馬旭東，王召軍，閆筱筱，崔 紅，張洪映

河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，鄭州市文化路95號(hào) 450002

植物表皮毛是表皮細(xì)胞的特化結(jié)構(gòu)，是植物表皮細(xì)胞的延伸，廣泛存在于植物的地上部分。植物表皮毛作為植物與環(huán)境間的天然屏障，能有效減輕病原菌、昆蟲(chóng)等有害生物對(duì)植物的損害以及紫外線照射造成的損傷，有利于減少水分散失和熱量損耗，提高植物對(duì)自身溫度的調(diào)節(jié)能力［1-3］。擬南芥的表皮毛是一種特化的、無(wú)腺體的單細(xì)胞表皮毛［4-5］。與擬南芥不同的茄科、豆科、菊科、大麻科和唇形科等植物屬于多細(xì)胞表皮毛，這些物種的表皮毛類型豐富，根據(jù)其分泌腺的有無(wú)，可分為保護(hù)毛（非分泌型）和腺毛（分泌型）。如菊科蒿屬的黃花蒿表面有兩種表皮毛，包括腺毛和T型保護(hù)毛。青蒿素是黃花蒿在腺毛中合成、積累和分泌的一種倍半萜內(nèi)酯，以青蒿素為基礎(chǔ)的聯(lián)合用藥（ACTs）被認(rèn)為是治療瘧疾的一線藥物［6］。番茄屬植物表皮毛共有7種類型（Ⅰ～Ⅶ），其中Ⅰ、Ⅳ、Ⅵ和Ⅶ型屬于腺毛，Ⅱ、Ⅲ和Ⅴ型為保護(hù)毛［7-8］。茄科煙草屬植物的表皮毛發(fā)達(dá)，包括保護(hù)毛和腺毛，腺毛約占總表皮毛的85%，根據(jù)腺毛柄部長(zhǎng)度，又分為長(zhǎng)柄腺毛和短柄腺毛；煙草腺毛分泌物中不僅含有西柏烷二萜等重要的香氣前體物質(zhì)，還具有抵抗蚜蟲(chóng)的作用［9］。有研究表明，煙草分泌物西柏三烯二醇有抗癌作用，且可誘導(dǎo)愛(ài)潑斯坦-巴爾病毒早期抗原和蛋白質(zhì)磷酸化［10］。煙草長(zhǎng)柄腺毛中可產(chǎn)生含Cd/Ca的晶體并外溢，進(jìn)而主動(dòng)排除煙葉中的Cd［11-12］。短柄腺毛是葉面抗性蛋白的主要合成場(chǎng)所，在抑制孢子萌發(fā)、抵抗真菌侵染中具有重要作用［13］。而目前有關(guān)不同類型煙草腺毛分泌物的差異方面鮮見(jiàn)報(bào)道，為此，以不同腺毛類型的煙草品系TI1068和TI35為材料，分析其表皮毛的形態(tài)結(jié)構(gòu)、主要葉面化學(xué)成分以及蚜蟲(chóng)嗜好性，旨在揭示煙草腺毛分泌物的化學(xué)成分特點(diǎn)和功能，為煙草腺毛的改良提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

普通煙草TI1068和TI35是由美國(guó)農(nóng)業(yè)部牛津煙草研究所（Oxford Tobacco Research Station，Oxford，North Carolina，USA）提供的，且是從美國(guó)本土以外收集到的普通煙草（N.tabacum）栽培品系。

1.2 煙草葉片表皮毛的形態(tài)比較

在煙株成熟期，選擇長(zhǎng)勢(shì)一致的4棵煙株，選取葉長(zhǎng)約10 cm的頂葉，在質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為0.2%的羅丹明B水溶液中浸染30 min，后用蒸餾水漂洗3次，沖洗未結(jié)合的染料，吸干表面水分。避開(kāi)葉脈切取葉中部約5 mm×8 mm葉片，在超景深顯微鏡（VHX-5000，日本基恩士公司）下觀察葉片的表皮毛形態(tài)和數(shù)量，隨機(jī)選擇10個(gè)視野進(jìn)行腺毛密度統(tǒng)計(jì)和分析。

