梁曉 陳青 伍春玲 方永軍

摘? 要：為了篩選穩(wěn)定內(nèi)參基因分析六點(diǎn)始葉螨超氧化物歧化酶基因EsSOD的表達(dá)量，本研究采用geNorm、Bestkeeper、Normfinder和RefFinder軟件分析6個(gè)候選內(nèi)參基因actin、gapdh、rpl13、α-tub、β-tub和18sRNA在六點(diǎn)始葉螨幼螨、前若螨、后若螨和雌成螨中的表達(dá)穩(wěn)定性。結(jié)果表明，根據(jù)geNorm軟件分析得出6個(gè)候選內(nèi)參引物的穩(wěn)定性從大到小的排序?yàn)椋篴ctin>β-tub>rpl13>α-tub>gapdh>18sRNA;根據(jù)NormFinder軟件分析得出的穩(wěn)定性從大到小的排序?yàn)椋簉pl13>β-tub>actin>α-tub>18sRNA>gapdh;根據(jù)BestKeeper軟件分析得出的穩(wěn)定性從大到小的排序?yàn)椋害?tub>rpl13> actin>gapdh>α-tub>18sRNA;最終根據(jù)RefFinder軟件的綜合分析結(jié)果，actin和β-tub是穩(wěn)定性最佳的2個(gè)內(nèi)參引物。分別以actin和β-tub為內(nèi)參進(jìn)行EsSOD基因表達(dá)量的RT-qPCR分析，結(jié)果表明，與取食感螨橡膠樹種質(zhì)‘IAN2904后EsSOD表達(dá)量相比，不同齡期六點(diǎn)始葉螨取食抗螨橡膠樹種質(zhì)‘IRCI12后EsSOD表達(dá)量均降低。本研究獲得了可用于六點(diǎn)始葉螨EsSOD表達(dá)量分析的穩(wěn)定內(nèi)參引物，為橡膠樹種質(zhì)抗螨性分子機(jī)理研究奠定了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：六點(diǎn)始葉螨;內(nèi)參基因;超氧化物歧化酶基因EsSOD;基因表達(dá)

中圖分類號(hào)：S433.5? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Abstract： In order to screen stable reference genes in analyzing the expression level of Eotetranychus sexmaculatus superoxide dismutase gene EsSOD， six candidate genes， actin， gapdh， rpl13， α-tub， β-tub and 18SRNA， were analyzed for their expression stability in different life stages （i.e.， larva， protonymph， deutonymph and female adults） of E. sexmaculatus by using geNorm，Bestkeeper， Normfinder and RefFinder analysis methods. The results showed that according to the geNorm analysis， the stability ranking of the six candidate genes was listed as： actin > β-ub > rpl13 > α-tub > gapdh > 18sRNA， according to the NormFinder analysis， the stability ranking of the six candidate genes was listed as： rpl13 > β-tub > actin > α-tub > 18sRNA > gapdh， according to the BestKeeper analysis， the stability ranking of the six candidate genes was listed as： rpl13 > β-tub > actin > α-tub > 18sRNA > gapdh， the order of the stability of six candidate primers was analyzed by BestKeeper software. The qualitative order from large to small was： β-tub > rpl13 > actin > gapdh > α-tub > 18sRNA. Finally， according to the comprehensive analysis results of Reffinder software， actin and β-tub were the best two reference genes， and were subjected to the subsequent RT-qPCR analysis of EsSOD transcription. The results showed that compared with those feeding on mite-susceptible clutivars IAN2904， the expression of EsSOD in mite feeding on mite-resistant clutivars IRCI12 was decreased. Stable reference genes in analyzing the transcription of EsSOD might provide theoretical basis for the study of molecular mechanism of mite resistance in rubber tree.

