高 俊，程 卉，李慶林

(1.安徽中醫(yī)藥大學藥學院，安徽 合肥 230012；2.安徽中醫(yī)藥大學新安醫(yī)學教育部重點實驗室，安徽 合肥 230038)

細胞遷移也稱為細胞爬行，是正常細胞的基本功能之一，表現(xiàn)為細胞頭部偽足延伸、建立新的黏附、細胞體尾部收縮的交替進行，是機體正常生長發(fā)育的生理過程。細胞遷移涉及血管生成、癌癥轉移、炎癥反應、動脈粥樣硬化等過程。

腫瘤血管生成是從已存在的血管床中形成新生血管，是一個受眾多生長因子調節(jié)的復雜的病理生理過程，多種細胞因子和細胞基質參與腫瘤的生長、轉移、復發(fā)。其過程包括：腫瘤細胞與正常血管內皮細胞相互作用；腫瘤細胞與細胞外基質相互作用；相關細胞的參與及大量白細胞因子的調節(jié)，使得新生血管得以形成。抗腫瘤血管生成的主要機制：抑制促血管生成因子與配體的表達和結合及相應的信號傳遞途徑，抑制血管內皮細胞的增殖、遷移，抑制基底膜的降解等。

藤黃是藤黃科植物藤黃的干燥樹脂，具有攻毒蝕瘡、破血散結等功效?，F(xiàn)代研究表明，新藤黃酸(gambogenic acid，GNA)為藤黃中的活性成分之一，具有良好的抗腫瘤活性。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，GNA對多種腫瘤細胞如人乳腺癌MCF-7和人肝癌BEL-7402細胞的增殖均有抑制作用。近期實驗研究表明，GNA對腫瘤的血管生成、侵襲轉移也具有一定的抑制作用。本研究選擇人肺腺癌A549細胞和人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial, HUVECs)建立體外非直接接觸式共培養(yǎng)體系，觀察GNA對HUVECs遷移能力的影響，探討GNA抗人肺腺癌A549細胞侵襲轉移的作用及GNA影響血管生成的信號轉導機制，為GNA的開發(fā)和應用提供理論依據(jù)。

1 試劑與材料

1.1 細胞株 人肺腺癌細胞株A549、HUVECs購于中國科學院上海細胞庫。

1.2 試劑 GNA(分子量為630.8，純度>98.0%，貨號 B50231)：上海源葉生物有限公司提供；胎牛血清(貨號 16140071)、DMEM高糖培養(yǎng)基(貨號 12100046)：美國GIBCO公司；Matrigel膠(貨號 356234)：美國BD公司；Boyden小室：美國康寧公司；聚碳酸酯膜孔徑8.0 μm，NO檢測試劑盒(貨號 A012)：南京建成生物工程研究所；LY294002、L-NAME(貨號 S0006)：江蘇碧云天生物技術研究所；β-actin、eNOS抗體：美國Santa Cruz Biotechnology；NS-siRNA、第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten, PTEN) siRNA(序列：5′-GGCUAAGUGAAGAUGACAATT-3′；5′-UUGUCAUCUUCACUUAGCCTT-3′)：上海吉瑪生物工程公司；Lipofectamine 2000(貨號 11668-019)：美國Invitrogen公司。

1.3 儀器 細胞培養(yǎng)箱、-80 ℃冰箱：日本Sanyo公司；倒置顯微鏡：日本Olympus公司；超凈工作臺：浙江蘇凈凈化設備有限公司；滅菌鍋：日本Hirayama公司；高速冷凍離心機：德國Eppendorf；倒置熒光顯微鏡(DMI-6000B)：德國徠卡公司；垂直電泳儀：上海天能科技有限公司。

2 方法

2.1 倒置顯微鏡下觀察GNA對HUVECs形態(tài)的影響 取對數(shù)生長期的HUVECs，消化和收集，將細胞密度調整為6×10mL，接種于25 mL培養(yǎng)瓶。37 ℃、5% CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，更換含有GNA的條件培養(yǎng)液，倒置顯微鏡下觀察細胞并拍照。