1.3 葉面化學(xué)成分分析

在煙株成熟期，選擇長(zhǎng)勢(shì)一致的4棵煙株，選取第10～12位（從下向上數(shù)）中部葉提取葉面化學(xué)物質(zhì)。避開(kāi)主脈位置，取直徑為10 cm的葉圓片20片，采用有機(jī)溶劑萃取的方法提取煙葉的葉面化學(xué)物質(zhì)［14］。將葉圓片在二氯甲烷中依次浸提2 s，重復(fù)8次后加入1 mL內(nèi)標(biāo)（2.020 mg/mL蔗糖八乙酸酯和2.474 mg/mL正十七烷醇的混合液），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，氮吹儀吹干。加入500 μL體積比為1 ∶1的N，N-二甲基甲酰胺（DMF）和N，O-雙三甲硅基三氟乙酰胺（BSTFA），在75 ℃水浴中進(jìn)行60 min衍生化反應(yīng)，加入N，O-雙乙酰胺和吡啶各125 μL，獲得待測(cè)液。利用GC/MS（色譜儀型號(hào)HP-5890，質(zhì)譜儀型號(hào)vc-70SE，美國(guó)Agilent公司）進(jìn)行化學(xué)成分的定性和定量分析，色譜參數(shù)條件參考文獻(xiàn)［15］的方法。

1.4 半定量RT-PCR分析

在煙株成熟期，選擇長(zhǎng)勢(shì)一致的4株煙，取長(zhǎng)約10 cm的頂葉，去除葉脈后混合煙樣。按照Invitrogen Trizol Reagent說(shuō)明書(shū)提取總RNA，然后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以L25作為內(nèi)參基因，采用半定量RT-PCR方法分析西柏烷二萜合成基因GGPPS、CBTS和CYP71D16的表達(dá)量。在NCBI的Gene數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）檢索GGPPS、CBTS和CYP71D16的序列。將獲得的每個(gè)基因家族序列進(jìn)行序列比對(duì)，利用Primer 5.0在基因保守域設(shè)計(jì)引物，GGPPS-F：5′-TGTCGATTC ATGGGCTGCT-3′，GGPPS-R：5′-GTGGATCACAGG TGGGTCTTT-3′；CBTS-F：5′-CGACTTGCGAGGC AACAAGG-3′，CBTS-R：5′-GAGCGAATTCCATG TTCAATGAC-3′；CYP71D16-F：5′-TGTACTGCTA AGACTTATGA-3′，CYP71D16-R：5′-GGTTTCGA GTTCGTCCATT-3′；L25-F：5′-CCCCTCACCACA GAGTCTGC-3′，L25-R：5′-TTCTAACTCCTGTTGTT GTGGGAA-3′。PCR反應(yīng)條件：95 ℃5 min；95 ℃40 s，60 ℃50 s，72 ℃30 s，28個(gè)循環(huán)；72 ℃5 min。

1.5 蚜蟲(chóng)嗜好性比較

取TI1068和TI35大小相近的幼葉（15～20 cm）置于同一培養(yǎng)皿（直徑25 cm）中，為避免葉片在試驗(yàn)過(guò)程中失水，用濕潤(rùn)的脫脂棉將葉柄包裹，培養(yǎng)皿底部放置6層浸透無(wú)菌水的濾紙。將100頭蚜蟲(chóng)等距放于葉片之間，不限制蚜蟲(chóng)的自由活動(dòng)。將培養(yǎng)皿放置于25 ℃恒溫人工氣候箱（RXZ-500，寧波江南儀器廠）12 h，每隔3 h統(tǒng)計(jì)葉片上的蚜蟲(chóng)數(shù)量，設(shè)置3次重復(fù)，計(jì)算平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 煙草葉片表皮毛的形態(tài)比較

