齊澳 任燦 李俊 趙筱萍 金強(qiáng) 何江敏

摘要 目的：使用轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型篩選冠心寧片中具有抗血栓活性的組分及藥效物質(zhì)，并探討其作用機(jī)制。方法：將斑馬魚胚胎分為對(duì)照組、造模組、給藥組及陽(yáng)性藥組，使用苯肼誘導(dǎo)血栓模型。通過(guò)熒光顯微成像結(jié)合血紅蛋白染色對(duì)冠心寧片各組分抗血栓作用進(jìn)行定性和定量分析。進(jìn)一步探尋活性組分中起抗血栓作用的主要成分。最后進(jìn)行活性氧（ROS）檢測(cè)及脂質(zhì)氧化損傷丙二醛（Malondialdehyde，MDA）分析，探討其抗血栓機(jī)制。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示冠心寧片水溶性組分可顯著減少外周血紅細(xì)胞聚集（P<0.01），增加回心血量，且效果呈劑量依賴性。因多糖為冠心寧片水溶性成分中的主要物質(zhì)，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)丹參多糖和川芎多糖也具有抗血栓活性，且能顯著降低斑馬魚的氧化應(yīng)激水平，丹參多糖還具有下調(diào)胚胎脂質(zhì)過(guò)氧化水平的作用。結(jié)論：丹參多糖和川芎多糖為冠心寧片水溶性組分中具有抗血栓作用的活性化合物，可能與其抑制氧化應(yīng)激作用有關(guān)，具有開(kāi)發(fā)為抗血栓治療先導(dǎo)物的潛在應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞 血栓;斑馬魚;丹參多糖;川芎多糖;氧化應(yīng)激;苯肼

Study on Antithrombotic Activity of Water-soluble Components in Guanxinning Tablet

QI Ao1，REN Can1，LI Jun1，ZHAO Xiaoping2，JIN Qiang3，HE Jiangmin3

（1 College of Pharmaceutical Sciences，Zhejiang University，Hangzhou 310058，China; 2 School of Basic Medical Sciences，Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou 310053，China; 3 Chiatai Qingchunbao Pharmaceutical Co.，Ltd.，Hangzhou 310023，China）

Abstract Objective：To screen the fractions and pharmacodynamic substances with antithrombotic activity in Guanxinning Tablet by using transgenic zebrafish model，and to explore the mechanism of action.Methods：Zebrafish embryos were divided into a control group，a model group，an administration group and a positive group，and the thrombus model was induced by phenylhydrazine.Qualitative and quantitative analysis of the antithrombotic effect of each component of Guanxinning tablets was carried out by fluorescence microscopy imaging combined with hemoglobin staining.Further explore the main components of the active ingredients that play an anti-thrombotic effect.Finally，ROS measurement and MDA analysis were performed to explore its anti-thrombotic mechanism.Results：The experimental results showed that the water-soluble components of Guanxinning Tablets can significantly reduce peripheral red blood cell aggregation （P<0.01），increase the return blood volume，and the effect was dose-dependent.Because polysaccharides were the main substances in the water-soluble components of Guanxinning Tablets，further experiments have found that Danshen polysaccharides and Ligusticum chuanxiong polysaccharides also had antithrombotic activity and could significantly reduce the oxidative stress level of zebrafish.Conclusion：Danshen polysaccharides and Ligusticum chuanxiong polysaccharides are active compounds with antithrombotic effects in the water-soluble components of Guanxinning tablets，which may be related to their inhibitory effects on oxidative stress and have potential application prospects for the development of antithrombotic therapies.

