陳小瑛，孔東升,,3，王立，陳艷霞，柯善文

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.河西學(xué)院，甘肅 張掖 734000；3.甘肅省黑果枸杞工程研究中心，甘肅 張掖 734000)

黑果枸杞(Lyciumruthenicum)是茄科(Solanaceae)枸杞屬(Lycium)的多年生耐鹽、抗旱灌木.主要分布于我國新疆、內(nèi)蒙、青海、寧夏及陜西東部等地[1]，是干旱荒漠區(qū)重要的水土保持樹種.其果實(shí)也是迄今為止發(fā)現(xiàn)含原花青素最高的野生植物[2]，且藥食兼用，具有強(qiáng)腎、潤肺、明目、健胃、補(bǔ)腦、抗衰老及通經(jīng)作用[3].關(guān)于黑果枸杞果實(shí)的研究大多集中在有效成分的藥理作用[4-6]、化學(xué)成分[7-8]、以及微量元素[9-10]等方面.

SSR(simple sequence repeats，SSR)標(biāo)記是近年發(fā)展起來的一種以特異引物PCR為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)，也稱微衛(wèi)星DNA，是一類由幾個(gè)堿基組成的串聯(lián)重復(fù)序列.每個(gè)SSR兩側(cè)的序列一般是相對保守的單拷貝序列，串聯(lián)重復(fù)而成的DNA序列數(shù)量豐富、覆蓋整個(gè)基因組、揭示的多態(tài)性高[11].它以孟德爾方式遺傳，呈共顯性[12-14].微衛(wèi)星DNA以遺傳基因組學(xué)為基礎(chǔ)，是植物有效成分生物合成途徑中的分子機(jī)制.植物中次生代謝產(chǎn)物的合成和積累受遺傳基因控制，由其自身生物遺傳特性決定[15].李瑞明[16]、張蕊[17]、楚秀麗[18]，分別通過研究不同種源的毛脈酸模根、2年生南方紅豆杉、青錢柳葉片黃酮類物質(zhì)，揭示了不同地理種源(基因型)對次生代謝產(chǎn)物積累的不同影響及作用.徐茂軍[19]研究了細(xì)胞內(nèi)部的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)對植物次生代謝產(chǎn)物合成的影響，表明植物體內(nèi)次生代謝物質(zhì)的合成受細(xì)胞內(nèi)部相關(guān)基因調(diào)控.

目前，黑果枸杞在分子水平上的研究已取得一定的進(jìn)展.林麗[20]、阿力·同其米克[21]用ISSR分子標(biāo)記對黑果枸杞進(jìn)行遺傳多樣性研究，分析了不同居群間的相關(guān)遺傳參數(shù)，表明所研究的黑果枸杞有高的遺傳多樣性且遺傳背景復(fù)雜.尹躍[22]、黃興發(fā)[23]則對黑果枸杞分子標(biāo)記進(jìn)行開發(fā)，為黑果枸杞構(gòu)建遺傳圖譜以及遺傳多樣性的研究提供了可行的標(biāo)記選擇.許興[24]等利用RAPD分子標(biāo)記技術(shù),對不同地區(qū)主要栽培的寧夏枸杞品進(jìn)行了分析，構(gòu)建了主要推廣品種寧杞1號的RAPD圖譜.但是以SSR分子標(biāo)記分析微衛(wèi)星標(biāo)記與黑果枸杞數(shù)量性狀關(guān)聯(lián)研究未見報(bào)道，這使得黑果枸杞在分子標(biāo)記輔助育種以及遺傳多樣性方面的研究進(jìn)程緩慢，導(dǎo)致人們無法充分合理的開發(fā)和利用該資源.

本試驗(yàn)采用SSR分子標(biāo)記的方法，選擇已經(jīng)發(fā)表的枸杞分子標(biāo)記開發(fā)的相關(guān)報(bào)道中的23個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記[25-26]，與黑果枸杞果實(shí)中花青素、多酚和黃酮的相關(guān)性進(jìn)行研究.以期為黑果枸杞分子標(biāo)記輔助育種、遺傳圖譜的構(gòu)建和優(yōu)良品種選育提供參考，并為黑果枸杞分子育種和產(chǎn)業(yè)發(fā)展奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2019年9月對甘肅省玉門的黑果枸杞進(jìn)行種質(zhì)資源調(diào)查、收集與研究.該地區(qū)屬于大陸性溫帶干旱氣候，晝夜溫差大，平均海拔1 200 m，年平均氣溫7.5 ℃，年平均降水量63.3 mm，蒸發(fā)量2 952 mm.通過樹勢、樹高、冠幅、干高、胸徑、葉片形狀、果實(shí)特征等表型數(shù)據(jù)初選黑果枸杞優(yōu)樹100株，采摘其果實(shí)，進(jìn)行相關(guān)處理并在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行花青素、多酚和黃酮含量的測定.以花青素含量為主要經(jīng)濟(jì)性狀，按照K-均值聚類法以相似性原則將其分為高、中、低3類，在3類中分別選取14株作為SSR分子標(biāo)記試驗(yàn)材料.

