廖若宇，張春娥*,劉新保，孫悅，田建文

1(寧夏回族自治區(qū)糧油產(chǎn)品質量檢測中心, 寧夏 銀川, 750001)2(寧夏農林科學院,寧夏 銀川, 750001)

食品生產(chǎn)工業(yè)中，著色劑因可修飾產(chǎn)品外觀色澤而發(fā)揮著巨大作用。按照來源不同，著色劑可分為天然色素和合成色素。合成色素因成本低廉、穩(wěn)定性好而被廣泛用于食品行業(yè)。亮藍是一種水溶性偶氮酸性著色劑(分子結構見圖1),易溶于水及乙醇，其耐光和耐熱性較強，對酸和堿均不敏感[1]，現(xiàn)已用于酸奶[2]、果味飲料、果醬[3]、茶葉[4]等產(chǎn)品的染色。目前，國家已頒布相應標準對食品中亮藍著色劑的最大添加量進行了限定?，F(xiàn)階段對食品中合成著色劑的檢測方法較多，如薄層色譜法[5-6]、高效液相色譜法[7-9]、液相色譜-質譜聯(lián)用法[10-11]、分光光度法[12]、電化學傳感器法[13-14]、表面增強拉曼散射法[15-17]等。

圖1 亮藍分子結構圖[18]Fig.1 Bright blue molecular structure diagram

黑米，屬珍貴糧油作物，是一種藥食兼用的有色大米，分為糯米和黏米兩種[19]，具有極高的營養(yǎng)價值、藥用及保健功能。黑米中顯現(xiàn)出來的顏色來源于種皮上沉積的色素，經(jīng)研究證明其內部含有花色苷類化合物，是一種天然水溶性色素。黑米花色苷主要活性成分為矢車菊素-3-葡萄糖苷，其結構內部含有酚羥基，表現(xiàn)出抗氧化活性[20-21]。黑米色素易溶于極性大的溶劑，如水、乙醇等，難溶于非極性溶劑[22]。黑米具有免疫調節(jié)、降血脂、抗癌、抗粥樣動脈硬化等功能[23]，學術領域對黑米特性、營養(yǎng)成分等研究越來越深入和廣泛。

目前，已有學者研究多種方法提取黑米樣品中的花青素，將其應用于動物體內，以測試并分析其功能性成分的作用機制[24-25]，也有將黑米與不同功能性食品復配制備新產(chǎn)品的研究[26-27]，但尚未發(fā)現(xiàn)針對黑米中是否含有合成著色劑及其含量的研究。本實驗以黑米為原材料，在本實驗前處理過程中引入NaHCO3，綜合考察產(chǎn)品加標回收率，類比國標方法中涉及到相關方法的加標回收率，從而驗證輔助提取試劑及新方法的可行性。旨在尋找前處理方法操作簡單、定量準確，同時適合不同種類糧油產(chǎn)品中合成著色劑測定的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器、材料與試劑

1.1.1 儀器

LC-20AT 高效液相色譜儀配備紫外檢測器，島津國際貿易有限公司；LABORATORY MILL 3100(Perten)實驗磨，瑞典波通儀器公司；PL602-L 電子天平，瑞士梅特勒-托利多(上海)有限公司；GL-20G-C 高速冷凍離心機，上海安亭科學儀器廠；Lab dancer 渦旋器，艾卡儀器設備有限公司；C300A 真空泵，德國WGIIENS；RV 10 Control 旋轉蒸發(fā)儀，德國IKA公司；HY-5 回旋式振蕩器，江蘇省金壇市環(huán)宇科學儀器廠；XC-300C超聲波清洗機，濟寧鑫欣超聲電子設備有限公司；COMFORT純水/超純水機，德國賽多利斯公司。

1.1.2 試劑與材料

市購3種黑米產(chǎn)品。

0.5 mg/mL國家標準物質亮藍[GBW(E)100005a]，中國計量科學研究院；甲醇(色譜級)，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；NaHCO3(分析純)，廣東省化學試劑工程技術研究開發(fā)中心；甲酸(色譜純)、NaCl(分析純)、氨水(分析純)、乙酸鈉(優(yōu)級純)、乙酸銨(優(yōu)級純),天津市光復精細化工研究所；KCl(優(yōu)級純)，成都市科龍化工試劑廠；Na2CO3(優(yōu)級純)，山東西亞化學股份有限公司。

