張紅肖，范妍芹，孟雅寧，嚴立斌,2*

（1.河北省農(nóng)林科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所，河北 石家莊 050051；2.河北省蔬菜工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊 050051）

辣椒（Capsicum annuumL.）為茄科辣椒屬植物，由于辣椒自然純合速度慢，育種周期長，因此可以通過花藥培養(yǎng)技術(shù)縮短育種年限，從而加快育種進程。影響辣椒花藥培養(yǎng)的因素很多且不穩(wěn)定，比如供試辣椒植株的生長情況、供體植株的基因型以及外源激素類型等，這些因素都會引起花藥褐化和愈傷化，導(dǎo)致胚狀體愈傷率和誘導(dǎo)率降低，不利于花藥培養(yǎng)在育種中的應(yīng)用。Dolcet等[1]利用改良培養(yǎng)基并應(yīng)用新的方法，提高了辣椒花藥培養(yǎng)的誘導(dǎo)率[2]；然而，辣椒花藥培養(yǎng)還存在胚狀體誘導(dǎo)率低、再生植株分化率低等一系列的問題，限制了其應(yīng)用范圍[3-4]。大多數(shù)研究表明，供體材料基因型、花藥的小孢子發(fā)育時期、培養(yǎng)基的激素濃度組合、預(yù)處理的天數(shù)等培養(yǎng)條件都會對胚狀體的誘導(dǎo)產(chǎn)生不同的影響[5-8]。因此，本研究主要從培養(yǎng)基中植物激素的濃度、低溫預(yù)處理及高溫熱激的方式、活性炭濃度幾個方面研究對不同基因型辣椒花藥培養(yǎng)的影響，旨在為推進辣椒花藥培養(yǎng)技術(shù)的實用化提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗時間與地點

2019年2月中旬在溫室內(nèi)播種育苗，4月份定植于河北省農(nóng)林科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所大田試驗地。

1.2 試驗材料

供試材料是由河北省農(nóng)林科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所茄果室培育的3個不同基因型辣椒材料，分別為19-1（方燈、紅色）、19-2（牛角、黃色）、19-3（方燈、黃色），編號分別為L1、L2、L3。MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基為來自Phyto Technology公司的產(chǎn)品M519。

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗前的準備

1.3.1.1 花蕾的選擇 幼苗定植后30 d，待植株進入花期，對不同基因型辣椒材料進行摘蕾，于每天09：00之前采集瓣萼比為1左右，長度為2～3 mm的花蕾[9]，每個品種每次取5～8株的花蕾混合，以消除單株間差異。將采摘的花蕾放入4 ℃冰箱預(yù)處理，備用。

1.3.1.2 花藥提取 將經(jīng)預(yù)處理的花蕾在超凈工作臺進行消毒處理，首先用75%的酒精浸泡30 s，然后加入0.1%的升汞消毒8 min，再加入1～2滴Tweet-20并充分晃動10 min，最后用無菌水沖洗3次，時間分別是1、4、10 min，放置于有無菌濾紙的培養(yǎng)皿中（注意挑選保存良好的花蕾，干癟和有病蟲害的直接舍棄）。用鑷子輕輕剝開花蕾，選擇個頭飽滿的、無破損的花藥以備接種。

1.3.2 試驗設(shè)計

1.3.2.1 不同基因型對辣椒花藥培養(yǎng)胚狀體誘導(dǎo)率的影響試驗 將采摘的花蕾置于密封袋里放4 ℃冰箱預(yù)處理2 d，按上述方法消毒后剝出花藥接種至培養(yǎng)基（MS+蔗糖30 g/L+瓊脂8 g/L+活性炭2 g/L+NAA 0.8 mg/L+KT 1.0 mg/L+IAA 1.0 mg/L+6-BA 0.3 mg/L+ZT 1.0 mg/L，pH值5.8）。接種后在35 ℃暗培養(yǎng)7 d，然后轉(zhuǎn)接至25 ℃，光照度2 500 lx條件下繼續(xù)培養(yǎng)，每個處理接種25皿，每皿接種10～15個花藥。

