季慕寅， 李 敏， 張海燕， 張 爽， 馬 勛， 張 煒*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210095； 2.蕪湖職業(yè)技術(shù)學(xué)院，安徽 蕪湖 241003；3.石河子大學(xué) 動物科技學(xué)院，新疆 石河子 832003)

產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌O157:H7分離于1982年，現(xiàn)已成為一種重要的食物和水傳播病原體，可引起人類腹瀉、出血性結(jié)腸炎和溶血性尿毒癥綜合征(HUS)。大腸桿菌O157:H7是一種腸出血性菌株，可感染消化道，引起出血性腹瀉引起腹部絞痛。大腸桿菌O157:H7可通過食用受污染的牛奶和食物后，經(jīng)糞口途徑傳播。腸出血性大腸桿菌O157:H7會誘發(fā)因產(chǎn)生志賀毒素而引發(fā)的疾病，導(dǎo)致一系列胃腸道疾病，從水樣腹瀉到出血性結(jié)腸炎。流行病學(xué)調(diào)查在追蹤家養(yǎng)動物，特別是圈養(yǎng)牛的志賀毒素腸出血性腹瀉暴發(fā)后，已確定牛是大腸桿菌O157:H7的主要宿主。農(nóng)場上的反芻動物是大腸桿菌O157:H7的天然宿主。人獸共患病大腸桿菌O157:H7的傳播發(fā)生在食用未經(jīng)巴氏消毒的乳制品或未煮熟的肉類，或接觸含有志賀毒素腸出血性大腸桿菌的污染物之后。大腸桿菌O157具有比共生大腸桿菌菌株更頑強(qiáng)的生存特性，使這種食源性病原體能夠在人類食物鏈中經(jīng)常遇到的各種惡劣條件下生存。因此，對于食源性病原菌的控制除傳統(tǒng)的巴氏消毒和使用抗生素之外，必須開發(fā)綠色安全的替代品，其中之一就是噬菌體。

噬菌體是能夠感染細(xì)菌、放線菌或螺旋體等微生物的病毒的總稱。噬菌體在自然界分布廣泛且含量高。噬菌體分為烈性噬菌體和溫和性噬菌體，其中烈性噬菌體因其安全性被重視。最近的研究已經(jīng)證明了噬菌體在控制食品和動物生產(chǎn)中的人畜共患病原體方面的有效性和安全性，噬菌體可作為食品生產(chǎn)和生物防治食源性疾病中較好的選擇。噬菌體作為一種生物抗菌劑具有特異性強(qiáng)、抗細(xì)菌耐藥性和開發(fā)時間短等優(yōu)點。目前已有噬菌體用于食品生物防控的報道，如Listex_P100已經(jīng)作為世界上第一個通過美國食品藥品管理局(FDA)認(rèn)證的噬菌體食品添加劑，用于抑制食品中的李斯特菌。

本研究以產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌O157:H7(ATCC 43895)為宿主菌從污水中分離純化得到3株噬菌體，通過實驗研究其宿主譜，并評估易被O157:H7大腸桿菌污染的食品中利用噬菌體控制O157:H7大腸桿菌的潛力和功效，為制備噬菌體抗菌劑抑制產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌O157:H7污染提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

ABI 7500實時熒光定量儀(美國Applied Biosystems 公司)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；Allgegra X-15R低溫冷凍離心機(jī)(美國Beckman Coulter 公司)；臺式離心機(jī)(德國Eppendorf公司)；Mastercycler ep gradient PCR儀(德國Eppendorf 公司)；Milli-Q Synthesis超純水機(jī) (德國millipore 公司)；Sub cell GT核酸電泳儀(加拿大Bio-Rad公司)；NanoDrop 2000細(xì)菌基因組DNA濃度檢測儀 (美國Fisher 公司)等。

O157:H7大腸桿菌ATCC 43895、ATCC 43889和NCTC 12900為標(biāo)準(zhǔn)菌株。O157:H7-EC204和EC1251為實驗室保存菌種。污水樣品來自于南京市某污水處理廠。

Luria-Bertani(LB)瓊脂培養(yǎng)基；瓊脂(青島高科園海博生物技術(shù)有限公司)；SM液：0.22 μm微孔濾膜德國Millipore公司；雙層瓊脂培養(yǎng)基：下層培養(yǎng)基為固體LB培養(yǎng)基、上層培養(yǎng)基為半固體LB培養(yǎng)基和0.5%瓊脂粉。

