田 沖，劉 超，陳封政，李書華，溫志國，李 駿，聶萬麗※

（1.樂山師范學(xué)院 化學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，四川 樂山 614000；2.樂山市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，四川 樂山 614000）

0 引言

喹諾酮藥物是一種含有4-喹諾酮結(jié)構(gòu)的人工合成藥物。有著抗菌譜廣、不良反應(yīng)少、價(jià)格便宜等優(yōu)點(diǎn)[1]，因此廣泛用于動(dòng)物和人類的感染性疾病的治療和預(yù)防[2]。對(duì)于禽類，喹諾酮藥物主要用于由敏感菌導(dǎo)致的呼吸道、消化道、尿道感染和增加禽類飼料轉(zhuǎn)化率[3]。在動(dòng)物飼養(yǎng)中由于缺少相關(guān)專業(yè)知識(shí)或追求更高的經(jīng)濟(jì)效益導(dǎo)致喹諾酮藥物在動(dòng)物源性食品中殘留的問題越來越嚴(yán)重[4]。通過食用喹諾酮?dú)埩舫瑯?biāo)的食品會(huì)造成耐藥性和毒副作用，影響人體健康[5-6]。因此，世界各國都規(guī)定了喹諾酮藥物在動(dòng)物源性食品中的限量標(biāo)準(zhǔn)。

目前喹諾酮藥物常用的檢測(cè)方法有高效液相色譜法[7]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[8]、酶聯(lián)免疫法[9]等，我國喹諾酮藥物的檢測(cè)方法主要有GB/T 20366—2006 和GB/T 21312—2007 等，這兩種國標(biāo)均使用了分離能力強(qiáng)、選擇性高、靈敏度高的LC-MS/MS。GB/T 20366—2006 使用2%甲酸-乙腈作為提取液，提取液澄清，有利于凈化；但標(biāo)曲選擇裸標(biāo)，因基質(zhì)效應(yīng)會(huì)導(dǎo)致回收率偏低。GB/T 21312—2007 使用EDTAMcllvaine 緩沖液作為提取液，提取液渾濁，影響后續(xù)凈化，使凈化時(shí)間和成本增加。試驗(yàn)對(duì)兩種國標(biāo)進(jìn)行比較并加以優(yōu)化，以滿足實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)需要。

1 材料與方法

1.1 材料

乙腈、冰乙酸、正己烷、甲酸、甲醇均為色譜純；檸檬酸、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉、乙二胺四乙酸二鈉均為分析純；HLB 固相萃取小柱（200 mg，6 mL）。

6 種喹諾酮標(biāo)準(zhǔn)品：洛美沙星（99.4%）Dr.Ehrenstorfer GmbH；諾氟沙星（97.2%）Dr.Ehren storfer GmbH；環(huán)丙沙星（99.3%）曼哈格；培弗沙星（99.7%）stanfordchem；氧氟沙星（99.0%）曼哈格；恩諾沙星（99.4%）曼哈格。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀 DGU-20AAPI3200 AB SCIEX 公司；電子天平 FA124 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；氮吹儀 HSC-B 天津市恒奧科技發(fā)展有限公司；固相萃取儀 VM24 天津艾杰爾科技有限公司；高速冷凍離心機(jī) TGL-16M長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司；水浴恒溫振蕩器SHA-B 常州冠軍儀器制造有限公司；數(shù)控超聲波清洗機(jī) KQ700 昆山市超聲儀器制造有限公司；超純水機(jī) UPT-Ⅱ-10T 四川優(yōu)普超純科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理方法

a）按GB/T 20366—2006 進(jìn)行提取和凈化，其中將提取液用量改為10 mL，飽和乙腈正己烷用量改為15 mL；均質(zhì)器均質(zhì)1 min 改恒溫震蕩器震蕩10 min，超聲10 min；4 000 r/min 改為10 000 r/min；分液漏斗分液后旋蒸改為40 ℃氮吹，其余不變。

b）按GB/T 21312—2007 進(jìn)行提取和凈化，其中將提取液用量改為10 mL；10 000 r/min 渦旋1 min 改為恒溫震蕩器震蕩10 min，超聲10 min；過HLB 固相萃取柱前將提取液經(jīng)過濕潤(rùn)濾紙過濾，其余不變。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：取適量喹諾酮藥物標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇配制成1000μg/mL 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用甲醇稀釋至1μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別移取適量混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，甲醇稀釋至系列濃度為5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL、80 ng/mL、100 ng/mL。