1.3.2.2 花蕾低溫預(yù)處理對辣椒花藥培養(yǎng)胚狀體誘導(dǎo)率的影響試驗 將采摘的花蕾置于密封袋里并放4 ℃冰箱，分別設(shè)置處理0（CK1）、1、2、3、4 d低溫預(yù)處理，以不經(jīng)低溫處理（0 d）為對照，按上述方法消毒后剝?nèi)』ㄋ幗臃N于培養(yǎng)基（MS+蔗糖30 g/L+瓊脂8 g/L+活性炭2 g/L+NAA 0.8 mg/L+KT 1.0 mg/L+IAA 1.0 mg/L+6-BA 0.3 mg/L+ZT 1.0 mg/L，pH值5.8）中，培養(yǎng)條件及接種數(shù)量同1.3.2.1。

1.3.2.3 激素濃度對辣椒花藥培養(yǎng)胚狀體誘導(dǎo)率的影響試驗 將采摘的花蕾置于密封袋里放4 ℃冰箱低溫預(yù)處理2 d，按上述方法消毒后剝?nèi)』ㄋ庍M行接種。在培養(yǎng)基（MS+蔗糖30 g/L+瓊脂8 g/L+活性炭2 g/L，pH值5.8）中分別添加不同激素組合，設(shè)置8個激素組合（表1），培養(yǎng)條件及接種數(shù)量同1.3.2.1。

1.3.2.4 高溫熱激處理對辣椒花藥培養(yǎng)胚狀體誘導(dǎo)率的影響試驗 將采摘的花蕾置于密封袋里放4 ℃冰箱低溫預(yù)處理2 d，按上述方法消毒后剝?nèi)』ㄋ幗臃N至培養(yǎng)基（MS+蔗糖30 g/L+瓊脂8 g/L+活性炭2 g/L+NAA 0.8 mg/L+KT 1.0 mg/L+IAA 1.0 mg/L+6-BA 0.3 mg/L+ZT 1.0 mg/L，pH值5.8）中，進行35 ℃高溫熱激（暗培養(yǎng)）處理，熱激處理時間分別設(shè)置為0（CK2）、3、5、7 d，培養(yǎng)條件和接種數(shù)量同1.2.3.1。

1.3.2.5 活性炭處理對辣椒花藥培養(yǎng)胚狀體誘導(dǎo)率的影響試驗 將采摘的花蕾置于密封袋里放4 ℃冰箱低溫預(yù)處理2 d，按上述方法消毒后剝?nèi)』ㄋ幗臃N至培養(yǎng)基（M S+蔗糖30 g/L+瓊脂8 g/L+NAA 0.8 mg/L+KT 1.0 mg/L+IAA 1.0 mg/L+6-BA 0.3 mg/L+ZT 1.0 mg/L，p H值5.8），培養(yǎng)基中活性炭濃度分別設(shè)為0（C K3）、2、3、4 g/L，培養(yǎng)條件和接種數(shù)量同1.3.2.1。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

5個影響因子試驗均于花藥接種后1周觀察其污染情況，及時去除被污染的培養(yǎng)皿，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計分析各處理花藥胚狀體數(shù)量，每周統(tǒng)計1次，胚狀體誘導(dǎo)率＝誘導(dǎo)胚狀體總數(shù)/接種花藥數(shù)×100%。

采用SPSS統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因型對辣椒花藥培養(yǎng)胚狀體誘導(dǎo)率的影響

表2結(jié)果表明，辣椒花藥胚狀體的誘導(dǎo)與供體植株基因型有密切關(guān)系。在3個基因型辣椒品種中，有2個基因型（L1、L3）得到了胚狀體，但生長點不太明顯，L2基因型未得到胚狀體。在得到胚狀體的材料中，L3誘導(dǎo)率最高，達21.7%；其次為L1，誘導(dǎo)率為17.4%；L2較難出胚，說明該品種不適于用作花藥培養(yǎng)的材料。