1.2 主要試驗(yàn)試劑

香草醛、矢車菊-3-O-葡萄糖苷、沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、福林酚、亞硝酸鈉、硝酸鋁、石油醚、鹽酸、硫酸均為分析純、甲醇為色譜純、TaKaRa MiniBEST Plant Genomic DNA Extraction Kit、Agarose D-1 LE、DL10,000 DNA Marker、DL2000 DNA Marker、Goldview核酸染料、6×DNA Loading Buffer、Premix TaqTM(Ex TaqTMVersion 2.0 plus dye)購于寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司，12% Precast-GLgel Tris-Glycine電泳預(yù)制膠購于上海生工生物工程股份有限公司.

1.3 試驗(yàn)儀器

恒溫水浴鍋(型號 DK-98-Ⅱ天津市泰斯特儀器有限公司)、索氏提取器、紫外可見分光光度計(jì)(型號UV-1701PC)、高通量組織研磨器、小型離心機(jī)、BIO-RAD梯度基因擴(kuò)增儀(T100，時(shí)代聯(lián)想生物技術(shù)有限公司)、垂直電泳儀(DYY-6C，北京六一儀器廠)、水平電泳儀(DYCP-32A,北京六一儀器廠)、UVP凝膠成像系統(tǒng)(GelDoc-It 2315).

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 花青素含量的測定 花青素含量的測定參照賀盼[27]試驗(yàn)方法進(jìn)行.繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后取上清液，在分光光度計(jì)545 nm處測其吸光度，試驗(yàn)重復(fù)3次.采用硫酸-香草醛法測定含量.其計(jì)算公式計(jì)算為：

含量(%)=(Ax×Cr/Ar)×D/W×100%

式中：Ar為對照品溶液吸光度，Ax為供試品溶液吸光度，Cr為對照品溶液濃度，D為稀釋倍數(shù)，W為試驗(yàn)材料質(zhì)量.

1.4.2 多酚含量的測定 多酚含量的測定參照祁

銀燕[28]試驗(yàn)方法進(jìn)行.建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，取上清液，在分光光度計(jì)765 nm處測吸光值,試驗(yàn)重復(fù)3次.計(jì)算公式如下：

含量(mg/g) =(X1×V1×V2)/W

式中：X1為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得樣品濃度值(mg/mL),V1為提取液稀釋倍數(shù),V2為提取液總體積(mL),W為原料干質(zhì)量(g).

1.4.3 黃酮含量的測定 黃酮含量的測定參照李淑珍[29]方法進(jìn)行.建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，取上清液，在分光光度計(jì)510 nm測其吸光度，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次.計(jì)算公式如下：

式中：y是樣液濃度(mg/mL)，v1是樣液體積(mL)，v2是樣品定容體積(mL)，v3是顯色反應(yīng)測定時(shí)取用樣液體積(mL)，m是樣品量(g).

1.4.4 引物的種類與合成 試驗(yàn)所引用的23個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記來源于已經(jīng)發(fā)表的枸杞分子標(biāo)記開發(fā)的相關(guān)報(bào)道，引物名稱和退火溫度詳見表1.其由上海生工生物工程股份有限公司合成.

表1 23個(gè)引物相關(guān)資料

1.4.5 DNA的提取與檢測 采用植物基因組DNA提取試劑盒提取DNA，配置1%瓊脂糖凝膠將提取的DNA進(jìn)行電泳，-20℃保存.

1.4.6 PCR反應(yīng)體系與擴(kuò)增程序 PCR反應(yīng)體系：總體積為10 μL，其中模板DNA為0.5 μL，上下游引物共0.5 μL，Premix TaqTM(Ex TaqTMVersion 2.0 plus dye) 5 μL，dH2O 4 μL.

PCR擴(kuò)增程序：98 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)，72 ℃后延伸5 min，PCR產(chǎn)物-20 ℃保存.

1.4.7 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳 用12%的聚丙烯酰胺凝膠對PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測，并以DL2000 DNA Marker作為參照.電泳電壓為150 V，時(shí)間為1 h，等標(biāo)準(zhǔn)參照染料跑至膠板底部時(shí)，切斷電源，停止電泳.取出凝膠后采用硝酸銀染色后進(jìn)行凝膠成像.

