劉 超,江慧玲,王鴻飛,巴塔拿,奧斯曼·科拉,羅海波,陳育如

(1.南京師范大學(xué)食品與制藥工程學(xué)院,江蘇 南京 210023) (2.南京師范大學(xué)江蘇省微生物與功能基因組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇省微生物資源產(chǎn)業(yè)化工程技術(shù)研究中心,江蘇 南京 210023) (3.阿達(dá)納阿爾帕斯蘭科技大學(xué)工程學(xué)院,土耳其 阿達(dá)納 01180)

黃芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)屬唇形科黃芩屬植物,別稱苦芩、山茶根、條芩等,適宜生長在海拔500～1 500 m的向陽且較干燥的地區(qū)[1-2],分布較廣,在我國北方多數(shù)省區(qū)如黑龍江、遼寧、內(nèi)蒙古、河南、河北等地及日本、朝鮮、俄羅斯等地[3-4]均可種植. 黃芩是中國和東亞國家常用的一種重要的傳統(tǒng)藥材,通過傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的“清熱”機(jī)制治療呼吸道和胃腸道的細(xì)菌感染[5]. 黃芩莖葉可藥用也可做茶飲[6]. 近年來,除地下部分根外,其地上部分的研究受到廣泛關(guān)注[7]. 植化和藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn),黃芩根及莖葉中主要成分為黃酮類化合物[8],具有抗氧化、抗炎、抑制腫瘤等作用[9-11]. 黃芩根成分的研究主要集中于黃酮類、苷類、萜類、有機(jī)酸、微量元素等方面[12-14],已分離出70多種黃酮類化合物,包含黃酮、黃酮醇、二氫黃酮及其苷類成分、1個(gè)雙黃酮、1個(gè)查爾酮類成分,同時(shí)還分離得到10多種木脂素及其苷類成分,以及漢漢黃芩素、白楊素、芹菜素等[15-18].

傳統(tǒng)的黃芩素制備有酸水解法、熱裂解法及化學(xué)合成法. 酸水解法過程需要消耗大量的酸,環(huán)境污染大. 熱裂解方法所需溫度高,能耗大且產(chǎn)率較低. 本工作對生物轉(zhuǎn)化和改良酸水解轉(zhuǎn)化黃芩苷為黃芩素進(jìn)行了探討,以期低成本、高效率地制備黃芩素.

1 材料、設(shè)備與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種與培養(yǎng)基

黑曲霉(Aspergillusniger)、根霉(Rhizopuschinensis)、 嗜松青霉(Penicilliumpinophilum)、木霉(Trichodermaviride)、米曲霉(Aspergillusoryzae)等均由本課題組分離保藏.

斜面保藏培養(yǎng)基:200 g土豆、20 g葡萄糖、1.5%～2%瓊脂、1 000 mL水.

固體發(fā)酵培養(yǎng)基:3 g甘蔗渣、4 g豆渣、7 g麩皮、15 mL營養(yǎng)液(硫酸鎂0.08%、硫酸銨2.0%、磷酸二氫鉀0.04%,pH6.5).

1.1.2 材料與試劑

黃芩根,市購;黃芩根提取物,山東天華制藥,含量92.6%;土豆,市購.

黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品、黃芩素標(biāo)準(zhǔn)品,上海源葉生物科技有限公司,HPLC≥98%;無水磷酸氫二鈉,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司,AR;檸檬酸、無水磷酸二氫鉀,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,AR;濃硫酸、無水硫酸鎂、硫酸銨,西隴化工股份有限公司,AR.

1.2 儀器與設(shè)備

CJ-1D垂直超凈工作臺,天津市泰斯特儀器有限公司;高壓蒸汽滅菌鍋,日本TOMY公司;Agilent1100組合式高效液相色譜儀、Agilent Technologies 6460 Triple Quad LC/MS液質(zhì)聯(lián)用儀,美國安捷倫公司;數(shù)控超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司;SHBⅢ循環(huán)水式多用真空泵,鄭州長城科工貿(mào)有限公司;DK-8D電熱恒溫水槽,上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司.

1.3 方法

1.3.1 黃芩根成分分析

1.3.1.1 黃芩根提取液制備

準(zhǔn)確稱取黃芩根粉末1 g,按1∶20料液比加入20 mL 體積濃度70%乙醇,經(jīng)超聲輔助浸提1 h后,0.22 μm 微孔濾膜精密過濾,置于-4 ℃冰箱保存,供HPLC分析.

1.3.1.2 高效液相色譜條件

色譜柱:UltimateAQ-C18;檢測器:VWD(DEAAD02884)detector;檢測波長:335 nm;進(jìn)樣量:20 μL;流動相:0.1%甲酸水-乙腈(A-B);流速:0.6 mL/min;柱溫:30 ℃,等梯度洗脫.

1.3.1.3 質(zhì)譜條件

電噴霧電離(ESI)接口;負(fù)離子模式檢測;加熱毛細(xì)管溫度300 ℃;掃描范圍m/z 100～1 000;吹掃氣壓力2.41×105Pa;霧化氣壓3.5 kV;一級質(zhì)譜碰撞能量為135 V,二級質(zhì)譜碰撞能量為10、20、30、40 eV.