Keywords Blood clots; Zebrafish; Salvia miltiorrhiza polysaccharide; Ligusticum chuanxiong polysaccharide; Oxidative stress; Phenylhydrazine

中圖分類號(hào)：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.23.006

近30年來(lái)，心血管疾病仍居全球死亡因素的首位[1]，超過(guò)了總死亡原因構(gòu)成的40%，遠(yuǎn)高于腫瘤及其他疾病的死亡率[2]。血栓形成是冠心病等主要心血管疾病的關(guān)鍵病理過(guò)程。按照形成部位，血栓可分為動(dòng)脈血栓和靜脈血栓。動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的破裂可導(dǎo)致動(dòng)脈阻塞，從而引發(fā)心臟病發(fā)作、中風(fēng)或猝死等一系列疾病。靜脈血栓栓塞癥也是一種常見(jiàn)的心血管疾病，甚至在全世界流行的新型冠狀病毒病肺炎（COVID-19）病例中，也報(bào)道了大量的靜脈血栓栓塞發(fā)作。Ahmed等[3]認(rèn)為2019冠狀病毒疾病可以被視為一種血栓前期疾病。此外，流行病學(xué)研究報(bào)告稱，在有動(dòng)脈心血管事件史或有心肌梗死家族史的患者中，靜脈血栓栓塞的發(fā)生率增加。

抗血栓藥可分為抗凝血藥、抗血小板聚集藥和溶血栓藥3類。由丹參、川芎2種植物提取物組成的冠心寧片（正大青春寶）在冠心病的臨床治療中發(fā)揮了重要作用[4]。Sun等[5]在隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)中對(duì)160例穩(wěn)定型心絞痛患者分別給予冠心寧片（80例）或安慰劑（80例），發(fā)現(xiàn)冠心寧片組在跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)、中醫(yī)證候評(píng)分等指標(biāo)中展現(xiàn)了良好的效果。然而，由于天然衍生物的成分比較復(fù)雜，冠心寧片中哪些活性成分發(fā)揮了抗冠心病作用尚不清楚。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，冠心寧片中來(lái)自丹參的隱丹參酮和來(lái)自川芎的洋川芎內(nèi)酯Ⅰ，通過(guò)氧化應(yīng)激、血小板活化和凝血級(jí)聯(lián)等多種信號(hào)通路，在不同水平上協(xié)同負(fù)向調(diào)控動(dòng)物模型的血栓形成[6]。此外，Wang等[7]基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)了活性成分的作用靶點(diǎn)，并且用FeCl3誘導(dǎo)的大鼠血栓模型進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明冠心寧片的抗血栓作用機(jī)制可能與其抑制絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen Activated Protein Kinases，MAPK）信號(hào)通路中P38絲裂原活化蛋白激酶（P38）、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（Extracellular Regulated Protein Kinases，ERK）和c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal Kinase，JNK）的磷酸化有關(guān)。但整體來(lái)說(shuō)，目前對(duì)其藥理機(jī)制及活性成分的生物研究還十分有限，限制了其臨床應(yīng)用，所以對(duì)冠心寧藥理機(jī)制及活性成分的研究亟待開(kāi)展。

斑馬魚與人類基因同源性高達(dá)85%，其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與人類基本近似，生物結(jié)構(gòu)和生理功能與哺乳動(dòng)物高度相似，具有個(gè)體小、發(fā)育周期短、實(shí)驗(yàn)周期短、費(fèi)用低、體外受精、透明、單次產(chǎn)卵數(shù)較高以及實(shí)驗(yàn)用藥量小等優(yōu)點(diǎn)。目前，斑馬魚已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于發(fā)育生物學(xué)研究、人類疾病模型研究、新藥篩選、藥物毒性與安全性評(píng)價(jià)以及環(huán)境毒理學(xué)研究等領(lǐng)域。美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究院（National Institutes of Health，NIH）也將斑馬魚列為繼大鼠和小鼠之后的第三大脊椎類模式生物，可以有效彌補(bǔ)體外實(shí)驗(yàn)和哺乳類動(dòng)物實(shí)驗(yàn)之間的生物學(xué)斷層，完善現(xiàn)有藥物研發(fā)體系。