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

參照DL2000 DNA Marker，并利用Gene Mapper 4.0軟件判定所有樣品的基因型.用Microsoft Excel對初始數(shù)據(jù)進(jìn)行整理.用popgene 32.0計(jì)算微衛(wèi)星有效等位基因數(shù)(Ne)、期望雜合度(E_Het)等群體參數(shù)，按照以下公式計(jì)算多態(tài)信息含量(PIC)[30]，其中m為等位基因數(shù)量，Pi為第i個(gè)等位基因的頻率.

用SPSS 25.0進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)與方差分析.用單因素ANOVA法對微衛(wèi)星位點(diǎn)不同基因型與經(jīng)濟(jì)性狀進(jìn)行相關(guān)性分析，若微衛(wèi)星位點(diǎn)與性狀間具有顯著性差異，則用LSD進(jìn)行多重比較.

2 結(jié)果與分析

2.1 性狀分布

對黑果枸杞青花素、多酚和黃酮含量進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)(表2)，三者P值均大于0.05，說明其含量頻率分布均符合正態(tài)分布.

表2 花青素、多酚和黃酮的正態(tài)性檢驗(yàn)

2.2 電泳結(jié)果

2.2.1 瓊脂糖凝膠電泳 對提取的42株黑果枸杞果實(shí)的DNA，用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，如圖1所示，展示了部分樣品DNA提取結(jié)果.

2.2.2 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳 用23對微衛(wèi)星引物對42個(gè)樣本基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增和聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，各微衛(wèi)星均獲得了穩(wěn)定、清晰的DNA條帶,并在個(gè)體間表現(xiàn)出不同程度的多態(tài)性.圖2顯示位點(diǎn)KY284848對部分黑果枸杞個(gè)體擴(kuò)增結(jié)果.

2.3 遺傳多樣性分析

23個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)遺傳多樣性信息見表3.共檢測到89個(gè)等位基因，平均為3.87個(gè)，其中位點(diǎn)KY284849、KY284856、KY28485均為5個(gè).Ne最多的是KY284856(3.84)，最少的是c23113-g1(1.96)，平均為2.98.觀測雜合度在0.43～0.90之間，多態(tài)信息含量在0.41～0.69之間.

M表示Marker DL10000；1～10分別表示10個(gè)樣本個(gè)體.M means Marker DL10000；1～10 means 10 sample individuals respectively.圖1 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNAFigure 1 Detection of DNA by 1% agarose gel electrophoresis

M表示Marker DL2000，1～14為14個(gè)樣本個(gè)體.M means Marker DL2000；1～14 are 14 sample individuals.圖2 位點(diǎn)KY284848 在黑果枸杞的PCR產(chǎn)物檢測結(jié)果Figure 2 The detection result of PCR product of site KY284848 in Lycium ruthenicum

表3 黑果枸杞23個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)多態(tài)信息

2.4 微衛(wèi)星標(biāo)記與花青素、多酚、黃酮的關(guān)聯(lián)分析

運(yùn)用SPSS軟件對各位點(diǎn)不同基因型與所對應(yīng)的花青素、多酚和黃酮含量的差異情況進(jìn)行方差分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記與黑果枸杞的經(jīng)濟(jì)性狀有關(guān)聯(lián).

由表4可知，位點(diǎn)c88061_g1_i1在含量高的水平上，不同基因型之間花青素含量呈顯著差異(P<0.05).在4種基因型中，CD顯著高于AC(P<0.05)，AB和CC無顯著差異(P>0.05)，在含量中的水平上，AC黃酮含量顯著高于AB(P<0.05).

由表5可知，位點(diǎn)c60533_g1_i1在含量低的水平上，不同基因型之間多酚含量呈顯著差異(P<0.05).在3種基因型中，AA顯著高于AB和BC(P<0.05)，AB和BC無顯著差異(P>0.05).

由表6可知，位點(diǎn)c58466_g1_i1在含量中的水平上，不同基因型之間花青素呈顯著差異(P<0.05)，AC顯著高于AD(P<0.05),AB與AC和AD無顯著差異(P>0.05).

表4 位點(diǎn)c88061_g1_i1不同基因型間黑果枸杞性狀差異

表5 位點(diǎn)c60533_g1_i1不同基因型間黑果枸杞性狀差異

表6 位點(diǎn)c58466_g1_i1不同基因型間黑果枸杞性狀差異

由表7可知，位點(diǎn)KY284852在含量低的水平上，不同基因型之間花青素和多酚含量之間呈顯著差異(P<0.05)，BD花青素、多酚含量顯著高于AD(P<0.05)，BD、CD和BC無顯著差異(P>0.05).

由表8可知，位點(diǎn)KY284857在含量中的水平上，不同基因型之間多酚含量呈顯著差異(P<0.05).BD顯著高BC(P<0.05)， BD和BB之間無顯著差異(P>0.05).

