張令慧，張沛沛，劉媛，陳濤，王彩香，程宏波，楊德龍

(1.甘肅省干旱生境作物學(xué)省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

小麥(Triticumaestivum)是我國(guó)四大主糧作物之一，主要分布在北方雨養(yǎng)農(nóng)業(yè)區(qū).隨著全球氣候的變化，淡水資源日益匱乏，土壤鹽漬化加劇，小麥在發(fā)育時(shí)期更易遭受干旱、低溫、干熱風(fēng)、鹽漬化等非生物脅迫，致使小麥生長(zhǎng)發(fā)育異常，產(chǎn)量和品質(zhì)顯著下降[1].為應(yīng)對(duì)各種非生物脅迫的危害，小麥在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中形成了一系列的生理生化調(diào)控機(jī)制[2-4].許多基因在小麥非生物逆境脅迫應(yīng)答中發(fā)揮著重要的作用[5-6].因此，深入發(fā)掘優(yōu)異的抗逆基因，解析其生物學(xué)功能，對(duì)小麥抗逆分子遺傳改良具有重要意義.

糖原合成激酶(glycogen synthase kinase 3/shaggy like kinase，GSKs)是一類保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族[7]，在響應(yīng)植物非生物脅迫和參與植物生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控方面起重要作用.近幾年，GSKs基因相繼在擬南芥(Arabidopsisthaliana)[8]、苜蓿(Medicagosativa)[9]、棉花(Gossypiumspp.)[10]和水稻(Oryzasativa)[11]中被發(fā)現(xiàn)與克隆.研究發(fā)現(xiàn)，GSK家族成員蛋白的激酶結(jié)構(gòu)域高度保守的[12]，在水稻和擬南芥GSK-like激酶結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)相似性達(dá)75%[13].GSKs能夠磷酸化多個(gè)下游底物來(lái)發(fā)揮生物學(xué)功能[14].BR信號(hào)通路的GSK3的同系物BIN2是通過(guò)磷酸化和去磷酸化控制BR信號(hào)傳導(dǎo)下游的轉(zhuǎn)錄因子BRZ1和BES1/BZR2來(lái)阻止信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，通過(guò)負(fù)向調(diào)節(jié)作用進(jìn)而誘導(dǎo)其他生化反應(yīng)[15]，而擬南芥ASKa是通過(guò)激活Glu-6-磷酸脫氫酶(G6PD)來(lái)調(diào)節(jié)應(yīng)激耐受性[16].植物中的GSKs是一個(gè)多基因家族[17]，在擬南芥中已經(jīng)鑒定出10個(gè)GSKs家族成員[18]，水稻中包含9個(gè)[19].進(jìn)化分析表明，植物GSKs家族成員可分為Ⅳ個(gè)亞家族[20]，其中已經(jīng)被鑒定的第Ⅳ亞家族基因AtSK11[21]、OsGSK5[22]和MsK4[9]受非生物脅迫誘導(dǎo)并且具有激酶活性.在擬南芥中，AtSK11受NaCl、干旱、ABA、熱誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)[21]，研究發(fā)現(xiàn)高鹽脅迫能夠快速誘導(dǎo)糖原合成激酶MsK4上調(diào)表達(dá)[9].水稻OsGSK5通過(guò)調(diào)節(jié)碳水化合物的代謝平衡從而調(diào)高了植物對(duì)鹽脅迫的耐受性[22].上述研究表明，植物GSKs的第Ⅳ亞家族成員在逆境脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要作用.然而，截止目前有關(guān)小麥GSK基因的克隆和響應(yīng)非生物脅迫的研究尚未見報(bào)道.因此，本研究擬克隆小麥TaGSK5基因并對(duì)其序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析和表達(dá)分析，以期為進(jìn)一步研究小麥TaGSK5基因生物學(xué)功能提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取隴中1號(hào)為供試材料，該品種適宜在甘肅蘭州和隴東地區(qū)、寧夏固原地區(qū)、陜西延安地區(qū)的旱地冬麥區(qū)種植.隴中1號(hào)在本實(shí)驗(yàn)室基地種植抗旱效果較好.