煙草TI1068和TI35葉片表皮毛的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果見(jiàn)圖1。TI1068和TI35同時(shí)具有長(zhǎng)柄腺毛、短柄腺毛和保護(hù)毛3種類型表皮毛。TI1068的腺毛以長(zhǎng)柄腺毛為主，腺毛頭部膨大，由多細(xì)胞組成，整個(gè)腺頭被分泌物包裹成球形或水滴形，含有極少量的保護(hù)毛（圖1A，B）。TI35的表皮毛以保護(hù)毛為主，頂部細(xì)胞與柄細(xì)胞結(jié)構(gòu)無(wú)差異，TI35的長(zhǎng)柄腺毛量甚少（圖1C，D）。TI1068和TI35的短柄腺毛形態(tài)無(wú)差異，柄細(xì)胞均為單細(xì)胞，腺毛頭部膨大呈圓球形，分泌物不及長(zhǎng)柄腺毛多。因此，TI1068的腺毛分泌物遠(yuǎn)多于TI35。

羅丹明B水溶液染色試驗(yàn)結(jié)果（圖2）顯示，保護(hù)毛不能著色；長(zhǎng)柄腺毛和短柄腺毛可以被羅丹明B水溶液染紅；總體來(lái)看，長(zhǎng)柄腺毛的著色程度比短柄腺毛深?？梢?jiàn)，長(zhǎng)柄腺毛和短柄腺毛均有糖酯分泌，而長(zhǎng)柄腺毛的糖酯含量或種類多于短柄腺毛。顯微鏡下統(tǒng)計(jì)葉面表皮毛的密度發(fā)現(xiàn)，TI1068總腺毛密度高于TI35，但未達(dá)到顯著水平；TI1068的長(zhǎng)柄腺毛密度極顯著高于TI35，約為T(mén)I35的10倍；TI35保護(hù)毛密度極顯著高于TI1068，約為T(mén)I1068的7倍；TI1068和TI35的短柄腺毛數(shù)量無(wú)顯著差異。

2.2 煙草葉面化學(xué)成分分析

圖1 煙草TI1068和TI35葉片表皮毛的形態(tài)比較Fig.1 Morphological comparison of trichomes on leaf surface between TI1068 and TI35

圖2 煙草TI1068和TI35葉片表皮毛密度的比較Fig.2 Comparison of trichome densities on leaf surface between TI1068 and TI35

西柏烷二萜、烷烴和蔗糖酯是煙草葉面分泌物的主要化學(xué)成分［16-17］。葉面化學(xué)成分分析結(jié)果（表1）顯示，TI1068和TI35的葉面分泌物成分相似，均含有西柏烷二萜、烷烴和蔗糖酯。TI1068中3種成分總量約是TI35的10倍，而各成分含量存在差異。TI1068：西柏烷二萜（66%）＞蔗糖酯類（24%）＞烷烴類（10%）；TI35：烷烴類（94%）＞西柏烷二萜（5%）＞蔗糖酯類（1%）。

通過(guò)對(duì)TI1068和TI35葉面化學(xué)成分的比較發(fā)現(xiàn)，TI1068葉面成分主要是西柏烷二萜和蔗糖酯，而TI35主要是烷烴類，僅存在微量的西柏烷二萜和蔗糖酯Ⅳ。此外，TI1068和TI35的烷烴種類和總量無(wú)差異。考慮到TI1068和TI35的表皮毛類型差異，即TI1068以長(zhǎng)柄腺毛為主，TI35以保護(hù)毛為主，短柄腺毛數(shù)量無(wú)差異，因此推測(cè)長(zhǎng)柄腺毛是西柏烷二萜和蔗糖酯合成的主要場(chǎng)所，而烷烴類主要在短柄腺毛合成。腺毛分泌物對(duì)于煙草品質(zhì)和抗性有重要影響［18］。有研究發(fā)現(xiàn)噴施茉莉酸甲酯可以促進(jìn)長(zhǎng)柄腺毛的發(fā)生，增加葉面分泌物含量，進(jìn)而增強(qiáng)葉片對(duì)蚜蟲(chóng)的驅(qū)避性［19-20］；敲除煙草NtCycB2基因可以增加長(zhǎng)柄腺毛的密度，提高西柏烷二萜含量，進(jìn)而改善煙葉品質(zhì)和抗性［21-22］。這些研究結(jié)果表明，不同腺毛類型對(duì)腺毛分泌物的貢獻(xiàn)不同，長(zhǎng)柄腺毛是西柏烷二萜合成的主要場(chǎng)所，增加長(zhǎng)柄腺毛密度是提高煙葉品質(zhì)和抗性的重要途徑。