苯肼（Phenyl Hydrazine，PHZ）因具有溶血作用而被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物溶血模型的建立，也有文獻(xiàn)報(bào)道PHZ可導(dǎo)致氧化損傷和內(nèi)皮功能障礙，從而在斑馬魚模型中被用作血栓誘導(dǎo)劑[8]。本研究對(duì)冠心寧片進(jìn)行組分制備，并利用PHZ誘導(dǎo)斑馬魚血栓模型，篩選評(píng)估冠心寧片各組分在血栓生成中的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 本課題中所有的斑馬魚動(dòng)物實(shí)驗(yàn)都是根據(jù)浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物倫理委員會(huì)的指導(dǎo)準(zhǔn)則進(jìn)行。野生型TU品系（Tuebingen，TU）株、紅細(xì)胞熒光標(biāo)記斑馬魚Tg（LCR：EGFP）轉(zhuǎn)基因斑馬魚來(lái)源于浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心和浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院斑馬魚平臺(tái)。平臺(tái)養(yǎng)殖條件：28.5 ℃培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng);黑暗/光照周期為10∶14。到培養(yǎng)皿內(nèi)。斑馬魚胚胎在受精后5 d（Days Post Fertilization，dpf）后將小魚轉(zhuǎn)移到配套的小魚盒中，每天喂食草履蟲2～3次，飼喂量為每10條小魚的量飼喂5 mL草履蟲;待魚至12 dpf左右，開(kāi)始進(jìn)行草履蟲和豐年蟲混合投喂;待小魚能完全攝食豐年蟲后，可移至水循環(huán)系統(tǒng)中并依據(jù)魚的數(shù)量選用不同規(guī)格的魚缸。每天喂食早晚2餐，隨著小魚成長(zhǎng)可將水流逐漸調(diào)大，直至其長(zhǎng)成成魚。

1.1.2 藥物 冠心寧片（正大青春寶藥業(yè)有限公司，批號(hào)：201912）。丹參多糖和川芎多糖（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：LOT-J26GS142460，LOT-J26GS142459，純度均為60%）。

1.1.3 試劑與儀器 苯肼（中國(guó)上海阿拉丁公司，批號(hào)：G1324044）;1-苯基-2-硫脲（Sigma-Aldrich公司，美國(guó)，批號(hào)：P7629）;3-氨基苯甲酸乙酯（Tricaine，Sigma-Aldrich公司，美國(guó)，批號(hào)：E10521）;DCFH-DA（大連美侖生物科技有限公司，批號(hào)：MA0219）;阿司匹林（大連美侖生物科技有限公司，批號(hào)：MB1790）;MDA（上海碧昂斯公司，批號(hào)：S0131）;分析天平（梅特勒-托利多，瑞士，XS105DU）;體式熒光顯微鏡（尼康，日本，型號(hào)：Nikon SMZ18）;倒置熒光顯微鏡（Leica，德國(guó)，型號(hào)：Leica DMI 3000B）;微量移液器（Eppendorf，德國(guó)Eppendorf Research plus基本型）;渦旋振蕩儀（Scientific Industries，美國(guó)，型號(hào)：Vortex-Genie 2）;變焦體式顯微鏡（江南新興，型號(hào)：ZOOM460）;超聲儀（LUMTECH北京綠棉科技有限公司，型號(hào)：KS-360AL）;高效液相色譜儀（塞默科技，德國(guó)，型號(hào)：Thermo Dionex Ultimate 3000）質(zhì)譜檢測(cè)器（塞默科技，德國(guó)，型號(hào)：Q-ExactiveTM Focus Hybrid Quadrupole-OrbitrapTM），熱電噴霧電離源（HESI-Ⅱ）中壓液相色譜（MPLC）：控制系統(tǒng)（Sepacore Control Software），泵（Buchi，瑞士，型號(hào)：C-605），組分收集器（Buchi，瑞士，型號(hào)：Buchi Fraction collector C-620），UV檢測(cè)器（Buchi，瑞士，型號(hào)：C-640）;旋蒸儀（Buchi，瑞士，型號(hào)：R-200），真空控制模塊（V-800，Buchi），真空泵（Buchi，瑞士，型號(hào)：vacuubrand 4C，），水浴鍋（Buchi，瑞士，型號(hào)：B-490），循環(huán)冷凝裝置（Buchi，瑞士，型號(hào)：F-314）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 斑馬魚胚胎培養(yǎng)基為E3（0.29 g/L NaCl，0.013 g/L KCl，0.048 g/L CaCl2·2H2O，0.082 g/L MgCl2·6H2O，pH=7.2）。發(fā)育至2 dpf時(shí)，將胚胎移至12孔板，每孔15枚胚胎，分別加入測(cè)試藥物、陽(yáng)性藥和0.1% DMSO，定義為給藥組、陽(yáng)性藥組和空白對(duì)照組。24 h后，用含有PTU的E3緩沖液沖洗胚胎3次，然后加入造模藥PHZ，造模濃度為0.75 μmol/L，12 h后再次用含有PTU的E3緩沖液沖洗胚胎3次，換成每孔1 mL E3緩沖液，然后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。見(jiàn)圖1。