1.2 處理方法

挑選籽粒大小一致、圓潤(rùn)飽滿的隴中1號(hào)小麥種子置于培養(yǎng)皿上，4 ℃黑暗處理2 d后置于人工氣候室內(nèi)，在光照強(qiáng)度為62.5 μmol/(m2·s)，光周期為16 h/8 h，溫度為25 ℃條件下進(jìn)行培養(yǎng).待幼苗長(zhǎng)至兩葉一心時(shí)(14 d)，對(duì)小麥幼苗進(jìn)行非生物脅迫處理.將采用水培法培養(yǎng)的小麥幼苗置于20% PEG-6000溶液和200 mmol/L的NaCl的溶液中培養(yǎng)，分別在處理后0、1、3、6和12 h的時(shí)間點(diǎn)采集小麥幼苗各組織，液氮速凍后，-80 ℃超低溫保存?zhèn)溆?

1.2.1TaGSK5基因cDNA的引物設(shè)計(jì) 以水稻OsGSK5的cDNA為參考序列(XP_015633107)，在小麥數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站(http://202.194.139.32/blast/viroblast.php)中檢索其在小麥中的同源基因，通過(guò)序列比對(duì)獲得小麥TaGSK5的4個(gè)同源候選基因，命名為TaGSK5-1A，TaGSK5-4A，TaGSK5-5B及TaGSK5-5D.利用Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)通用引物進(jìn)行小麥隴中1號(hào)的TaGSK5基因擴(kuò)增：引物序列為TaGSK5-F(5′→3′):CAATCAGCTAGGAGATGGCGTA和TaGSK5-R(5′→3′)：CACCCACACAAAGCTACAGCT，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成.

1.2.4 生物信息學(xué)分析 運(yùn)用ExPASy-ProtParam對(duì)小麥TaGSK5的二級(jí)結(jié)構(gòu)及蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)；運(yùn)用ExPASy-ProtParam構(gòu)建TaGSK5蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)；使用WoLFPsort (www.gens cript.com/wolf-psort.html)預(yù)測(cè)TaGSK5的亞細(xì)胞定位；在NCBI網(wǎng)站搜索不同物種的GSK同源蛋白并利用DNAMAN軟件進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)；使用STRING(https://string-db.org/cgi/input)預(yù)測(cè)TaGSK5蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)；采用MEGA 7.0軟件構(gòu)建小麥、水稻、擬南芥、苜蓿、大麥和粗山羊草等8個(gè)物種GSK同源蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹；在WheatExp(https://wheat.pw.usda.gov/ WheatExp/)數(shù)據(jù)庫(kù)下載小麥不同組織(根、莖、幼穗、葉和籽粒)TaGSK5基因的表達(dá)譜數(shù)據(jù)，利用TBtools軟件繪制表達(dá)譜數(shù)據(jù)熱圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 TaGSK5基因cDNA的克隆及基因結(jié)構(gòu)

以小麥隴中1號(hào)葉片的cDNA為模板，使用特異性引物TaGSK5-F和TaGSK5-R擴(kuò)增目的片段，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)，在1 200 bp左右出現(xiàn)1個(gè)特異性條帶(圖1).將目的條帶回收純化、轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑選陽(yáng)性克隆測(cè)序驗(yàn)證.測(cè)序結(jié)果與中國(guó)春的4條序列進(jìn)行比對(duì).結(jié)果表明，不同單克隆菌的序列信息與1A、4A、5B和5D染色體上中國(guó)春釋放的序列信息相一致，將其命名為TaGSK5.所得到的4個(gè)TaGSK5基因cDNA序列，分別位于小麥的1A、4A、5B和5D的染色體上，故將其分別命名為TaGSK5-1A、TaGSK5-4A、TaGSK5-5B和TaGSK5-5D.通過(guò)基因結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，TaGSK5的4個(gè)部分同源基因都編碼426個(gè)氨基酸且均由12個(gè)外顯子和11個(gè)內(nèi)含子組成(圖2).