表1 煙草TI1068和TI35葉面化學(xué)成分比較Tab.1 Comparison of leaf surface chemical components between TI1068 and TI35

表1 （續(xù)）

2.3 煙草西柏烷二萜合成基因的表達(dá)分析

牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶（Geranylgeranyl pyrophosphate synthase，GGPPS）是合成牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸（GGPP）的關(guān)鍵酶［23］，GGPP合成西柏烷二萜分為兩步：首先，GGPP在西柏三烯醇合酶（cembratrienol synthase，CBTS）的催化下發(fā)生環(huán)化反應(yīng)，形成α-西柏三烯一醇和β-西柏三烯一醇；然后，西柏三烯一醇在細(xì)胞色素CYP450加氧酶（Cytochrome P450 hydroxylase，CYP450）的催化作用下，第6位碳發(fā)生羥化反應(yīng)形成α-西柏三烯二醇和β-西柏三烯二醇，該酶的編碼基因?yàn)镃YP71D16［24］。

采用半定量RT-PCR方法分析TI1068和TI35中西柏烷二萜合成基因的表達(dá)量結(jié)果見(jiàn)圖3。從圖3中可以看出，GGPPS、CBTS和CYP71D16在TI1068中的表達(dá)水平均高于TI35。這與表皮毛的形態(tài)比較和葉面化學(xué)成分分析結(jié)果一致，即長(zhǎng)柄腺毛是西柏烷二萜合成的主要場(chǎng)所，TI1068具有高密度的長(zhǎng)柄腺毛，而TI35僅有微量的長(zhǎng)柄腺毛。

圖3 煙草TI1068和TI35西柏烷二萜合成基因的表達(dá)分析Fig.3 Expression analysis of genes related to diterpenoid biosynthesis in TI1068 and TI35

2.4 蚜蟲(chóng)嗜好性比較

圖4 煙草TI1068和TI35的蚜蟲(chóng)嗜好性比較Fig.4 Comparison of aphid preference between TI1068 and TI35

TI1068和TI35離體葉片上的蚜蟲(chóng)數(shù)量見(jiàn)圖4。在各檢測(cè)時(shí)段TI35葉片的蚜蟲(chóng)數(shù)量是TI1068的4～6倍。有研究表明，煙草腺毛可以特異地合成西柏烷二萜化合物，該化合物不僅具有抗真菌和抗蚜蟲(chóng)活性，還可作為活性劑刺激煙草夜蛾產(chǎn)卵，其對(duì)于幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)具有毒害作用［25-26］；提高煙草腺毛中西柏三烯一醇含量可提高煙草的抗蚜蟲(chóng)能力［27-28］。本研究中TI1068的蚜蟲(chóng)嗜好性極顯著低于TI35，其原因可能是由于TI1068中西柏三烯一醇含量是TI35的57倍。

3 結(jié)論

①TI1068和TI35均有長(zhǎng)柄腺毛、短柄腺毛和保護(hù)毛3種表皮毛類型；TI1068以長(zhǎng)柄分泌型腺毛為主，含有少量保護(hù)毛，TI35以非分泌型表皮毛為主，含有微量的長(zhǎng)柄腺毛；TI1068和TI35的短柄腺毛數(shù)量無(wú)顯著差異。②煙草TI1068和TI35葉面化學(xué)成分中均有西柏烷二萜、蔗糖酯和烷烴；TI1068葉面上3種物質(zhì)含量約為T(mén)I35的10倍；TI1068葉面主要化學(xué)成分是西柏烷二萜和蔗糖酯類物質(zhì)，而TI35主要是烷烴類，僅存在微量西柏烷二萜和糖酯Ⅳ。③西柏烷二萜合成基因GGPPS、CBTS和CYP71D16在TI1068中表達(dá)水平均高于TI35。④蚜蟲(chóng)對(duì)TI1068的嗜好性極顯著低于TI35。