13 mm 0.22 μm聚醚砜針式濾器,上海安譜實驗科技股份有限公司；Strata-X-AW 33 μm Polymeric Weak Anion固相萃取柱，60 mg/3 mL；Cleanert PWAX固相萃取柱，150 mg/6 mL；Cleanert JXA固相萃取柱，500 mg/6 mL；0.45 μm微孔過濾膜(水系)；0.45 μm微孔過濾膜(有機系)。

乙酸銨溶液(0.02 mol/L)：稱取1.54 g 乙酸銨，加水至 1 L，溶解，經(jīng) 0.45 μm 水系濾膜過濾。

實驗過程中所用水均為去離子水。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱：Inertsil ODS-SP C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；檢測波長629 nm，柱溫35 ℃，流動相：V(甲醇)∶V(0.02 mol/L乙酸銨溶液)=45∶55,流速1.0 mL/min；進樣體積10 μL，等濃度洗脫，分析時間20 min。

1.2.2 標準曲線點的配制

從亮藍標準物質溶液中吸取1 mL至10 mL容量瓶中，用去離子水定容至刻度，得到50 μg/mL的中間儲備液。再分別吸取適量中間儲備液，去離子水定容，制成質量濃度0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、15.0 μg/mL的系列標準溶液。

1.2.3 樣品前處理

準確稱取5.00 g(精確至0.01 g)粉碎細度達80～100目且混合均勻的樣品，置于100 mL離心管中，加入0.52 g NaHCO3，再加入25 mL 體積分數(shù)40%甲醇水渦旋提取12 min，將提取的樣品溶液離心5 min(4 000 r/min)，轉移上清液至100 mL比色管中。重復3次，保證樣品中色素被充分提取出來。

1.2.4 樣品凈化

依次用3 mL甲醇、水及體積分數(shù)2%的甲酸水溶液活化固相萃取柱，再取1 mL提取液上樣，之后用3 mL 2%甲酸水淋洗萃取柱，棄去濾液，將小柱抽干。然后用1 mL 體積分數(shù)25%氨水甲醇溶液進行洗脫，收集洗脫液。將收集的洗脫液于50 ℃旋轉蒸發(fā)儀中旋蒸濃縮至干，再用1 mL去離子水復溶，渦旋混合1 min，待樣品充分溶解后，過0.22 μm親水性針式過濾器，待上機分析。

1.2.5 單因素考查及綜合因素優(yōu)化

通過單因素比對法，分別對提取方式、提取次數(shù)、輔助提取試劑種類、輔助提取劑(NaHCO3)添加量、提取試劑體積分數(shù)、固相萃取柱種類以及濃縮方式等7個因素進行考查，同時在單因素實驗的基礎上，選取NaHCO3添加量、甲醇水體積分數(shù)、渦旋時間及凈化柱種類4個因素，采用Box-Behnken設計后續(xù)優(yōu)化實驗。以加標回收率為響應值，所有實驗組中均添加2 μg/mL的亮藍標樣，采用Design-Expert 8.0.6分析軟件得到二次回歸方程和誤差分析，確定優(yōu)化工藝并對最終優(yōu)化組實驗進行驗證。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 提取方式對加標回收率的影響

分別對比振蕩30 min、渦旋10 min及超聲10 min三種不同提取方式對檢測結果的影響(圖2)。試驗發(fā)現(xiàn)，因黑米自身花青素色素干擾，在3種不同提取方式下，樣品顏色差異并不明顯，其中80 W功率下超聲提取的樣品，測得亮藍加標回收率僅有20%左右，通過查閱文獻[22，29]發(fā)現(xiàn)，利用超聲波方式進行色素提取多適用于植物中天然色素的提取，同時超聲功率在190 W以上時，才能更好地提取色素，本單位儀器功能無法滿足，故棄去超聲提取法。對比振蕩提取和渦旋提取，2種方式測得亮藍提取率在75%～90%，證明2種方法均可用于黑米中亮藍色素的提取，但考慮實際情況，優(yōu)先選擇耗時較短的提取方式，故本實驗選取的提取方式為渦旋混合10 min。