M：DL5000 DNA marker；1：TaGSK5基因的擴(kuò)增產(chǎn)物.M:DL5000 DNA marker;1:The amplification products of TaGSK5 gene.圖1 TaGSK5基因cDNA序列擴(kuò)增Figure 1 The cDNA amplificated products of TaGSK5 gene

圖2 TaGSK5的基因結(jié)構(gòu)Figure 2 The gene structure of TaGSK5

2.2 TaGSK5基因編碼的氨基酸序列比對(duì)及進(jìn)化樹分析

使用DNAMAN對(duì)小麥TaGSK5與水稻(XP_015633107)、苜蓿(AF432225)和擬南芥(At1g 09840)的氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)(圖3)，結(jié)果表明，小麥TaGSK5的4個(gè)同源基因氨基酸相似性達(dá)到99.43%，4個(gè)物種間的同源性在70%以上，TaGSK5與水稻相似性較高(>90%)，與苜蓿和擬南芥的同源性較低.他們的GSK激酶(88-375)結(jié)構(gòu)域高度相似，其中的功能基序TREE、CDFGSAK和SYICSR的序列較一致，表明TaGSK5蛋白在進(jìn)化過(guò)程中具有較強(qiáng)的保守性.進(jìn)化分析表明，TaGSK5的4個(gè)部分同源基因和粗山羊草處于同一個(gè)分支(圖4)，說(shuō)明祖先種來(lái)源于粗山羊草.

2.3 TaGSK5蛋白二級(jí)及三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

通過(guò)(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/)在線軟件預(yù)測(cè)了TaGSK5的4個(gè)同源蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成，結(jié)果表明這4個(gè)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的比例均由α-螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲、延伸鏈和β-折疊構(gòu)成(表1).TaGSK5-5B、TaGSK5-5D、TaGSK5-4A和TaGSK5-1A蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)α-螺旋分別占36.71%、36.71%、36.85%和37.32%，無(wú)規(guī)則卷曲分別占42.72%、40.24%、42.02%和40.85%，延伸鏈分別占15.26%、16.24%、15.73%和15.49%，β-折疊分別占6.34%、6.82%、5.40%和6.34%.通過(guò)(https://web.expasy.org/protparam/)在線軟件構(gòu)建TaGSK5蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，因TaGSK5的4個(gè)同源蛋白的氨基酸序列高度相似，同源建模選用的蛋白模型相同，故使用TaGSK5-5B蛋白序列構(gòu)建三級(jí)結(jié)構(gòu)(圖5).由圖5可知，TaGSK5-5B蛋白的結(jié)構(gòu)兩端是由少部分的β-折疊，中間是α-螺旋由無(wú)規(guī)則卷曲串聯(lián)起來(lái)的空間結(jié)構(gòu)，主要是以α-螺旋和β-折疊形成的特殊結(jié)構(gòu)來(lái)行使激酶功能.

表1 TaGSK5蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

黑色方框：GSK蛋白激酶催化結(jié)構(gòu)域；綠色背景：ATP結(jié)合位點(diǎn)；黃色背景和灰色背景：分別為高度保守基序CDFGSAK和SYICSR，僅存在于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶GSK-3亞家族成員；紅色背景：植物中的保守基序TREE.Black box：GSK protein kinase catalytic domain；Green background：ATP binding site；Yellow and gray backgrounds shows highly conserved motifs CDFGSAK and SYICSR，respectively，which are only present in the members of the GSK-3 subfamily of serine/threonine protein kinases；Red background：TREE is the conservative motif in plants.圖3 小麥TaGSK5與其他物種同源蛋白的氨基酸序列比對(duì)Figure 3 Alignments of amino acid sequences of wheat TaGSK5 with homologous proteins of other species

圖4 小麥與其他物種GSK蛋白的進(jìn)化分析Figure 4 Phylogenetic tree of GSK from wheat and other species

圖5 TaGSK5蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)圖Figure 5 Prediction of the tertiary structure of TaGSK5

2.4 TaGSK5蛋白的理化性質(zhì)、親疏水性及磷酸化位點(diǎn)分析

利用EXPASY-ProtParam在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)TaGSK5蛋白的理化性質(zhì)(表2).結(jié)果顯示，這4個(gè)同源蛋白的理化性質(zhì)非常接近.TaGSK5-5D、TaGSK5-5B、TaGSK5-4A和TaGSK5-1A的等電點(diǎn)非常接近，等電點(diǎn)分別為8.53、8.57、8.79和8.54；分子量分別為48 226.51、47 602.69、48 237.52和48 314.58.通過(guò)EXPASY-ProtParam網(wǎng)站預(yù)測(cè)TaGSK5蛋白質(zhì)的親疏水性，親水性的氨基酸明顯多于疏水性蛋白，表明TaGSK5蛋白質(zhì)為親水性蛋白(圖6).利用EXPASY-ProtParam網(wǎng)站預(yù)測(cè)小麥TaGSK5蛋白磷酸化位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)TaGSK5蛋白有絲氨酸位點(diǎn)13個(gè)、蘇氨酸位點(diǎn)8個(gè)、酪氨酸位點(diǎn)6個(gè).表明該蛋白可能通過(guò)不同的磷酸化底物實(shí)現(xiàn)基因的調(diào)控功能(圖7).