表7 位點(diǎn)KY284852不同基因型間黑果枸杞性狀差異

表8 位點(diǎn)KY284857不同基因型間黑果枸杞性狀差異

3 討論

3.1 黑果枸杞遺傳多樣性分析

生物群體遺傳變異是生物進(jìn)化的原始材料，遺傳多樣性則是物種生存、發(fā)展和進(jìn)化的基礎(chǔ).按照Botstein[31]對于遺傳多樣性的判別標(biāo)準(zhǔn)，選用的23個(gè)微衛(wèi)星座位中，18個(gè)位點(diǎn)的PIC>0.5為高度多態(tài)性座位，5個(gè)位點(diǎn)0.25

3.2 微衛(wèi)星標(biāo)記與花青素、多酚和黃酮的關(guān)聯(lián)分析

QTL連鎖分析是對不同基因型個(gè)體的數(shù)量性狀表型應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)的方法，進(jìn)行顯著性檢驗(yàn),如果差異顯著說明微衛(wèi)星標(biāo)記與數(shù)量性狀存在關(guān)聯(lián)[37].利用SSR分子標(biāo)記方法進(jìn)行的關(guān)聯(lián)分析不需要建立遺傳圖譜，可以直接對位點(diǎn)基因型與所對應(yīng)的性狀之間的差異進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析.SSR與經(jīng)濟(jì)性狀的關(guān)聯(lián)分析在水稻[38]、大麥[39]、大豆[40]、油菜[41]等作物中應(yīng)用較多，可見關(guān)聯(lián)分析在發(fā)掘位點(diǎn)、尋找優(yōu)良變異類型方面有明顯的優(yōu)勢.

但關(guān)聯(lián)分析在黑果枸杞中的研究鮮見，究其原因有：對枸杞群體結(jié)構(gòu)、表型及基因型鑒定的分析不足，影響了人們對相關(guān)基因的標(biāo)記開發(fā)；表型差異與環(huán)境的相互作用，使得人們對QTL功能的認(rèn)知不足.趙建華等[42]對枸杞部分農(nóng)藝性狀形成的分子機(jī)制進(jìn)行了研究，克隆到LbA1基因,在分析中發(fā)現(xiàn)LbA1基因表達(dá)量與枸杞果實(shí)果糖含量達(dá)到極顯著相關(guān).朱雪冰等[43]克隆了黑果枸杞中調(diào)節(jié)花青素合成代謝的MYB基因.本試驗(yàn)用SSR分子標(biāo)記方法對花青素、多酚和黃酮與位點(diǎn)基因型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析.結(jié)果發(fā)現(xiàn)：位點(diǎn)c88061_g1_i1與花青素和黃酮相關(guān)；c60533_g1_i1、KY284857與多酚相關(guān)；c58466_g1_i1與花青素相關(guān)；位點(diǎn)KY284852與花青素和多酚相關(guān)，存在一因多效和多因一效現(xiàn)象，說明這些標(biāo)記位點(diǎn)可能是控制花青素、多酚、黃酮的主效基因,或與控制數(shù)量性狀的主效基因連鎖.在生產(chǎn)實(shí)踐中，選擇具有和優(yōu)良性狀相關(guān)的標(biāo)記進(jìn)行個(gè)體選育，可最大限度發(fā)揮黑果枸杞的某些經(jīng)濟(jì)性能，提高其經(jīng)濟(jì)價(jià)值.試驗(yàn)中檢測到與數(shù)量性狀相關(guān)的位點(diǎn)較少，可能是因?yàn)樗貌牧线z傳豐富度不夠、選用的微衛(wèi)星標(biāo)記數(shù)量有限.

通過數(shù)量性狀與分子標(biāo)記相關(guān)性分析，可找到與黑果枸杞經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記，從而選擇和定位數(shù)量性狀基因，以此用于分子標(biāo)記輔助選擇育種，可以提高黑果枸杞優(yōu)選效率.上述所說的微衛(wèi)星標(biāo)記與黑果枸杞花青素、多酚、黃酮的關(guān)聯(lián)分析只是初步研究，還需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)行進(jìn)一步的研究，但本試驗(yàn)研究結(jié)果從分子水平上為黑果枸杞的早期選育、高效育種和遺傳改良提供了理論依據(jù).

4 結(jié)論

1) 試驗(yàn)所選用的23個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)中，平均多態(tài)信息含量(PIC)為0.59，平均觀測等位基因數(shù)為3.87，期望雜合度在0.49～0.75之間，說明該群體遺傳多樣性處于較高水平，并且有較強(qiáng)的遺傳潛力.

2) 關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)23個(gè)位點(diǎn)中，有5個(gè)與黑果枸杞中花青素、多酚和黃酮有關(guān)聯(lián)，所篩選出的微衛(wèi)星位點(diǎn)，可以為黑果枸杞早期的良種選育提供依據(jù).