Keywords： Eotetranychus sexmaculatus; reference gene; superoxide dismutase gene EsSOD; gene expression

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.01.024

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR， RT-qPCR）方法分析基因相對(duì)表達(dá)量時(shí)，通常需引入一個(gè)表達(dá)較為穩(wěn)定的內(nèi)參基因（reference gene）[1-3]。理想的內(nèi)參基因應(yīng)在特定物種的組織、細(xì)胞和特定的試驗(yàn)處理下具有穩(wěn)定的表達(dá)水平。在農(nóng)業(yè)害蟲（螨）的相關(guān)功能基因表達(dá)水平研究中，已篩選出許多內(nèi)參基因并經(jīng)過表達(dá)穩(wěn)定性的驗(yàn)證[4]。然而，內(nèi)參基因的選擇和確證因物種或?qū)嶒?yàn)條件而異[5-6]。因此，要分析特定物種在特定處理下的基因表達(dá)水平，仍須進(jìn)行內(nèi)參基因的篩選以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。

天然橡膠是關(guān)系到國計(jì)民生的重要戰(zhàn)略物質(zhì)，在國防和國民經(jīng)濟(jì)建設(shè)中具有不可替代的作用[7-8]。六點(diǎn)始葉螨（Eotetranychus sexmaculatus）是危害我國橡膠樹最嚴(yán)重的一種世界危險(xiǎn)性害螨[9]。當(dāng)前，各橡膠產(chǎn)區(qū)對(duì)于該螨的防治仍依賴于化學(xué)藥劑，但橡膠樹高大，藥劑難以靶標(biāo)，防治難度很大，尋求有效的控制橡膠害螨且符合環(huán)保要求的新的防治策略和防治方法，成為當(dāng)前我國天然橡膠產(chǎn)業(yè)發(fā)展中亟待解決的重要課題。

培育抗性品種是防治橡膠害螨最經(jīng)濟(jì)、最有效、最簡便的方法，對(duì)橡膠樹的抗螨機(jī)理進(jìn)行研究可以為抗螨橡膠樹品種的培育提供理論基礎(chǔ)。前期研究發(fā)現(xiàn)抗螨橡膠樹種質(zhì)‘IRCI12能夠抑制六點(diǎn)始葉螨抗氧化酶超氧化物歧化酶（SOD）的活性，而感螨橡膠樹種質(zhì)則不會(huì)改變SOD酶的活性[10]，迄今為止，由于尚無六點(diǎn)始葉螨內(nèi)參基因篩選的相關(guān)報(bào)道，因此也未能進(jìn)行六點(diǎn)始葉螨抗氧化酶SOD基因表達(dá)水平的驗(yàn)證。本研究擬分別采用geNorm、NormFinder和BestKeeper和RefFinder 4種軟件[11]用于六點(diǎn)始葉螨取食抗、感螨橡膠樹種質(zhì)后抗氧化酶基因EsSOD[10， 12]表達(dá)量變化RT-qPCR分析的內(nèi)參基因篩選和評(píng)價(jià)，為深入闡明橡膠樹種質(zhì)抗螨的分子機(jī)理提供理論和材料支撐。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 供試六點(diǎn)始葉螨? 供試六點(diǎn)始葉螨為實(shí)驗(yàn)室以感螨參照橡膠樹種質(zhì)‘IAN2904新鮮葉片繼代飼養(yǎng)的室內(nèi)種群。將六點(diǎn)始葉螨雌成螨分別接于橡膠樹葉背面，并將葉子放置于長25 cm、寬19 cm的白瓷盤中濕潤海綿上方，同時(shí)以濕潤吸水紙圍攏于葉片周圍以防止試螨逃離，每隔3～5 d更換葉片以保證材料新鮮。飼養(yǎng)條件為：人工氣候箱，溫度（25±1）℃，相對(duì)濕度為（75±5）%，光照周期14（L）∶10（D）。

1.1.2? ?供試橡膠樹種質(zhì)? 選用遺傳穩(wěn)定的抗螨參照橡膠樹種質(zhì)‘IRCI12和感螨參照橡膠樹種質(zhì)‘IAN2904為試驗(yàn)材料[4]。均由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所國家橡膠種質(zhì)資源圃提供。

1.1.3? 供試試劑? RNA提取試劑盒、cDNA合成試劑盒、Mastermix、MaximaTM SYBR Green qPCR Master Mix 試劑盒均為Fermentas公司產(chǎn)品（Fermentas， GlenBurnie， MD）。