2.2 改良的Boyden chamber檢測GNA對HUVECs轉移能力的影響 將Matrigel膠與預冷的無血清DMEM培養(yǎng)基按照1∶3的比例稀釋加至Boyden小室中，每孔容積為50 μL，冰上操作。條件培養(yǎng)箱孵育5 h后，向上室加入200 μL的HUVECs懸液，下室中加入500 μL的A549細胞懸液，置于37 ℃，5% CO培養(yǎng)6 h后加藥，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后取出小室，清洗上室殘留細胞，4%多聚甲醛固定30 min后用0.1%結晶紫染液染色25 min，PBS洗滌3次，于倒置熒光顯微鏡下計數(shù)并拍照。

2.3 細胞劃痕實驗 于6孔板以每孔約2×10接種HUVECs，待細胞長滿6孔板，用無菌200 μL加樣槍頭垂直于6孔板均勻劃痕，用PBS輕洗細胞2～3遍后進行0 h取樣，此為空白對照組,加入含不同濃度GNA的條件培養(yǎng)基，24 h后于倒置顯微鏡下取樣。

2.4 NO水平的檢測 采用硝酸還原酶法檢測NO水平。不同藥物組作用HUVECs 24 h后吸棄細胞培養(yǎng)液，收集細胞后超聲裂解，2 000 r/min離心，收集上清，按照說明書的步驟操作，采用多功能酶標儀于550 nm處檢測各組的吸光度。根據(jù)說明書提供的計算公式，計算細胞中NO的水平。

2.5 Western blot法檢測GNA及LY29400預處理對HUVECs內磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase, PI3K)、p-PI3K、蛋白激酶B(protein kinase B, AKT)、p-AKT表達水平的影響 各組HUVECs分別處理24 h后，無菌細胞刮刮取細胞后，收集，離心提取總蛋白，進行BCA蛋白定量。每組樣品總蛋白25 μg，經(jīng)12% SDS-PAGE電泳，分離蛋白。轉膜后5%脫脂奶粉常溫封閉3 h，一抗(稀釋比例1∶1 000)4 ℃孵育過夜。TBST漂洗3次，每次10 min，二抗常溫孵育2 h，再用TBST漂洗3次，每次10 min，加入ECL發(fā)光底物，曝光，采用平均灰度值比較各組蛋白的表達水平。

2.6 PTEN-siRNA轉染細胞，瓊脂糖凝膠電泳檢測血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)表達水平 取對數(shù)生長期的A549細胞1×10/mL接種至6孔板，每孔加入1.8 mL無抗生素的培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO培養(yǎng)箱孵育過夜。棄去6孔板中舊培養(yǎng)基，PBS洗2次，各孔加入不含抗生素培養(yǎng)液1.8 mL，按說明書操作配制好轉染試劑并加入，輕輕混勻后培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h，倒置熒光顯微鏡下拍照，觀察轉染效率。提取總RNA，逆轉錄PCR，分別將VEGF、β-actin擴增產(chǎn)物(見表1)各5 μL與1 μL 6×SDS上樣緩沖液混勻后，用移液器加樣，電壓90 V，電泳約40 min，取膠放置在凝膠成像系統(tǒng)上，紫外光下拍照，采用Biocapt MV軟件測定吸光度(A)，采用Image J分析各組條帶光密度值，并采用Graphpad 5.0作圖。

表1 VEGF、β-actin基因引物表

3 結果

3.1 條件培養(yǎng)基的制備 將A549細胞2×10接種于75 mL培養(yǎng)瓶，12 h后取培養(yǎng)液，離心后取上清，再加入10%胎牛血清，-20 ℃凍存?zhèn)溆?。使用前加入不同濃度的GNA，此為HUVECs的條件培養(yǎng)基。

3.2 倒置顯微鏡下觀察GNA對HUVECs形態(tài)的影響 空白對照組中細胞貼壁牢固，折光性強；1 μmol/L GNA組細胞核固縮變圓，體積變小，貼壁細胞有少量出現(xiàn)漂浮現(xiàn)象；2 μmol/L GNA組少數(shù)細胞體積變大，折光性明顯變弱，細胞呈現(xiàn)壞死狀態(tài)；4 μmol/L GNA組大量細胞固縮變圓，漂浮于培養(yǎng)液中。見圖1。

注：A.空白對照組；B.1.0 μmol/L GNA組；C.2.0 μmol/L GNA組；D.4.0 μmol/L GNA組

3.3 Boyden小室實驗觀察GNA對HUVECs遷移的影響 倒置熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，接種至Boyden小室上室中的細胞，5～6 h后開始貼附于凝固的Matrigel膠上，24 h后倒置熒光顯微鏡下觀察，與空白對照組相比，2 μmol/L GNA組和50 μmol/L LY294002組可以降低細胞遷移數(shù)目(