圖2 提取方式對加標回收率的影響Fig.2 Effect of extraction method on the recovery rate of standard addition

2.1.2 提取次數(shù)對加標回收率的影響

通過分別對比1次和3次、4次提取對實驗中亮藍色素提取率的影響，為降低干擾，同時以大米為基底進行視覺參考比對。試驗發(fā)現(xiàn)，一次提取過程中，提取液顏色較淺，加標回收率在60%～65%，而3次提取時，提取液顏色較深，加標回收率在78%～82%。第4次提取時，提取液幾乎無色，經(jīng)測定，加標回收率與提取3次差異不大，見圖3。因此，最佳提取次數(shù)為3次。

圖3 提取次數(shù)對加標回收率的影響Fig.3 Effect of extraction times on the recovery rate of standard addition

2.1.3 輔助提取試劑種類對加標回收率的影響

考察不同輔助提取試劑對亮藍加標回收率的影響。稱取10份5.00 g樣品于離心管中，分別添加0.5 g NaHCO3、NaCl、KCl、Na2CO3和乙酸鈉5種試劑，每個水平設置2個平行，再加入25 mL 40%甲醇水渦旋提取10 min，將提取的樣品溶液4 000 r/min 離心5 min，轉移上清液至100 mL比色管中。重復操作3次，按照1.2.4方法凈化樣品，上機分析對比不同種類的輔助提取試劑對加標回收率的影響。檢測發(fā)現(xiàn)，添加有NaHCO3的提取溶液采用方法1.2.4凈化時，無肉眼可見色素流失的情況存在，并且測試結果表明黑米中亮藍的加標回收率明顯比其他4種輔助試劑高，加標回收率在70%～88%，見圖4。因此，實驗中選取NaHCO3作為輔助提取試劑。

圖4 輔助提取試劑種類對加標回收率的影響Fig.4 Effect of different auxiliary extraction reagents on the recovery rate of standard addition

2.1.4 NaHCO3添加量對加標回收率的影響

考察NaHCO3不同添加量對亮藍加標回收率的影響。稱取10份5.00 g樣品于離心管中，分別添加0.1、0.5、0.7、1.0、1.5 g NaHCO3，每個水平設置2個平行，再加入25 mL 40%甲醇水渦旋提取10 min，將提取的樣品溶液離心5 min(4 000 r/min)，轉移上清液至100 mL比色管中。重復操作3次，按照1.2.4方法凈化樣品，上機測定對比不同添加量對試驗結果的影響。檢測發(fā)現(xiàn)當NaHCO3添加量為0.5 g時，黑米中亮藍的加標回收率較其他水平略高，加標回收率在86%～88%，見圖5。因此，本實驗中NaHCO3添加量選取0.5 g。

圖5 NaHCO3添加量對加標回收率的影響Fig.5 Effect of NaHCO3 on recovery rate of standard addition

2.1.5 提取試劑體積分數(shù)對加標回收率的影響

考察不同提取液體積分數(shù)對亮藍加標回收率的影響。稱取12份5.00 g樣品及0.5 g NaHCO3于離心管中，分別添加35%、40%、45%、50%、55%、60%(體積分數(shù))的甲醇水溶液，每個水平設置2個平行，然后渦旋提取10 min，將提取的樣品溶液離心5 min (4 000 r/min)，轉移上清液至100 mL比色管中。重復操作3次，按照1.2.4方法凈化樣品，上機分析對比不同提取液體積分數(shù)對試驗結果的影響。當提取液為體積分數(shù)40%甲醇水溶液時，黑米中亮藍的加標回收率較其他水平略高，加標回收率在90%～93%，見圖6。因此，選取40%甲醇水溶液作為提取液。

圖6 提取試劑體積分數(shù)對加標回收率的影響Fig.6 Effect of concentration of extraction reagent on recovery rate of standard addition