1.2? 方法

1.2.1? 總RNA提取和cDNA第一鏈合成? 總RNA的提取參照Fermentas公司RNA提取試劑盒進(jìn)行。采用NanoDrop 2000 Spectrophotometer （Thermo， USA）核酸濃度測定儀測定RNA濃度和純度，OD260/280在1.80～2.20之間表示RNA質(zhì)量較好，并進(jìn)一步通過1.0%瓊脂糖RNA電泳檢測其完整性。采用經(jīng)gDNA Eraser （Takara Biochemicals， Dalian， China）處理去除基因組DNA后，取1.0 μg RNA用于第一鏈cDNA的合成。cDNA合成方法參照Fermentas公司的cDNA合成試劑盒進(jìn)行。RNA和cDNA樣品均保存于-70 ℃超低溫冰箱中。

1.2.2? 六點(diǎn)始葉螨候選內(nèi)參基因和抗氧化酶基因? 本研究初步選擇的6個(gè)候選內(nèi)參基因actin、gapdh、rpl13、α-tub、β-tub和18sRNA分別為在其他害蟲（螨）研究中已經(jīng)確定的內(nèi)參基因[13-15]，抗氧化酶基因?yàn)镋sSOD。上述7個(gè)基因的引物根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期經(jīng)由RNA-seq測序獲得的部分基因序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，引物和基因序列號(hào)等相關(guān)信息見表1。

1.2.3? RT-qPCR分析方法? 采用Bio-Rad CFX96 TouchTM熒光定量PCR儀（Bio-Rad， USA）運(yùn)行RT-qPCR程序，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。最后在54～95 ℃進(jìn)行引物溶解曲線分析，經(jīng)熔解曲線分析確認(rèn)所設(shè)計(jì)的引物無非特異擴(kuò)增及引物二聚體后，將cDNA模板按照3倍稀釋成5個(gè)濃度梯度（3?1、3?2、3?3、3?4、3?5）進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線分析，并根據(jù)公式E=[（10（?1/slope）- 1）×100%計(jì)算不同引物的擴(kuò)增效率，同時(shí)根據(jù)Pfaffl的2?ΔΔCt方法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量[16]，每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.2.4? 候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性分析方法? 首先采用分析軟件geNorm、Normfinder和Bestkeeper并參照Niu等[17]建立的方法分別進(jìn)行候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性排序，然后用RefFinder綜合評(píng)價(jià)上述3種方法的分析結(jié)果以避免單個(gè)分析方法的片面性，最后根據(jù)RefFinder的最終評(píng)估結(jié)果并結(jié)合geNorm分析，可以判定進(jìn)行特定功能基因RT-qPCR驗(yàn)證所使用的內(nèi)參個(gè)數(shù)[18]。

1.2.5? 六點(diǎn)始葉螨取食抗、感螨橡膠樹種質(zhì)對(duì)抗氧化酶基因表達(dá)的影響? 將4個(gè)不同齡期（幼螨、前若螨、后若螨和成螨）按200頭/葉分別接種于抗螨參照橡膠樹種質(zhì)‘IRCI12和感螨參照橡膠樹種質(zhì)‘IAN2904葉背面，飼養(yǎng)方法參照1.1進(jìn)行，分別于接種后48 h挑取存活的六點(diǎn)始葉螨樣品，以1.2.4中篩選得到的穩(wěn)定性最佳的內(nèi)參基因，采用RT-qPCR分析（參考1.2.3）抗氧化酶基因EsSOD表達(dá)量的變化情況。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 候選內(nèi)參基因表達(dá)水平，引物特異性及RT-qPCR擴(kuò)增效率分析

擴(kuò)增效率分析結(jié)果表明，6個(gè)候選內(nèi)參基因的PCR擴(kuò)增效率在94.7%～103.4%之間，并且相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.990（表2）。RT-qPCR分析結(jié)果表明，6個(gè)候選內(nèi)參基因在六點(diǎn)始葉螨不同齡期的循環(huán)閾值（Ct）平均值均低于25.0，并且大部分基因的Ct值均在17～22之間，每個(gè)基因在不同齡期的Ct值變化幅度較?。?biāo)準(zhǔn)差?。?。actin和β-tub是表達(dá)豐度最高的2個(gè)基因，Ct平均值分別為17.8和17.2，而表達(dá)豐度最低的基因?yàn)間apdh，其Ct平均值為24.9（圖1）。