P

<0.05)；與空白對照組及2 μmol/L GNA組相比，2 μmol/L GNA+50 μmol/L LY294002組能夠顯著降低細胞遷移數(shù)目(

P

<0.05)。見圖2、表2。

注：A.空白對照組；B.2 μmol/L GNA組；C.50 μmol/L LY294002組；D.2 μmol/L GNA+50 μmol/L LY294002組

表2 Boyden小室實驗觀察GNA對HUVECs遷移的影響

3.4 細胞劃痕實驗觀察GNA對HUVECs劃痕愈合的影響 實驗24 h后，GNA各處理組較空白對照組劃痕愈合變慢(

P

<0.05)。結果表明，GNA可抑制HUVECs的劃痕愈合，并且呈一定的劑量依賴性，見圖3、表3。3.5 GNA對不同抑制劑處理的HUVECs中NO水平的影響 LY294002及L-NAME抑制劑作用HUVECs后，采用硝酸還原酶法測定NO含量，判斷GNA對內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)活力的影響。實驗結果顯示，2 μmol/L GNA組能夠顯著降低NO水平(

P

<0.05)，與PI3K抑制劑LY294002組效果接近，且2 μmol/L GNA+50 μmol/L LY294002組NO水平更低(

P

<0.05)。見表4。與空白對照組比較，GNA組、L-NAME組NO水平顯著降低(

P

<0.05)，且GNA+L-NAME組NO水平更低(

P

<0.05)。見表5。

圖3 細胞劃痕實驗觀察GNA對HUVECs劃痕愈合的影響(結晶紫染色，10×20倍)

表3 細胞劃痕實驗觀察GNA對HUVECs劃痕愈合的影響

表4 GNA及PI3K抑制劑對細胞培養(yǎng)上清中NO水平的影響

表5 GNA及L-NAME對HUVECs上清中NO水平的影響

3.6 Western blot實驗檢測結果

3.6.1 Western blot法檢測GNA對HUVECs內PI3K、p-PI3K、AKT和p-AKT蛋白表達水平的影響 Western blot實驗結果顯示，GNA作用HUVECs后，p-PI3K和p-AKT蛋白表達水平隨著藥物濃度的增加呈劑量依賴性下降(

P

<0.05)；而PI3K和AKT蛋白表達水平基本不變。見圖4、表6。3.6.2 GNA對LY294002預處理HUVECs相關蛋白表達水平的影響 為了進一步研究GNA對HUVECs遷移的信號轉導通路，本研究檢測PI3K/AKT的上游負性調控蛋白PTEN的表達水平，見圖5。同時，采用PI3K特異性抑制劑LY294002和不同濃度的GNA作用HUVECs 24 h后，檢測eNOS的含量變化，見圖6。結果表明，細胞內PTEN蛋白的表達水平隨著GNA濃度的增加而呈濃度依賴性增加(

P

<0.05)，見表7。2 μmol/L GNA作用HUVEC 24 h后，eNOS表達水平下降(

P

<0.05)，而PI3K抑制劑LY294002與GNA聯(lián)合使用具有協(xié)同作用，促進eNOS蛋白表達水平進一步降低(

P

<0.05)，見表8。

注：A.空白對照組；B. 1μmol/L GNA組；C. 2 μmol/L GNA組；D. 4 μmol/L GNA組

表6 GNA對HUVECs內p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT蛋白相對表達水平的影響

注：A.空白對照組；B. 1 μmol/L GNA組；C. 2 μmol/L GNA組；D. 4 μmol/L GNA組

表7 GNA對HUVECs血管生成相關蛋白PTEN相對表達水平的影響

注：A.空白對照組；B. 2 μmol/L GNA組；C. 50 μmol/L LY294002組；D. 2 μmol/L GNA+50 μmol/L LY294002組