2.2 低溫預(yù)處理對辣椒花藥培養(yǎng)胚狀體誘導(dǎo)率的影響

由圖1可知，低溫預(yù)處理對3個品種的誘導(dǎo)率具有明顯的影響。沒有經(jīng)過低溫處理的L1，其胚狀體誘導(dǎo)率只有14.6%，而低溫處理1 d后，胚狀體的誘導(dǎo)率提高7.1個百分點，低溫預(yù)處理2 d，比低溫處理1 d提高8.3個百分點，比對照處理提高了15.4個百分點，隨著處理時間的延長，胚狀體的誘導(dǎo)率反而出現(xiàn)下降，處理4 d后，胚狀體的誘導(dǎo)率略低于對照。L2花藥的出胚率較低，其中低溫預(yù)處理1 d和2 d有胚狀體出現(xiàn)，誘導(dǎo)率僅有2.86%和7.14%，0、3、4 d都沒有胚狀體出現(xiàn)，并且隨著處理時間的延長此品種花蕾有所褐化。L3花藥在低溫環(huán)境下處理1、2、3 d，其花藥胚狀體的誘導(dǎo)率在不斷上升，處理3 d的誘導(dǎo)率為26.7%，但在3 d以后誘導(dǎo)率開始下降?？傮w而言，以4 ℃低溫預(yù)處理2 d的誘導(dǎo)效果較好。

表1 植物激素梯度設(shè)計

表2 不同基因型品種對辣椒花藥培養(yǎng)胚狀體誘導(dǎo)率的影響

圖1 低溫預(yù)處理對花藥胚狀體誘導(dǎo)率的影響

2.3 不同濃度激素組合對辣椒花藥培養(yǎng)胚狀體誘導(dǎo)率的影響

表3結(jié)果顯示，不同濃度激素組合對辣椒花藥培養(yǎng)的影響很大，其中L1、L3辣椒基因型在8種不同激素組合處理中都可以誘導(dǎo)出愈傷組織，且均在P5培養(yǎng)基中誘導(dǎo)效果最好，而在其他培養(yǎng)基上效果略微差些，L2辣椒基因型則在P8培養(yǎng)基中誘導(dǎo)效果最好。L3在P5和P8培養(yǎng)基上胚狀體誘導(dǎo)率較高，分別為30.0%和22.2%，L1在P5培養(yǎng)基上胚狀體誘導(dǎo)率為22.0%，L2的胚狀體誘導(dǎo)效果則不理想；因此，初步推斷L3品種適合在P5和P8培養(yǎng)基上培養(yǎng)，L1品種適合在P5培養(yǎng)基上培養(yǎng)。

從表3中還可以看出，不同品種在相同培養(yǎng)基中誘導(dǎo)率也有差異，生長素中以0.8 mg/L NAA效果最好，細胞分裂素中則以0.3 mg/L 6-BA、1.0 mg/L KT、1.0 mg/L ZT更有利于胚狀體的形成；因此，需要根據(jù)不同基因型材料篩選適宜的激素組合。

2.4 高溫熱激處理對辣椒花藥培養(yǎng)胚狀體誘導(dǎo)率的影響

表4結(jié)果表明，隨著熱激處理時間的延長，L1胚狀體的誘導(dǎo)率有明顯提高，在0 d和3 d時，可能花藥對高溫不太敏感，而5、7 d處理的誘導(dǎo)效果最為顯著；L2則在處理0、3 d均不能誘導(dǎo)出胚狀體，可能是因為該品種花藥初期反應(yīng)不敏感，不能促使愈傷組織形成胚狀體，7 d時胚狀體的誘導(dǎo)率可達3.00%；L3則隨著處理時間的延長，誘導(dǎo)率不斷增加，處理7 d比3 d增加了7.0個百分點。此次試驗中，3種辣椒基因型在0 d都未能誘導(dǎo)出胚狀體，說明辣椒花藥培養(yǎng)過程中需要適當延長熱激處理時間，才能有效提高辣椒花藥胚狀體的誘導(dǎo)率。