1.2.2 給藥方法

1.2.2.1 冠心寧片浸膏制備 冠心寧片按照中國(guó)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)（YBZ00342016）生產(chǎn)。簡(jiǎn)而言之，冠心寧片是由丹參和川芎2種草藥成分以1∶1質(zhì)量比率混合，然后用水提取2次。2次水提物混合和濃縮，然后醇沉。不溶性物質(zhì)通過(guò)過(guò)濾器去除，在50 ℃下，將濾液進(jìn)一步濃縮到相對(duì)密度在1.30～1.35。最后，濃縮提取物在真空干燥烤箱中干燥成粉末。

1.2.2.2 冠心寧片組分制備 載樣方法為干粉進(jìn)樣，提取物樣品與C18硅膠（40～63 μm，ZEO prep 90）混合，研缽中研磨至混合均勻。進(jìn)樣空柱中少許細(xì)沙墊底，裝入混合樣品的硅膠，細(xì)沙于上層鋪滿，封裝，接入裝置。液相條件：色譜柱，分離柱30 mm×200 mm，Interchim Puriflash C18-HP 15 μmol/L F0080;流動(dòng)相，（A）水-0.1%甲酸，（B）甲醇-0.1%甲酸;流速20 mL/min;梯度：0 min，5% B;16 min，5%B;47 min，28.7%B;62 min，28.7%B;92 min，39.8%B;122 min，39.8%B;138 min，49.3%B;153 min，49.3%B;168 min，100%B;183 min，100%B。收集組分濃縮，氮?dú)獯蹈?，冷凍?chǔ)存。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.2.3.1 轉(zhuǎn)基因斑馬魚血流的動(dòng)態(tài)觀察和定量檢測(cè) 分別測(cè)定各組熒光蛋白標(biāo)記紅細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎Tg（LCR：EGFP）的血流量。胚胎在0.016% Tricaine麻醉下進(jìn)行顯像。以每孔一條的比例放入96孔板，每個(gè)胚胎以50幀/秒的速度拍攝視頻。為了進(jìn)行圖像分析，手動(dòng)定位靜脈的一個(gè)有代表性的測(cè)量區(qū)域，拍攝后，選取每個(gè)斑馬魚胚胎相同部位的背主動(dòng)脈和尾靜脈位點(diǎn)進(jìn)行觀察，并在所有50幀圖像中，手動(dòng)計(jì)算每個(gè)胚胎在某一特定點(diǎn)穿過(guò)血管的紅細(xì)胞數(shù)量（每組至少有8個(gè)胚胎為有效數(shù)據(jù)）。