基質(zhì)配標(biāo)：取6 份5 g 陰性樣品（精確到0.01 g）按1.3.1 方法制成空白基質(zhì)溶液。分別取適量混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，用空白基質(zhì)稀釋至系列濃度為5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL、80 ng/mL、100 ng/mL。

隨行加標(biāo)：取6份5 g陰性樣品（精確到0.01 g），分別加入適量混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，按1.3.1 方法提取凈化。配制成系類濃度為5 ng/ml、10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL、80 ng/mL、100 ng/mL。

1.3.3 儀器條件

液相色譜條件：GB/T 20366—2006 色譜柱：Kromasil100-5-C18（3.9×150 mm）流動(dòng)相：乙腈+0.2%甲酸溶液，梯度洗脫程序見表1。

表1 GB/T 20366—2006 梯度洗脫程序

流速：0.8 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL。

GB/T 21312—2007色譜柱：C18柱（100*2.1 mm，1.7 μm）流動(dòng)相：A[40+60 甲醇乙腈溶液]；B[0.2%甲酸水溶液]梯度淋洗，梯度洗脫程序見表2。

表2 GB/T 21312—2007 梯度洗脫程序

流速0.2 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量20 μL。

兩種方法質(zhì)譜條件均為：離子源ESI+；離子噴霧電壓4500 v；霧化氣氮?dú)猓?0 ps；干燥氣氮?dú)猓?0 psi；離子化溫度450 ℃；碰撞氣氮?dú)狻?/p>

2 結(jié)果與分析

2.1 檢出限和線性

分別按GB/T 20366—2006、GB/T 21312—2007規(guī)定，向3 個(gè)陰性樣品中加入適量混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，按1.3.1 處理，不斷稀釋，以三倍信噪比所對(duì)應(yīng)濃度作為兩種方法的檢出限。詳見表4。試驗(yàn)比較了GB/T 20366—2006、GB/T 21312—2007 兩種方法的線性，結(jié)果見表5。

表3 喹諾酮藥物的質(zhì)譜分析參數(shù)

表4 兩種方法中幾種喹諾酮藥物的檢出限

表5 兩種方法中幾種喹諾酮藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線

GB/T 20366—2006 幾種喹諾酮藥物檢出限在0.04 μg/kg～0.32 μg/kg之間；GB/T 21312—2007幾種喹諾酮藥物檢出限在0.34 μg/kg～1.67 μg/kg之間，表明GB/T 20366—2006 靈敏度高于GB/T 21312 —2007，但兩種方法均滿足檢測(cè)要求。

由表5 可知，GB/T 20366—2006 中標(biāo)曲采用裸標(biāo)，標(biāo)曲的相關(guān)系數(shù)R ≥0.998，有較好的線性相關(guān)，而GB/T 21312—2007 標(biāo)準(zhǔn)曲線由于采用隨行加標(biāo)，相關(guān)系數(shù)R 最小為0.991 最大為0.997 波動(dòng)幅度較大，且線性不如GB/T 20366—2006。

2.2 精密度和加標(biāo)回收率

于5 g（精確到0.01 g）陰性樣品中分別加入10 ng、20 ng、40 ng 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.3.1 進(jìn)行處理，每個(gè)濃度設(shè)置6 個(gè)平行樣，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算對(duì)應(yīng)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，詳見表6 和表7。

表6 兩種方法中幾種喹諾酮藥物的回收率（r=6）

表7 兩種方法中幾種喹諾酮藥物的精密度（r=6）

由表6 和表7 可知，GB/T 20366—2006 回收率為53.72%～71.30%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.26%～ 7.69%。GB/T 21312—2007 回收率為84.37%～98.81%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.72%～6.58%。GB/T 20366-2006 回收率較低，其中諾氟沙星回收率最低只有53.72%，可能的原因是GB/T 20366—2006 未考慮基質(zhì)效應(yīng)的影響，回收率較差。GB/T 21312—2007 回收率明顯高于GB/T 20366—2006。兩種國標(biāo)精密度都滿足檢測(cè)要求。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