1.3.2 轉(zhuǎn)化菌株的篩選

1.3.2.1 菌株培養(yǎng)

孢子懸液的制備:在黑曲霉、木霉、根霉、嗜松青霉和米曲霉斜面菌種中分別加入5 mL無菌水,用接種環(huán)將孢子刮入水中制得孢子菌懸液.

固體培養(yǎng)基培養(yǎng):在固體培養(yǎng)基中分別接入上述孢子菌懸液,攪勻,28 ℃恒溫培養(yǎng)5 d.

1.3.2.2 酶液制備

將發(fā)酵好的物料按曲∶水=1∶4(質(zhì)量比)的比例加入pH 5.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(0.2 mol/L磷酸氫二鈉、0.1 mol/L檸檬酸),在45 ℃的水浴中浸提40 min,抽濾后即得酶液.

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品:精密稱取黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品25 mg,溶解于100 mL 70%乙醇溶劑中,精確配制成濃度為0.25 mg/mL的黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液. 用70%乙醇溶液稀釋成以下濃度:0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/mL,以黃芩苷濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo),峰面(mAU*s)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.

黃芩素標(biāo)準(zhǔn)品:精密稱取黃芩素標(biāo)準(zhǔn)品10 mg,溶解于100 mL的70%乙醇溶劑中,精確配制成濃度為0.1 mg/mL的黃芩素標(biāo)準(zhǔn)品溶液. 用70%乙醇溶液稀釋成以下濃度:0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/mL,以黃芩素濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo),峰面積(mAU*s)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.

1.4 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分析

黃芩苷轉(zhuǎn)化率的計(jì)算:

黃芩苷轉(zhuǎn)化率yConversion(%)=(C0-C1)/C0×100%,

式中,C0為黃芩苷的初始濃度,由黃芩苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線按照一定系數(shù)比計(jì)算得到;C1為轉(zhuǎn)化后黃芩苷的濃度,由黃芩苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線得到.

黃芩素得率的計(jì)算:

黃芩素得率yYield(%)=(C2-C3)/C4×100%,

式中,C2為轉(zhuǎn)化后黃芩素的濃度,由黃芩素的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到;C3為轉(zhuǎn)化前黃芩素的濃度,由黃芩素的標(biāo)準(zhǔn)曲線得到;C4為轉(zhuǎn)化后黃芩素的理論濃度[19].

圖1 黃芩根提取液和標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖Fig.1 HPLC spectrum of Scutellaria root extract and standards

2 結(jié)果與討論

2.1 黃芩根黃酮類化合物的鑒定

黃芩根提取液經(jīng)HPLC分析,有4個(gè)較明顯的峰(見圖1a),經(jīng)與標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行對比和LC-MS分析,得到其中13.4 min出現(xiàn)的峰對應(yīng)的是黃芩苷,18.4 min出現(xiàn)的峰對應(yīng)的是黃芩素.

圖1a為黃芩根按照1.3.1的方法經(jīng)超聲輔助提取1 h后提取液的HPLC分析圖. 在1.3.1.2的檢測條件下,黃芩根提取液中有4種醇溶性物質(zhì)被檢出,出峰時(shí)間分別為13.3、14.4、14.9和18.3 min. 與標(biāo)準(zhǔn)對照品對照(圖1b和c),圖中最高峰為黃芩苷(13.3 min),含量為5.13%;18.4 min的峰是黃芩素,含量為0.40%.

2.2 黃芩根提取物化學(xué)酸水解

配置濃度分別為60%、70%、80%、90%、98%的硫酸,于40 ℃分別水解黃芩根提取物15 min,考察硫酸濃度對水解效果的影響,結(jié)果如圖2所示.

選擇98%濃硫酸,分別于0、20、40、60、80、100 ℃分別水解黃芩根提取物15 min,考察溫度對化學(xué)酸水解黃芩苷的影響,結(jié)果如圖3所示.

圖2 硫酸濃度對黃芩素生成量的影響Fig.2 The effect of sulfuric acid concentration on the concentration of baicalein

圖3 反應(yīng)溫度對黃芩素生成量的影響Fig.3 The effect of temperature on the concentration of baicalein

從圖2可見,98%的硫酸水解時(shí),黃芩苷的減少量和黃芩素的增加量最多,與其他濃度條件下有明顯差異,說明98%的強(qiáng)酸對黃芩苷的快速水解最為有利.

從圖3可見,起始溫度為0 ℃時(shí),轉(zhuǎn)化率為95.1%,產(chǎn)物得率為51.5%;起始溫度為100 ℃時(shí),轉(zhuǎn)化率為98.8%,產(chǎn)物得率為38.6%. 可見,溫度過高導(dǎo)致原料分解,使產(chǎn)物得率低,故起始溫度較低較為合適. 考慮到0 ℃與40 ℃的轉(zhuǎn)化率與得率無明顯差異,從工業(yè)生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)成本考慮,40 ℃或常溫更為經(jīng)濟(jì).