2.1.6 固相萃取柱的選擇對加標回收率的影響

弱陰離子交換固相萃取柱和聚酰胺固相萃取柱均可用來凈化食品中的合成著色劑，而亮藍中含有苯磺酸結構，因此本研究選取Strata-X-AW和Cleanert PWAX兩種弱陰離子交換固相萃取柱[30]和Cleanert JXA聚酰胺固相萃取柱進行樣品凈化試驗。稱取6份5.00 g樣品及0.5 g NaHCO3于離心管中，加入25 mL 40%甲醇水渦旋提取10 min，將提取的樣品溶液離心5 min(4 000 r/min)，轉移上清液至100 mL比色管中。重復操作3次，按照1.2.4方法凈化樣品，每組設置2個平行，考察3種凈化柱對加標回收率的影響。結果表明：3種凈化柱對加標回收率影響的順序為Strata-X-AW>Cleanert JXA>Cleanert PWAX，其中Strata-X-AW固相萃取柱的加標回收率在80%～95%，而另外2種固相萃取柱凈化后的樣品加標回收率在61%～80%，雖然3種凈化柱均可用于黑米中亮藍的凈化，但是Strata-X-AW固相萃取柱效果最佳(圖7)。

圖7 固相萃取柱對加標回收率的影響Fig.7 Effect of SPE column on recovery rate of standard addition

在凈化過程中，針對是否需要平衡凈化柱,對相關方式進行比對。結果發(fā)現(xiàn)，未加入2%甲酸水平衡的凈化柱，在上樣后棄去的樣液中存在部分亮藍顏色，同時加標回收率僅為10%～40%，證明未經(jīng)甲酸水溶液平衡的固相萃取柱，無法將食品中提取的色素固定在凈化柱中，因而在淋洗、洗脫等后續(xù)操作中會流失部分色素。而經(jīng)甲酸水平衡的固相萃取柱，其加標回收率可達75%～92%。從凈化柱結構來看，弱陰離子交換固相萃取柱在上樣時為保證化合物離子最大化，應使樣品溶液的pH高于化合物酸度系數(shù)至少2個pH單位，而洗脫時，洗脫溶液pH應大于化合物酸度系數(shù)至少2個pH單位。因此，選取在活化過程中加入弱有機酸水溶液——甲酸水來平衡固相萃取柱。

本實驗中還嘗試比對了樣品過凈化柱及未過凈化柱對試驗結果的影響。經(jīng)儀器分析發(fā)現(xiàn)，未過凈化柱直接檢測的樣品，其加標回收率為100%～110%，證明樣品中亮藍色素已被完全提取，但存在長時間測定時，儀器基線不穩(wěn)，雜峰較多的問題。因此，本實驗采取過凈化柱處理。

2.1.7 濃縮方式對樣品加標回收率的影響

分別考察旋轉蒸發(fā)和氮氣吹掃兩種濃縮方式對樣品加標回收率的影響。實驗結果表明，旋轉蒸發(fā)方式濃縮的樣品加標回收率明顯高于氮氣吹掃濃縮的樣品，并且樣品平行性較好，同時可實現(xiàn)自動控制，便于試驗操作。而氮氣吹掃濃縮的樣品，在烘干過程中，可能存在樣品沾到小試管管壁上方而造成樣品部分損失。同時，由于無法自動監(jiān)控樣品烘干情況，當樣品烘干過度，再次利用去離子水溶解烘干后的樣品時，樣品無法完全溶解。因此，本實驗中采用旋轉蒸發(fā)方式濃縮樣品。

綜上所述，單因素實驗結果表明：采取渦旋混合方式提取樣品，提取次數(shù)為3次，NaHCO3添加量為0.5 g時，加標回收率好，同時發(fā)現(xiàn)NaHCO3添加量在0.1和0.5 g時加標回收率呈現(xiàn)緩慢上漲趨勢，遂以NaHCO3添加量、甲醇水體積分數(shù)、渦旋時間、凈化柱種類4個因素進行響應面優(yōu)化實驗。