1.2.3.2 斑馬魚胚胎鄰苯茴香胺染色 在70 mL的無(wú)水乙醇中溶解100 mg的鄰苯茴香胺粉末，4 ℃下避光保存。配置工作液[鄰苯茴香儲(chǔ)存液，2 mL;0.1 mol/L醋酸鈉NaOAc，pH=4.5，500 μL;無(wú)菌水，2 mL;過(guò)氧化氫（30%儲(chǔ)液），100 μL]。避光靜止染色3～5 min。染色液變成棕色，氣泡釋放。在解剖顯微鏡下可看到紅色染色信號(hào)后，用雙蒸水洗滌3次以終止反應(yīng)。染好的樣品4%多聚甲醛固定后4 ℃避光保存用于后續(xù)顯微觀察。

1.2.3.3 ROS檢測(cè) 以斑馬魚胚胎為實(shí)驗(yàn)材料，在28.5 ℃的避光條件下孵育，用10 μmol/L DCFH-DA溶液培養(yǎng)30 min。然后用E3培養(yǎng)基漂洗胚胎3遍，并在熒光顯微鏡下成像。采用Image J程序?qū)蝹€(gè)幼蟲的熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量。每組15枚胚胎，重復(fù)3次。

1.2.3.4 MDA檢測(cè) 采用“脂質(zhì)氧化檢測(cè)試劑盒”來(lái)檢測(cè)各組斑馬魚的MDA含量。采集受精后84 hpf的胚胎，首先將各組斑馬魚收集于1.5 mL離心管內(nèi)，加入PBS使液面沒(méi)過(guò)斑馬魚胚胎，將樣品置于冰上，用研磨棒置于離心管底端反復(fù)研磨30下直至魚被完全碾碎，按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)。取少量樣品進(jìn)行BCA蛋白測(cè)量歸一化測(cè)量同樣重量魚的MDA含量。每組15枚胚胎，重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SEM）表示，GraphPad Prism 8軟件作圖，2組間采用Student′s t-test進(jìn)行比較，多組間采用one-way ANOVA分析比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。用藥效果的檢驗(yàn)采用Bliss獨(dú)立模型[9-10]。各組挽救效果E按（觀察組紅細(xì)胞數(shù)/s）/（對(duì)照組紅細(xì)胞數(shù)/s）×100%計(jì)算。觀察到的藥物組合效果表示為EAB（0≤EAB≤1），和預(yù)期的累加效應(yīng)是由概率獨(dú)立一般公式：EA+EB（1-EA）=EA+EB-EAEB，0≤EA≤1和0≤EB≤1。將觀察到的效果與加性效果進(jìn)行t檢驗(yàn)，P值顯示在相應(yīng)的圖上。所得的組合指數(shù)CI也顯示在圖中，計(jì)算公式為：CI=（EA+EB-EAEB）/EAB。當(dāng)CI<1時(shí)，組合效應(yīng)大于預(yù)期的相加效應(yīng)。

2 結(jié)果

2.1 冠心寧片組分制備 采用高效液相色譜法，對(duì)冠心寧片全方浸膏粉進(jìn)行了組分制備。載樣方法為干粉進(jìn)樣，提取物樣品與C18硅膠（40～63 μm，ZEO prep 90）混合，研缽中研磨至混合均勻。進(jìn)樣空柱中少許細(xì)沙墊底，裝入混合樣品的硅膠，細(xì)沙于上層鋪滿，封裝，接入裝置。根據(jù)按照液相位移時(shí)間將冠心寧片分成36個(gè)組分。見(jiàn)圖2。收集組分濃縮，氮?dú)獯蹈桑鋬鰞?chǔ)存。