2.2? 不同齡期六點(diǎn)始葉螨候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析

表3結(jié)果表明，根據(jù)△Ct分析方法，在六點(diǎn)始葉螨不同齡期6個(gè)候選內(nèi)參引物的穩(wěn)定性從大到小的排序?yàn)椋篴ctin>β-tub>rpl13>18sRNA> gapdh>α-tub，actin是穩(wěn)定性最好的內(nèi)參基因;根據(jù)geNorm軟件分析方法，6個(gè)候選內(nèi)參引物的穩(wěn)定性從大到小的排序?yàn)椋篴ctin>β-tub>rpl13>α- tub>gapdh>18sRNA，actin是穩(wěn)定性最好的內(nèi)參基因;根據(jù)NormFinder軟件分析方法，6個(gè)候選內(nèi)參引物的穩(wěn)定性從大到小的排序?yàn)椋簉pl13> β-tub>actin>α-tub>18sRNA>gapdh，rpl13是穩(wěn)定性最好的內(nèi)參基因;根據(jù)BestKeeper軟件分析方法，6個(gè)候選內(nèi)參引物的穩(wěn)定性從大到小的排序?yàn)椋害?tub>rpl13>actin>gapdh>α-tub>18sRNA，β-tub是穩(wěn)定性最好的內(nèi)參基因。而最終根據(jù)RefFinder軟件的綜合分析結(jié)果，6個(gè)候選內(nèi)參引物的穩(wěn)定性從大到小的排序?yàn)椋篴ctin>β-tub> rpl13>α-tub>gapdh>18sRNA，綜合來看actin是穩(wěn)定性最佳的內(nèi)參引物，并且β-tub的分值與actin十分接近，而18sRNA的穩(wěn)定性最差（圖2）。此外，RefFinder軟件結(jié)合geNorm軟件分析結(jié)果還表明，V2/3<0.15（V值表示使用n個(gè)和n+1個(gè)內(nèi)參引物對(duì)RT-qPCR分析結(jié)果影響的兩兩變異值，以確定不同樣本中RT-qPCR數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化所需的最佳內(nèi)參基因個(gè)數(shù)，當(dāng)V<0.15時(shí)的n值即表示分析使用的最佳內(nèi)參基因?yàn)閚個(gè)），因此同時(shí)使用actin和β-tub 2個(gè)基因?yàn)閮?nèi)參已完全滿足后續(xù)RT-qPCR分析的要求（圖3）。

2.3? 內(nèi)參基因穩(wěn)定性驗(yàn)證

分別以2.1中篩選出的actin、β-tub、actin+ β-tub組合作為穩(wěn)定的內(nèi)參，同時(shí)以18sRNA為不穩(wěn)定內(nèi)參，研究不同齡期六點(diǎn)始葉螨取食抗、感螨橡膠樹種質(zhì)后EsSOD基因表達(dá)量的變化。結(jié)果表明，不同齡期六點(diǎn)始葉螨幼螨取食抗螨橡膠樹種質(zhì)‘IRCI12后，體內(nèi)EsSOD基因表達(dá)量較取食感螨橡膠樹種質(zhì)‘IAN2904均有所下降，其中分別以actin、β-tub、actin+β-tub組合作為內(nèi)參時(shí)，幼螨、前若螨、后若螨和成螨EsSOD基因表達(dá)量下降百分率分別為26.3%、33.5%、36.8%和56.2%，25.3%、35.5%、38.2%和51.7%，22.6%、34.9%、37.5%和53.3%（圖4），均沒有超過58%;而以18sRNA作為內(nèi)參時(shí)，幼螨、前若螨、后若螨和成螨取食抗螨橡膠樹種質(zhì)‘IRCI12后EsSOD基因表達(dá)量分別為取食‘IAN2904的58.5%、78.5%、74.9%和88.3%（圖4），均在58%以上。上述結(jié)果表明，以actin、β-tub、actin+β-tub組合作為內(nèi)參分析EsSOD基因表達(dá)量變化水平可以獲得較為一致的結(jié)果。