40 ℃ 98%硫酸水解反應(yīng)15 min轉(zhuǎn)化黃芩根提取物2 g,得到黃芩苷轉(zhuǎn)化率為98.3%,產(chǎn)物黃芩素得率為51.6%,與傳統(tǒng)的化學(xué)水解方法相比得率提高了6.2%.

2.3 黃芩苷的微生物酶法轉(zhuǎn)化

2.3.1 微生物轉(zhuǎn)化的菌種篩選

表1 不同菌株轉(zhuǎn)化黃芩根提取液0.5 h后原料及產(chǎn)物濃度Table 1 Concentration of raw materials and products after transformation of Radix Scutellariae extract by different strains for 0.5 h mg/mL

選取實(shí)驗(yàn)室保存的5株真菌轉(zhuǎn)化黃芩苷,發(fā)酵培養(yǎng) 5 d,浸提酶液的pH調(diào)至5.0,按質(zhì)量濃度比為1∶5(g/mL)的比例浸提酶液,所得酶液10 mL加入黃芩根提取物2 g,于55 ℃恒溫水浴中反應(yīng),0.5 h后測定原料及產(chǎn)物濃度,結(jié)果如表1所示.

由表1可見,轉(zhuǎn)化黃芩根提取液0.5 h后,5種菌株均能將黃芩苷轉(zhuǎn)化為黃芩素. 空白樣中黃芩素的濃度為0.01 mg/mL. 經(jīng)米曲霉酶液轉(zhuǎn)化后,黃芩素濃度為0.11 mg/mL,是轉(zhuǎn)化前原樣中黃芩素原始濃度的11倍;木霉轉(zhuǎn)化后黃芩素濃度為0.05 mg/mL,為原始濃度的5倍;根霉轉(zhuǎn)化后黃芩素濃度為0.04 mg/mL,為原始濃度的4倍;嗜松青霉基本無轉(zhuǎn)化效果. 經(jīng)黑曲霉酶液轉(zhuǎn)化0.5 h后,黃芩苷濃度降為0.29 mg/mL,為原始濃度的58%;黃芩素濃度從0.01 mg/mL提高至0.15 mg/mL,為原始濃度的15倍. 可見,5種菌株中以黑曲霉轉(zhuǎn)化黃芩根提取液中黃芩苷的轉(zhuǎn)化率最高,故后續(xù)選擇黑曲霉為轉(zhuǎn)化菌株.

2.3.2 黑曲霉酶液轉(zhuǎn)化結(jié)果

黑曲霉所提酶液在適宜條件下,轉(zhuǎn)化2 g黃芩根提取物8 h,共轉(zhuǎn)化黃芩苷1.7 g,得到產(chǎn)物黃芩素0.7 g;轉(zhuǎn)化10 h,共轉(zhuǎn)化黃芩苷1.79 g,得到產(chǎn)物黃芩素0.93 g. 與馬宗敏等[20]將18.58 mg黃芩苷轉(zhuǎn)化為9.43 mg黃芩素、轉(zhuǎn)化率為83.8%相比,本工作將1.79 g黃芩苷轉(zhuǎn)化為0.93 g黃芩素,轉(zhuǎn)化率為89.5%.

2.4 不同轉(zhuǎn)化方法的效果比較

化學(xué)水解和生物轉(zhuǎn)化黃芩素的對比結(jié)果如表2所示.

表2 化學(xué)和生物方法轉(zhuǎn)化黃芩苷與黃芩素的含量變化Table 2 Content changes of baicalin and baicalein transformed by chemical and biological methods

由表2可見,利用優(yōu)化后的化學(xué)水解法對1.97 g黃芩苷進(jìn)行轉(zhuǎn)化,得到0.61 g黃芩素,轉(zhuǎn)化率為98.3%,得率為51.6%,比許閩等[21]報(bào)道的轉(zhuǎn)化率提高了6.2%;利用本實(shí)驗(yàn)室篩出的黑曲酶所提酶液對1.79 g黃芩苷進(jìn)行轉(zhuǎn)化,得到0.93 g黃芩素,轉(zhuǎn)化率為89.5%,得率為85.8%,與郭艷霞等[19]用纖維素酶和果膠酶混合將黃芩苷轉(zhuǎn)化為黃芩素,轉(zhuǎn)化率為62.1%進(jìn)行對比,本工作的轉(zhuǎn)化率高出27.4%,得率更高.

3 結(jié)論

本文采用生物轉(zhuǎn)化法和化學(xué)水解法將黃芩苷轉(zhuǎn)化為黃芩素. 化學(xué)水解法能夠高效轉(zhuǎn)化原料黃芩苷,轉(zhuǎn)化率達(dá)到98.3%,但產(chǎn)物得率僅為51.6%,且易造成環(huán)境污染. 生物轉(zhuǎn)化法的轉(zhuǎn)化率與得率分別達(dá)到89.5%與85.8%,在保證轉(zhuǎn)化率和得率的情況下,生物轉(zhuǎn)化法克服了強(qiáng)酸的缺點(diǎn),是更為高效且綠色環(huán)保的方法.