表2 TaGSK5基因編碼的蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)

垂直線零點(diǎn)以下代表相對(duì)的親水區(qū)，零點(diǎn)以上為疏水區(qū).The vertical line below the zero point represents the relative hydrophilic area，and the vertical line above the zero point represents the hydrophobic area.圖6 TaGSK5蛋白的親疏水性預(yù)測(cè)Figure 6 Prediction of hydrophilicity and hydrophobicity of TaGSK5

圖7 TaGSK5蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)Figure 7 Prediction of phosphorylation site of TaGSK5

2.5 TaGSK5蛋白的亞細(xì)胞定位及互作蛋白網(wǎng)絡(luò)

利用WOLFPSORT在線軟件預(yù)測(cè)分析TaGSK5蛋白亞細(xì)胞定位，這4個(gè)同源蛋白主要分布在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、線粒體和過(guò)氧化物酶體中，但在細(xì)胞核和線粒體中的比例較高(表3)，且TaGSK5蛋白沒(méi)有信號(hào)肽結(jié)構(gòu)，表明該蛋白不屬于分泌蛋白.利用STRING在線軟件對(duì)TaGSK5的互作蛋白預(yù)測(cè)(圖8)發(fā)現(xiàn)，與TaGSK5互作的蛋白中有4個(gè)絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白磷酸酶、2個(gè)cGMP依賴性蛋白激酶、1個(gè)具有Kelch樣重復(fù)結(jié)構(gòu)域的蛋白磷酸酶、1個(gè)PKG_like.1-ACG激酶和1個(gè)蛋白磷酸酶.

表3 TaGSK5的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

2.6 TaGSK5基因的表達(dá)特性分析

通過(guò)分析WheatExp數(shù)據(jù)庫(kù)中TaGSK5基因在不同組織的表達(dá)譜數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)TaGSK5基因在小麥不同組織中均有表達(dá)，莖和穗中表達(dá)高于其他組織，在穗中的表達(dá)量最高(圖9).通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，小麥幼苗在干旱脅迫處理0～6 h時(shí)該基因表達(dá)量顯著下調(diào)，在6～12 h時(shí)該基因的表達(dá)量上升.在NaCl處理下TaGSK5基因的表達(dá)量沒(méi)有發(fā)生顯著變化(圖10).

Traes_1DL_379E66DDF.2和Traes_1BL_8FF2B3EDB.2：拓?fù)洚悩?gòu)酶1相關(guān)因子1；Traes_1AS_B064460F3.1、Traes_1DS_F6BDFABDF.1和Traes_1BS_9DF369DD41.1：Kelch重復(fù)域的蛋白磷酸酶；Traes_6BL_DFDCD5B11.1：AGC_PKA / PKG_like.1-ACG激酶；Traes_5AL_CD9481C81.1：絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶；Traes_6DS_C7EA481F4.2：蛋白磷酸酶2C；Traes_1AL_D5664FB85.2，Traes_1BS_9DF369DD4.1與Traes_1BS_9DF369DD41.1：含八糖肽或四三肽重復(fù)(TPR)的蛋白質(zhì).Traes_1DL_379E66DDF.2 and Traes_1BL_8FF2B3EDB.2：Topoisomerase 1 related factor 1；Traes_1AS_B064460F3.1，Traes_1DS_F6BFABDF.1 and Traes_1BS_9DF369DD41.1：Kelch repeat domain protein phosphatase；Traes_6BL_DFDKG_PKGC5B11.1:AGC_PKA / PKG_like.1-ACG kinase；Traes_5AL_CD9481C81.1：serine/threonine protein phosphatase;Traes_6DS_C7EA481F4.2：protein phosphatase 2C;Traes_1AL_D5664FB85.2，Traes_1BS_9DF369DD4.1 and Traes_1BS_9DF369DD41.1：proteins containing octa-glycopeptide or Tetratrieptide Repeat (TPR) domain.圖8 TaGSK5蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)Figure 8 Interaction network of TaGSK5