3? 討論

準(zhǔn)確穩(wěn)定的RT-qPCR分析除了需要合理的試驗(yàn)與引物設(shè)計(jì)之外，試驗(yàn)過程中還應(yīng)注意確保高的RNA提取質(zhì)量、高的聚合酶的擴(kuò)增效率、減少cDNA合成以及PCR準(zhǔn)備過程中的操作誤差，避免樣品污染等因素[19]。此外，選擇合適的內(nèi)參基因也尤為重要。由于受物種和試驗(yàn)處理?xiàng)l件的差異，不存在完全通用的、恒定表達(dá)的內(nèi)參基因。由于迄今為止尚無六點(diǎn)始葉螨內(nèi)參基因篩選的相關(guān)報(bào)道，因此課題組選擇的6個(gè)內(nèi)參基因均為其他葉螨科（Tetranychidae）研究中常用的或者已經(jīng)確定的可用于RT-qPCR分析的內(nèi)參基因。例如楊麗紅[20]對(duì)柑橘全爪螨的研究結(jié)果表明，在不同發(fā)育階段穩(wěn)定性較好的是RpII，在低溫脅迫和高溫脅迫下穩(wěn)定性較好的分別是α-tubulin和RpII。Yang等[21]研究了10個(gè)候選內(nèi)參基因在二斑葉螨不同發(fā)育階段的表達(dá)穩(wěn)定性，結(jié)果表明PRL13和v-ATPase是穩(wěn)定性最佳的2個(gè)內(nèi)參。岳秀利等[22]篩選了8個(gè)內(nèi)參基因[18sRNA， α-tubulin， β-actin， ELF， gapdh， rpl13a， SDHA （succinate dehydrogenase complex， subunit A）， TBP （TATA-box- binding protein）]用于二斑葉螨解毒酶基因表達(dá)水平的分析，結(jié)果表明，α-tubulin的穩(wěn)定性最好。周興隆等[23]對(duì)二斑葉螨多重抗性品系最優(yōu)內(nèi)參基因進(jìn)行篩選，并應(yīng)用于CYP392A亞家族基因的表達(dá)分析，結(jié)果表明，最佳內(nèi)參基因?yàn)镋FLn。由此可見，即便針對(duì)同一物種，在不同的試驗(yàn)處理下，內(nèi)參基因的選擇也有較大的差異，因此，必須根據(jù)不同的試驗(yàn)對(duì)象、試驗(yàn)?zāi)康暮驮囼?yàn)條件選擇合適的內(nèi)參基因。

當(dāng)前用于內(nèi)參穩(wěn)定性評(píng)價(jià)的3種主流軟件分別是geNorm、NormFinder和BestKeeper。本研究中3種軟件評(píng)價(jià)結(jié)果存在一定的差異，geNorm分析得出actin是穩(wěn)定性最好的內(nèi)參，NormFinder分析得出rpl13是穩(wěn)定性最好的內(nèi)參，BestKeeper分析獲得β-tub是穩(wěn)定性最好的內(nèi)參。最終應(yīng)用RefFinder整合geNorm、NormFinder和BestKeeper的分析結(jié)果，最終得出actin和β-tub是穩(wěn)定性最好的2個(gè)內(nèi)參。分別以這2個(gè)內(nèi)參單獨(dú)使用、同時(shí)使用驗(yàn)證不同齡期六點(diǎn)始葉螨取食抗、感螨橡膠樹品種后EsSOD基因的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)actin、β-tub內(nèi)參無論單獨(dú)或組合分析均表明EsSOD基因表達(dá)量在害螨取食抗螨種質(zhì)時(shí)均低于取食感螨種質(zhì)，并且均低于采用穩(wěn)定性最差的內(nèi)參18sRNA分析獲得的結(jié)果。前期研究表明，不同齡期六點(diǎn)始葉螨取食抗螨橡膠樹品種‘IRCI12后體內(nèi)SOD酶活性相比取食感螨橡膠樹品種‘IAN2904顯著降低[10]，本研究中分析得到的EsSOD基因表達(dá)變化趨勢與之前的酶活變化趨勢具有一致性，可為橡膠樹種質(zhì)抗螨性分子機(jī)理研究奠定理論基礎(chǔ)。

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