表8 GNA對HUVECs血管生成相關蛋白eNOS相對表達水平的影響

3.7 GNA對轉染PTEN-siRNA的HUVEC中VEGF mRNA表達水平的影響 電泳圖和Image J軟件的分析結果顯示,與空白對照組比較，GNA組能下調VEGF mRNA的表達水平(

P

<0.05)，而與GNA組比較，PTEN-siRNA組及PTEN-siRNA+GNA組VEGF mRNA的表達水平上調(

P

<0.05)。見圖7、表9。

注：A.maker；B.空白對照組；C.GNA組；D.PTEN-siRNA組；E.PTEN-siRNA+GNA組

表9 GNA對轉染PTEN-siRNA的HUVEC中VEGF mRNA相對表達水平的影響

4 討論

PI3K家族是細胞內重要的信號傳導分子，參與調控多種信號通路。PI3K/AKT信號通路在人類腫瘤譜中廣泛失調，IA型PI3K和其下游分子AKT所組成的信號通路不僅調節(jié)腫瘤細胞的增殖和存活，與腫瘤的血管新生過程、侵襲轉移行為也密切相關。PI3K/AKT信號通路受多種因子的調節(jié)，主要為負調節(jié)分子，如PTEN等抑癌蛋白。PTEN所編碼的蛋白能使PIP3去磷酸化，阻斷PI3K/AKT信號通路，從而促進細胞凋亡、抑制細胞增殖、抑制腫瘤血管新生和腫瘤遷移等作用。Jiang等研究表明，PI3K/AKT信號通路參與了血管生成，PETN可抑制這種效應。而PI3K/AKT通路與VEGF之間的關聯(lián)在腫瘤血管生成中發(fā)揮了重要作用。研究表明，VEGF在多種腫瘤中高度表達，其通過誘導內皮細胞增殖、遷移，促進血管外基質降解等途徑促進腫瘤血管生成。VEGF可提高血管通透性，促進血漿蛋白滲漏形成血管外纖維蛋白基質，為內皮細胞遷移提供網(wǎng)架；在多種細胞因子和蛋白酶協(xié)同作用下，使遷移出的內皮細胞延伸形成新生血管；經(jīng)活化的蛋白水解酶降解腫瘤邊緣細胞外基質，促使腫瘤細胞外滲而形成轉移。

PI3K/AKT不僅是機體內重要的信號調控途徑之一，并且是調控eNOS的關鍵信號途徑之一。目前研究表明，第一個明確由AKT作用的促進血管形成的物質是eNOS。其表達與腫瘤侵襲和遷移、腫瘤血管分化和形成關系密切。AKT調節(jié)eNOS活性，與血管生成關系密切，在VEGF的作用下，活化的AKT和eNOS結合，eNOS被磷酸化絲氨酸激活，產(chǎn)生NO，從而引起血管舒張、血管重塑和血管生成。Ma等研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT的負調節(jié)分子PTEN可通過PI3K/AKT/VEGF/eNOS信號通路抑制腫瘤血管生成。

本課題組前期研究結果表明，GNA能夠下調HUVECs的p-PI3K，p-AKT蛋白的表達水平且呈劑量依賴性，與對照組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(

P

<0.05)。同時，采用PI3K特異性抑制劑LY294002處理細胞后，Western blot法檢測表明VEGF的蛋白表達水平顯著下調，提示GNA抑制血管生成與PI3K/AKT信號通路有關，且下游通路中VEGF起著非常關鍵的作用。本實驗在此基礎上，通過抑制劑LY294002預處理HUVECs，Western blot法檢測HUVECs內PTEN、eNOS蛋白水平的表達變化，結果顯示，PTEN蛋白表達水平隨著GNA的濃度增加而增加，eNOS蛋白表達水平下降，且GNA 2 μmol/L與LY294002聯(lián)用后作用更強。用Boyden chamber小室分析GNA以及LY294002對HUVEC轉移能力的影響，發(fā)現(xiàn)GNA以及LY294002都能抑制細胞轉移。細胞劃痕愈合實驗結果表明，不同濃度GNA均可抑制血管內皮細胞遷移，且呈劑量依賴性。采用LY294002和eNOS特異性抑制劑L-NAME處理細胞，硝酸還原酶法檢測eNOS的表達水平，結果表明,2 μmol/L GNA和LY294002聯(lián)用以及2 μmol/L GNA和L-NAME聯(lián)用均能顯著降低eNOS的含量；RT-PCR結果表明，沉默PTEN基因會促進VEGF表達水平的上調。

綜上所述，GNA可能通過PTEN-PI3K/AKT/VEGF/eNOS通路影響HUVECs的遷移和血管形成。