蛋白酶抑制劑，研磨均勻后4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，取上清液。使用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量，加入上樣緩沖液后沸水浴使蛋白變性，經(jīng)過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，轉(zhuǎn)膜，用5%的脫脂牛奶對聚偏氟乙烯(PVDF)膜封閉2 h，然后以1∶1 000比例稀釋后的AT1、CARP、cleaved-caspase-3、caspase-3、Bax、Bcl-2、GAPDH一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜后二抗室溫孵育1.5 h，再用TBST洗膜后按照ECL試劑盒說明書配置發(fā)光液，并將PVDF膜浸入發(fā)光液中反應(yīng)30 s，曝光并拍照，用Image J軟件對曝光結(jié)果進(jìn)行定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 AMI模型鑒定

心電圖檢測結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，AMI組心電圖ST段明顯抬高，提示AMI大鼠造模成功，見圖1。

箭頭：SF段抬高。

2.2 桔梗皂苷D對AMI大鼠心臟功能的影響

與假手術(shù)組比較，AMI組大鼠LVEDD和LVESD均明顯升高，LVFS和LVEF明顯降低(P<0.05)。與AMI組比較，桔梗皂苷D低、中、高劑量組LVEDD和LVESD明顯降低，LVFS和LVEF明顯升高(P<0.05)，且呈劑量依賴性，見表1。

2.3 桔梗皂苷D改善AMI大鼠心肌損傷

假手術(shù)組心肌細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞核形態(tài)正常，無明顯病變；AMI組大鼠心肌細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞核萎縮，炎性細(xì)胞大量浸潤，病變明顯；桔梗皂苷D低、中、高劑量組大鼠心肌細(xì)胞病變得到明顯改善，心肌細(xì)胞排列較整齊，炎性細(xì)胞浸潤減少，治療效果呈劑量依賴性，見圖2。

A:假手術(shù)組；B:AMI組；C:桔梗皂苷D低劑量組；D:桔梗皂苷D中劑量組；E:桔梗皂苷D高劑量組。

2.4 桔梗皂苷D調(diào)控AMI大鼠心肌細(xì)胞凋亡

TUNEL結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，AMI組心肌組織凋亡明顯增加(P<0.05)；與AMI組比較，桔梗皂苷D低、中、高劑量組心肌組織凋亡明顯減少(P<0.05)，見圖3、4。

表1 桔梗皂苷D對AMI大鼠心臟功能的影響

A:假手術(shù)組；B:AMI組；C:桔梗皂苷D低劑量組；D:桔梗皂苷D中劑量組；E:桔梗皂苷D高劑量組。

a：P<0.05，與假手術(shù)組比較；b：P<0.05，與AMI組比較。

2.5 桔梗皂苷D調(diào)控AMI大鼠心肌組織凋亡蛋白表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，AMI組心肌組織促凋亡蛋白Bax和cleaved-caspase-3表達(dá)水平明顯增加，抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；與AMI組比較，桔梗皂苷D低、中、高劑量組大鼠心肌組織Bax和cleaved-caspase-3表達(dá)水平明顯下調(diào)，Bcl-2表達(dá)水平明顯上調(diào)(P<0.05)，見圖5、6。

A:假手術(shù)組；B:AMI組；C:桔梗皂苷D低劑量組；D:桔梗皂苷D中劑量組；E:桔梗皂苷D高劑量組。

a:P<0.05，與假手術(shù)組比較；b:P<0.05，與AMI組比較。

2.6 桔梗皂苷D抑制AT1-CARP信號通路

Western blot 結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，AMI組心肌組織AT1和CARP表達(dá)明顯增加(P<0.05)。與AMI組比較，桔梗皂苷D低、中、高劑量組AT1和CARP表達(dá)水平明顯減少(P<0.05)，見圖7、8。

A:假手術(shù)組；B:AMI組；C:桔梗皂苷D低劑量組；D:桔梗皂苷D中劑量組；E:桔梗皂苷D高劑量組。

a:P<0.05，與假手術(shù)組比較；b:P<0.05，與AMI組比較。

3 討 論

AMI是常見的心血管疾病，病死率高，且發(fā)病機(jī)制復(fù)雜。目前研究表明，AMI的發(fā)病與炎性反應(yīng)、免疫、細(xì)胞凋亡等相關(guān)。桔梗皂苷D是中藥桔梗的主要成分[5-7]。研究表明，桔梗皂苷D能夠調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)而治療肺癌和乳腺癌等腫瘤[8-10]，亦有研究表明桔梗皂苷D亦可調(diào)控大鼠體內(nèi)的免疫細(xì)胞活性[11]。桔梗皂苷D是否可通過調(diào)控炎性反應(yīng)、免疫、細(xì)胞凋亡等治療AMI尚未有明確報(bào)道。本研究通過手術(shù)構(gòu)建大鼠AMI模型，然后給予低、中、高劑量的桔梗皂苷D進(jìn)行治療，治療后檢測各組大鼠心臟功能，大鼠LVEDD和LVESD明顯降低，LVFS和LVEF明顯增加，說明桔梗皂苷D能夠改善AMI大鼠心臟功能；且HE染色結(jié)果顯示，桔梗皂苷D治療后AMI大鼠心臟結(jié)構(gòu)損傷被明顯緩解，說明桔梗皂苷D能夠治療AMI大鼠心臟損傷。

AMI可促使心肌細(xì)胞因缺血缺氧而發(fā)生細(xì)胞凋亡，通過抑制心肌細(xì)胞凋亡可延緩心室重構(gòu)并減少心肌梗死面積，既往研究報(bào)道指出心肌梗死后引發(fā)的心肌細(xì)胞凋亡是造成心力衰竭等心血管疾病發(fā)生的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。所以，接下來本研究即探討了桔梗皂苷D是否可通過緩解AMI大鼠心肌細(xì)胞的凋亡而緩解心肌損傷，本研究通過TUNEL檢測心肌細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示，桔梗皂苷D能夠明顯抑制AMI大鼠心肌細(xì)胞的凋亡。Bax、Bcl-2、caspase-3均為凋亡相關(guān)蛋白，其中Bax和caspase-3具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，而Bcl-2具有抑制細(xì)胞凋亡的作用[12]。且桔梗皂苷D治療后促凋亡蛋白Bax和caspase-3表達(dá)明顯下調(diào)，抑制凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)明顯上調(diào)，說明桔梗皂苷D能夠通過調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)而調(diào)控AMI大鼠心肌細(xì)胞凋亡。

心肌梗死后多種原因可誘發(fā)心肌細(xì)胞凋亡，其中，AT1受體被激活后p53的表達(dá)增加，進(jìn)而降低Bcl-2和Bax的比值從而發(fā)揮促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡的作用[13]。CARP屬于高度保守的肌肉錨定重復(fù)蛋白家族，主要在心臟中表達(dá)，且研究表明，CARP的表達(dá)能夠隨AT1受體激活而上調(diào)，提示AT1-CARP通路可能為引發(fā)心肌梗死后細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵通路[14-15]。本研究表明，桔梗皂苷D治療后，AMI大鼠心肌細(xì)胞AT1和CARP表達(dá)明顯抑制，即AT1-CARP信號通路被明顯抑制，說明桔梗皂苷D能夠通過抑制AT1-CARP信號通路而緩解AMI大鼠心肌細(xì)胞凋亡。

綜上所述，桔梗皂苷D能夠改善AMI大鼠心臟功能及心肌損傷，其機(jī)制為通過抑制AT1-CARP信號通路而緩解AMI大鼠心肌細(xì)胞凋亡，但其臨床應(yīng)用還需進(jìn)一步研究。