1.2 實驗方法

1.2.1 宿主菌株的復(fù)蘇與培養(yǎng) 從凍存液中接一環(huán)菌液，劃線于LB固體平板，置于37 ℃ CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。次日挑取O157:H7大腸桿菌ATCC 43895單菌落接種于5 mL新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，置于160 r/min、37 ℃搖床中，振蕩培養(yǎng)8 h。然后將培養(yǎng)液10倍梯度稀釋，用涂平板法進(jìn)行計數(shù)，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 噬菌體的分離純化及效價測定 參照Adams的方法，使用雙層平板法進(jìn)行噬菌體的分離和純化。將來自江蘇省南京市某污水處理廠的污水靜置2 h，使用濾紙過濾后，5 000 r/min、4 ℃離心5 min，取上清并用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌。從中吸取500 μL濾液與2.5 mL處于對數(shù)期的大腸桿菌ATCC 43895及5 mL LB培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)。混合培養(yǎng)液經(jīng)8 000 r/min、4 ℃離心10 min，上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后，即得到噬菌體原液。噬菌體原液倍比稀釋后，采用雙層平板的方法進(jìn)行噬菌體的純化，具體操作如下：取100 μL合適梯度噬菌體液、100 μL宿主菌和4 mL融化后冷卻至50 ℃的半固體培養(yǎng)基混合，倒于LB下層固體平板上，待凝固后于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)約8 h，使用10 μL槍頭挑取大小一致的透亮的噬菌斑于1 mL SM液中，加入100 μL生長至對數(shù)期的宿主菌，37 ℃條件下培養(yǎng)約12 h，8 000 r/min、4 ℃離心10 min，得上清液。經(jīng)反復(fù)純化3～5次直至噬菌斑大小基本一致即得到純化的噬菌體。噬菌體效價的測定：將純化后的噬菌體原液進(jìn)行10倍倍比稀釋，取100 μL稀釋液與100 μL宿主菌混合，加入4 mL 50 ℃的半固體培養(yǎng)基，倒雙層平板，37 ℃培養(yǎng)8 h，重復(fù)3次。

1.2.3 噬菌體宿主譜測定 采用點滴法進(jìn)行宿主譜的測定。首先取100 μL對數(shù)期的宿主菌加入到50 ℃的半固體LB培養(yǎng)基中，混勻后倒入預(yù)先制備好的LB固體平板上，待上層半固體凝固后，取5 μL效價為10PFU/mL的噬菌體滴在上層平板表面，待噬菌體液滴干燥后，置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)8 h，觀察裂解情況并記錄。

1.2.4 噬菌體在牛奶中的應(yīng)用 參照Huang等報道的的方法并進(jìn)行改進(jìn)，首先按1∶1∶1混合3種噬菌體，制成噬菌體雞尾酒制劑。在接種10 μL(10CFU/mL)O157:H7大腸桿菌ATCC 43895的新鮮牛奶中加入100 μL(總效價為10CFU/mL)的相應(yīng)噬菌體雞尾酒制劑(MOI=10)，在對照組牛奶中加入等體積的PBS，將樣品在4 ℃或25 ℃溫育。在溫育0、1、3、6、9 和12 h后，取出等量樣品通過平板稀釋法進(jìn)行活菌計數(shù)(CFU/mL)。實驗重復(fù)2 次，每次設(shè)2個生物學(xué)重復(fù)。運用Graphpad Prism 5軟件進(jìn)行分析和繪圖，實驗數(shù)據(jù)采用ANOVA進(jìn)行鄧肯氏差異分析方法分析(

P

<0.05，差異顯著)。

2 結(jié)果與分析

2.1 噬菌體的分離純化及效價測定

通過雙層平板法經(jīng)過5次純化后，3株噬菌體所形成的噬菌斑形態(tài)和大小保持均勻一致，呈圓形透明狀態(tài)，直徑均約為(0.5±0.2) mm(圖1)，其原液效價高達(dá)10PFU/mL。