將基質(zhì)配標(biāo)的峰面積和裸標(biāo)的峰面積通過公式ME(%)=(A/B)*100%[10]計(jì)算：

A 為裸標(biāo)的峰面積；B 為基質(zhì)配標(biāo)的峰面積。當(dāng)ME ＜100%時(shí)，基質(zhì)對(duì)化合物產(chǎn)生抑制作用；當(dāng)ME ＞100%時(shí)，基質(zhì)對(duì)化合物產(chǎn)生增強(qiáng)作用；當(dāng)ME=100%時(shí)，無基質(zhì)效應(yīng)。

試驗(yàn)比較了兩種方法在濃度分別為5 ng/mL、20ng/mL、40 ng/mL、80 ng/mL 的基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果見表8。

表8 兩種方法中幾種喹諾酮藥物的基質(zhì)效應(yīng)

由表8 可知。GB/T 20366—2006、GB/T 21312—2007 均有明顯的基質(zhì)效應(yīng)，且不同化合物、同一不同濃度的基質(zhì)效應(yīng)影響不一；整體來說，GB/T 20366—2006 的基質(zhì)效應(yīng)較GB/T 21312—2007 小。由此可見，基質(zhì)效應(yīng)對(duì)LC-MS/MS 檢測(cè)喹諾酮類藥物的響應(yīng)造成了不可忽視的影響，由于GB/T 21312—2007 采用隨行加標(biāo)，消除了基質(zhì)效應(yīng)，因此回收率較高；而GB/T 20366—2006 采用裸標(biāo)，忽視了基質(zhì)效應(yīng)，因此回收率較低。

2.4 方法的優(yōu)化

雞肉中基質(zhì)較為復(fù)雜，基質(zhì)效應(yīng)較大，GB/T 20366—2006 使用裸標(biāo)導(dǎo)致回收率偏低，試驗(yàn)改為基質(zhì)配標(biāo)或隨行加標(biāo)，考察是否能抵消或者消除基質(zhì)效應(yīng)。GB/T 21312—2007 使用隨性加標(biāo)的方式，線性較差，試驗(yàn)考察基質(zhì)配標(biāo)對(duì)回收率及線性的影響；EDTA-Mcllvaine 緩沖液提取會(huì)提取出雞肉組織中的水溶性雜質(zhì)和部分蛋白質(zhì)導(dǎo)致過前處理小柱時(shí)堵塞，使用濾紙過濾后再過前處理小柱能有效避免前處理小柱堵塞。結(jié)果見表9、表10。

表9 優(yōu)化后兩種方法中幾種喹諾酮藥物的回收率（r=6）

表10 優(yōu)化后兩種方法中幾種喹諾酮藥物的精密度（r=6）

由表9、表10 可知，優(yōu)化后，GB/T 20366—2006采用基質(zhì)配標(biāo)回收率在68.17%～83.77%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.38%～5.47%之間；采用隨行加標(biāo)，回收率在79.75%～92.88%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.22%～5.41%之間，由此可見，采用基質(zhì)配標(biāo)和隨行加標(biāo)均能提高回收率，隨行加標(biāo)不僅消除了基質(zhì)效應(yīng)，還考慮到實(shí)驗(yàn)的操作誤差，因此加標(biāo)回收率更好，因此，GB/T 20366—2006 采用隨行加標(biāo)作為方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線。GB/T 21312—2007采用基質(zhì)配標(biāo)線性較原標(biāo)準(zhǔn)的線性好，但是回收率在70.38%～89.27%之間，不及原標(biāo)準(zhǔn)，因此GB/T 21312—2007 采用原標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3 結(jié)論

試驗(yàn)通過檢出限、線性、回收率、重復(fù)性、基質(zhì)效應(yīng)對(duì)兩種方法進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，由于雞肉基質(zhì)復(fù)雜，兩種國標(biāo)均有著不可忽視的基質(zhì)效應(yīng)。GB/T 20366—2006 提取和凈化時(shí)間明顯較短，操作更加便捷，有著更高的靈敏度和精密度，但回收率偏低；GB/T 21312—2007 有著更高的回收率。GB/T 20366—2006 在改進(jìn)之后回收率顯著提高，檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確。GB/T 21312—2007 改進(jìn)之后，使用濾紙過濾后再過前處理小柱能有效避免前處理小柱堵塞，節(jié)約檢測(cè)時(shí)間，提高檢測(cè)效率。兩種方法在優(yōu)化之后都能滿足實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)需要，因此在應(yīng)用中可以根據(jù)具體的條件選擇不同優(yōu)化之后的方法來獲取更好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。