2.2 響應面實驗

2.2.1 建立二次回歸方程及誤差分析

對表1中的數(shù)據(jù)進行回歸擬合得到二次回歸方程。加標回收率=-586.789+85.742A+29.963B+1.964C+36.692D-0.453AB+0.898AC+2.208AD-0.054BC-0.290BD+1.435CD-80.542A2-0.354B2-0.147C2-9.400D2。

表1 響應面試驗設計與結果Table 1 Design and results of response surface test

2.2.2 優(yōu)化組合驗證試驗

使用快速上升法優(yōu)化得到的提取黑米中亮藍的最佳方案為：NaHCO30.52 g，甲醇體積分數(shù)40.11%，渦旋時間12.17 min，凈化柱種類為2.32，預估加標回收率為91.00%，但考慮實際情況，選取NaHCO30.52 g，甲醇水體積分數(shù)為40%，渦旋時間12 min，2號凈化柱，對上述條件進行的驗證,結果見表3。

表2 響應面誤差分析結果Table 2 Error analysis results of response surface

表3 最優(yōu)組驗證試驗Table 3 Validation test of optimal group

由表3得出，最優(yōu)組亮藍提取加標回收率為91.81%，接近于響應面試驗組中最高組回收率，與理論預測值相比，其相對誤差約為0.81%。說明響應面優(yōu)化后得出的回歸方程有一定的實踐指導意義。

2.3 標準曲線、方法檢出限及精密度

合成著色劑亮藍的標準品色譜圖及黑米樣品中加標后的亮藍色譜圖分別見圖8和圖9。選取標準曲線中間濃度點重復進樣測定10次，對儀器穩(wěn)定性進行驗證。以質量濃度X為橫坐標，對應的色譜峰面積Y為縱坐標，繪制標準曲線，建立線性回歸方程。方法檢出限依據(jù)3倍信噪比計算，方法定量限依據(jù)10倍信噪比計算。經(jīng)測定可得，亮藍的線性方程為Y=87 231.6X-451.536 2，相關系數(shù)R=0.999 99，最低檢出濃度為0.02 mg/kg，定量限為0.05 mg/kg，方法精密度[23]為5.00%，標準方差為2.00%，相對標準偏差為1.63%。

圖8 合成著色劑亮藍標準品色譜圖Fig.8 Chromatogram of synthetic colorant bright blue

圖9 黑米樣品中加標后亮藍色譜圖Fig.9 Bright blue spectrum in black rice samples

2.4 樣品方法驗證及加標回收率實驗

購買3種不同品牌的黑米樣品，分別對樣品中的亮藍進行測定，同時驗證其加標回收率，測定結果如表4所示。

表4 不同品牌黑米樣品加標回收率和相對標準偏差Table 4 Spike recovery and relative standard deviation of different black rice samples

3種不同市購黑米樣品內部本身都不存在亮藍色素，在不同濃度加標情況下測得回收率為81.70%～91.52%，相對標準偏差為0.39%～1.75%，證明了本實驗方法可行性及穩(wěn)定性。

3 結論

本文聯(lián)合采用固相萃取及高效液相色譜法測定黑米中的著色劑亮藍，通過對國標GB 5009.35—2016中前處理和測定方法的改進，簡化了前處理的操作，使亮藍色素得到更好地分離。目前對黑米樣品中天然色素(花色苷)方面的研究較多，而產(chǎn)品中是否含有合成著色劑還未曾驗證，本文隨機購買市面上3種黑米產(chǎn)品，通過分析驗證得出黑米類產(chǎn)品中不含著色劑亮藍。無論是產(chǎn)品還是提取方法，均突顯出本實驗的創(chuàng)新性。本實驗研究得出當NaHCO3添加量為0.52 g，體積分數(shù)40%甲醇水溶液作為提取液，渦旋12 min，重復3次提取時，能夠將黑米中添加的亮藍完全提取出來，同時采用經(jīng)甲酸水平衡的Strata-X-AW固相萃取柱凈化，后經(jīng)旋轉蒸發(fā)方式濃縮樣品，得到樣品加標回收率為81.70%～91.52%，相對標準偏差為0.39%～1.75%，為黑米中著色劑亮藍的提取與測定提供了一種可靠、快速和便捷的分析方法。