圖1 3株噬菌體的噬菌斑

2.2 噬菌體宿主譜測定

采用點樣法測定噬菌體的宿主范圍，由表1可見，噬菌體可以裂解多種產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌O157:H7菌株。說明噬菌體宿主譜較為廣泛。

表1 3株噬菌體的宿主范圍

2.3 噬菌體在牛奶中的抑菌效果檢測

由圖2可知，25 ℃時對照組從初始菌量5.04 (lg(CFU/mL))，經(jīng)過10 h增加到8.28 (lg(CFU/mL))，而實驗組在按照MOI=10加入噬菌體的情況下，菌量從2 h開始顯著降低，至最終10 h，相比于對照組MOI=10時下降4.30 (lg(CFU/mL))(

P

<0.001)，抑菌效果非常明顯。

圖2 噬菌體在牛奶中的抑菌效果(MOI=10)

3 結(jié)論與討論

腸出血性大腸桿菌O157:H7是世界范圍內(nèi)引起人類嚴(yán)重疾病的主要食源性病原體。疾病控制和預(yù)防中心(CDC)估計，大腸桿菌O157:H7感染每年在美國造成73 000人患病，2 200人住院，60人死亡。CDC的疫情監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示，大腸桿菌O157:H7的感染在1999年達(dá)到高峰后開始下降。然而，大規(guī)模疫情和零星病例繼續(xù)發(fā)生，需要重點關(guān)注。對14個世界衛(wèi)生組織次區(qū)域中10個的數(shù)據(jù)庫和研究的審查表明，全球大腸桿菌的發(fā)病率為每年280萬例。在過去的二十年中，大腸桿菌O157:H7誘導(dǎo)的溶血性尿毒綜合征已成為兒童急性腎功能衰竭的重要病因。然而，對于O157:H7大腸桿菌感染并沒有特定的治療方法，使用抗生素可能是禁忌。因此，治療主要是支持性的，以限制癥狀持續(xù)時間和預(yù)防全身并發(fā)癥。鑒于這種情況，采用新的生態(tài)友好型策略，如噬菌體，用作抗O157:H7大腸桿菌感染的生物防治劑隨即被重視。近年來，噬菌體由于具有綠色安全，廣泛分布性，具有靶標(biāo)特異性以及研究成本低等優(yōu)勢而重新受到關(guān)注。

本研究從污水中分離出3株可裂解腸出血性大腸桿菌O157:H7的烈性噬菌體。宿主譜分析表明這三株噬菌體的宿主譜不同。但這3株噬菌體的雞尾酒制劑可覆蓋本研究的5株腸出血性大腸桿菌O157:H7，具有應(yīng)用于防控大腸桿菌O157:H7的潛力。對噬菌體混合制劑的進(jìn)一步抑菌試驗表明，在25 ℃時，對照組從初始菌量5.04 (lg(CFU/mL))，經(jīng)過10 h增加到8.28 (lg(CFU/mL))，而實驗組在MOI=10加入噬菌體的情況下，菌量從2 h開始顯著降低，至最終10 h，相比于對照組MOI=10時下降4.30(lg(CFU/mL))，抑菌效果非常明顯。Bao等在25 ℃時將噬菌vB_SenMPA13076按照MOI=10 000加入沙門氏菌污染的牛奶中時，作用5 h后菌量降低了約2個數(shù)量級。聶若男等在25 ℃時將噬菌體T139應(yīng)用于牛奶中時，噬菌體以MOI=10或MOI=100加入時，沙門氏菌菌量從6 h開始顯著降低，至最終12 h，沙門氏菌菌量分別下降了4.32 (lg(CFU/mL))和4.27 (lg(CFU/mL))，這與本研究的效果相當(dāng)。

綜上所述，本研究為達(dá)到更好的抑菌效果，在未來的研究中會不斷改善噬菌體雞尾酒制劑中噬菌體的種類和配比，以加強(qiáng)抑菌效果。同時適當(dāng)延長噬菌體的作用時間，以研究噬菌體作為抗菌劑的保質(zhì)期。該噬菌體雞尾酒制劑作為一種新型綠色的抗菌劑，在低MOI即MOI=10時對O157:H7大腸桿菌有較好的抑制作用，因此可以用來控制牛奶中O157：H7大腸桿菌的污染，為該噬菌體雞尾酒制劑作為抗菌劑的應(yīng)用提供了實驗依據(jù)。