G：籽粒；L：葉片；R：根部；S：穗部；ST：莖部.G：Grain；L：Leaf;R：Root；S：Spike；ST：Stem.圖9 TaGSK5基因在不同組織中的表達(dá)量Figure 9 TaGSK5 gene expression in different tissues

3 討論

糖原合酶激酶3(GSK3)是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，是一種多功能激酶[7].大多數(shù)已經(jīng)被克隆出的GSK基因參與非生物脅迫響應(yīng)[22-23].本研究從小麥隴中1號(hào)中克隆了4個(gè)TaGSK5的cDNA序列，序列長(zhǎng)度1 281bp.在水稻中，OsGSK5包含12個(gè)內(nèi)含子和11個(gè)外顯子[6]，與在本研究中TaGSK5的4個(gè)同源基因的基因結(jié)構(gòu)一致.他們所編碼的蛋白無(wú)論從基因結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)還是蛋白結(jié)構(gòu)域都高度相似[22].氨基酸序列比對(duì)顯示，TaGSK54個(gè)部分同源基因所編碼的蛋白的序列相似性達(dá)98%，與擬南芥、水稻和苜蓿中同源基因具有很高的相似性[9,11,21].本研究發(fā)現(xiàn)小麥TaGSK5的4個(gè)部分同源基因的激酶結(jié)構(gòu)域高度保守，其中TREE結(jié)構(gòu)域在不同物種中都存在[11].最近研究發(fā)現(xiàn)，GSK激酶結(jié)構(gòu)域在不同植物中的功能基序高度相似，擬南芥bin2-1突變體出現(xiàn)矮化的表型是由于TREE基序突變，抑制了GSK蛋白激酶的活性所引起[11]，表明功能基序在植物中激活激酶活性及蛋白功能的發(fā)揮具有作用.

A：PEG處理；B：NaCl處理.圖柱上不同字母表示差異顯著(P<0.05).A:PEG treatment;B：NaCl treatment.Different letters on the bar indicate significant differences (P<0.05).圖10 在PEG和NaCl處理下TaGSK5的差異表達(dá)量Figure 10 Differential expression of TaGSK5 under PEG and NaCl treatment

進(jìn)一步研究表明，GSK基因通過(guò)磷酸化下游蛋白來(lái)調(diào)控植物的生理過(guò)程[23-24].在水稻中的OsSK22介導(dǎo)OsBZR1磷酸化從而調(diào)控BR信號(hào)通路[25]，本研究預(yù)測(cè)出TaGSK5蛋白有13個(gè)絲氨酸、8個(gè)蘇氨酸和6個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)，推測(cè)小麥TaGSK5蛋白通過(guò)磷酸化下游底物來(lái)調(diào)控不同的生物學(xué)過(guò)程.基因表達(dá)譜分析顯示，TaGSK5在小麥的根、莖、葉和穗中均有表達(dá)，但在不同組織間的表達(dá)水平存在顯著差異，其中在莖和穗中的表達(dá)量較高，而在葉和根中表達(dá)量較低.不同物種GSK基因在非生物脅迫處理下基因表達(dá)量也不盡相同.Wang等[10]報(bào)道了棉花中的第四亞家族成員GhSK42在鹽脅迫處理下沒(méi)有顯著性的變化，而苜蓿MsK4和水稻OsGSK5過(guò)表達(dá)后分別提高了苜蓿和水稻對(duì)非生物脅迫的耐受性[9,22]，本研究發(fā)現(xiàn)TaGSK5基因在干旱脅迫下表達(dá)量逐漸降低，而在鹽脅迫下表達(dá)量沒(méi)有顯著變化.結(jié)果說(shuō)明，不同植物中的GSK5基因在非生物脅迫中的響應(yīng)機(jī)制不盡相同，本研究推測(cè)小麥TaGSK5基因負(fù)調(diào)控小麥耐旱性.關(guān)于該基因在非生物脅迫中的具體調(diào)控機(jī)制，還有待于進(jìn)一步的研究.

4 結(jié)論

本研究克隆出的小麥TaGSK5基因，包含4個(gè)部分同源基因，其基因結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域及蛋白的理化性質(zhì)非常相似.TaGSK5基因在不同組織具有不同表達(dá)模式，在干旱脅迫TaGSK5下調(diào)表達(dá)，不響應(yīng)鹽脅迫，研究結(jié)果為進(jìn)一步探究小麥TaGSK5基因的功能提供了理論依據(jù).