表3 不同激素濃度組合對辣椒花藥胚狀體誘導(dǎo)的影響

表4 高溫熱激對辣椒花藥培養(yǎng)的影響

2.5 活性炭濃度對辣椒花藥培養(yǎng)胚狀體誘導(dǎo)率的影響

由表5可以看出，L1在添加2 g/L活性炭處理時胚狀體誘導(dǎo)率最高，比CK3增加1.3個百分點，與CK3的差異達到極顯著水平，3 g/L活性炭處理誘導(dǎo)率比CK3降低了4.0個百分點，4 g/L活性炭處理組比CK3降低了5.3個百分點。同樣，L3也在添加2 g/L活性炭處理時胚狀體誘導(dǎo)率最高，添加3、4 g/L活性炭反而會降低胚狀體誘導(dǎo)率。而添加不同濃度活性炭并未增加L2的胚狀體誘導(dǎo)率，反而使之降低，對照組的出胚率高達40.9%，活性炭處理均極顯著低于對照。由此可見，添加2 g/L活性炭有利于提高L1、L3基因型花藥胚狀體誘導(dǎo)率，L2并不適宜添加活性炭?？梢钥吹?，活性炭對胚狀體誘導(dǎo)率的影響與供試材料基因型有關(guān)。

3 結(jié)論與討論

前人研究認為基因型決定出胚率[10-11]。楊博智等[2]研究發(fā)現(xiàn)，在相同條件下不同基因型的辣椒花藥胚狀體誘導(dǎo)率不同，誘導(dǎo)率為0%～2%。本試驗中相同培養(yǎng)條件下，不同的辣椒品種出胚率差別很大，如L1和L3的出胚率分別為17.4%、21.7%，而L2沒有出現(xiàn)胚狀體，基因型之所以對出胚率存在顯著影響，可能是因為辣椒花藥中存在可操控掌握小孢子發(fā)育的基因[12]。

Supena等[13]和Pechan等[14]分別采用4 ℃預(yù)處理花蕾，都不同程度提高了胚狀體的誘導(dǎo)率。Vaulx等[15]研究表明，辣椒花藥接種后先在35 ℃環(huán)境下進行2～8 d熱激處理可提高胚狀體的誘導(dǎo)率。本研究發(fā)現(xiàn)，預(yù)處理對于刺激花藥胚狀體發(fā)生特別重要，不經(jīng)過預(yù)處理直接培養(yǎng)很難獲得胚狀體和愈傷組織，4 ℃預(yù)處理2 d花蕾誘導(dǎo)效果較好，花藥接種后35 ℃高溫處理7 d，胚狀體誘導(dǎo)率明顯提高。

激素的種類和濃度對調(diào)控細胞分裂、生長和分化有重要的作用，楊敏麗等[16]研究發(fā)現(xiàn)，低濃度的NAA和KT可以促進胚狀體的形成。而本試驗證實：采用NAA 0.8 mg/L+KT 1.0 mg/L+IAA 1.0 mg/L+6-BA 0.3 mg/L+ZT 1.0 mg/L的激素組合可提高花藥胚狀體誘導(dǎo)率。

表5 活性炭濃度對辣椒花藥培養(yǎng)胚狀體誘導(dǎo)率的影響

多數(shù)學(xué)者認為添加活性炭對提高胚狀體誘導(dǎo)率是有益的。陳曉等[17]認為添加2.5 g/L的活性炭對于辣椒胚狀體的誘導(dǎo)較好，本試驗結(jié)果表明2 g/L活性炭的誘導(dǎo)效果較好，與前人的研究結(jié)果相似，可能是由于使用的活性炭顆粒大小不同，其吸附能力也有所不同；也有可能與不同基因型辣椒品種反應(yīng)不同有關(guān)[18]；另外，本試驗活性炭濃度梯度設(shè)置或許存在不足，有待進一步試驗驗證。

到目前為止，雖然辣椒花藥培養(yǎng)已經(jīng)有大量的研究報道[19-20]，但仍然存在胚狀體誘導(dǎo)率以及出苗率低、玻璃化和污染率高等問題[21]。所以，今后研究內(nèi)容應(yīng)集中在開發(fā)新的花藥培養(yǎng)方案，繼續(xù)優(yōu)化培養(yǎng)條件等，從而提高誘導(dǎo)率，為培育新品種奠定基礎(chǔ)。