2.2 冠心寧片的活性組分定性及定量篩選 盡管冠心寧片在治療血栓性疾病方面取得了積極的臨床結(jié)果[5]，且課題組前期工作也驗(yàn)證了隱丹參酮和洋川芎內(nèi)酯Ⅰ間的協(xié)同抗血栓活性，但注意到洋川芎內(nèi)酯Ⅰ和隱丹參酮配伍效果遠(yuǎn)低于全方，提示還存在著其他抗凝血藥效活性物質(zhì)[7]。因此，本研究將使用PHZ誘導(dǎo)的斑馬魚血栓模型，分別驗(yàn)證各個(gè)組分是否對(duì)血栓病癥具有保護(hù)效果。以每組劑量為500 μg/mL進(jìn)行組分驗(yàn)證，30 μg/mL阿司匹林為陽(yáng)性藥物。將36個(gè)組分篩選完畢后，除因胚胎毒性篩選失敗的組分外，根據(jù)對(duì)照組的血細(xì)胞數(shù)目，按照目測(cè)血流流速，分為Mild-normal（正常或輕微減慢）;Moderate（中度減慢：血流無(wú)法連貫成線）和Severe（嚴(yán)重減慢：血流停滯或只有零星細(xì)胞流動(dòng)）3檔，來(lái)描述各組分抗血栓治療的效果。見(jiàn)圖3A。

根據(jù)定性描述各組分治療效果的結(jié)果，選擇治療效果高于60%水平線，篩選出保護(hù)率較高的組分02，組分04，組分23，組分24。進(jìn)一步對(duì)這4個(gè)組分的血細(xì)胞流速進(jìn)行定量統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)這些組分對(duì)血栓模型中紅細(xì)胞流速均有顯著回調(diào)作用，其中水溶性組分（02）的保護(hù)效果最佳。見(jiàn)圖3B，3C。因此，本研究選擇冠心寧片水溶性組分（以下簡(jiǎn)稱GXN02）作為研究對(duì)象，探索其對(duì)抗血栓作用的效果及可能作用機(jī)制。

2.3 冠心寧片水溶性組分的量效研究 進(jìn)一步對(duì)GXN02組分進(jìn)行量效研究，設(shè)置濃度梯度給藥：1 μg/mL，10 μg/mL，100 μg/mL，250 μg/mL，500 μg/mL，750 μg/mL，1000 μg/mL;并使用30 μg/mL阿司匹林為陽(yáng)性藥物組。通過(guò)熒光顯微成像定量分析紅細(xì)胞，觀察到GXN02保護(hù)的胚胎出現(xiàn)明顯的血流恢復(fù)現(xiàn)象，其中500 μg/mL預(yù)保護(hù)組的抑制紅細(xì)胞聚集效果最佳。見(jiàn)圖4A，4B。

2.4 丹參多糖和川芎多糖對(duì)血栓治療具有顯著效果 因多糖類物質(zhì)在冠心寧片水溶性組分中含量較高[7]，結(jié)合冠心寧片由丹參和川芎藥材構(gòu)成，推測(cè)丹參多糖（SMP）和川芎多糖（LP）可能是GXN02的主要成分，擬進(jìn)一步探索這2種化合物的藥理效果。丹參多糖被報(bào)道具有心臟保護(hù)[11]、免疫調(diào)節(jié)[12]、抗氧化[13]、抗糖尿病[14]和抗纖維化[15]等作用;川芎多糖具有抗氧化[16]，抗癌，抗菌活性[17]。本研究在PHZ刺激前加入24 h丹參多糖（250 μg/mL，100 μg/mL）和川芎多糖（250 μg/mL，100 μg/mL）預(yù)保護(hù)，通過(guò)熒光顯像定量分析紅細(xì)胞活動(dòng)情況，以評(píng)價(jià)其對(duì)內(nèi)源性血液循環(huán)的影響。同時(shí)設(shè)置30 μg/mL阿司匹林陽(yáng)性藥組，1 mg/mL冠心寧片全方組，及500 μg/mL和250 μg/mL GXN02組作為比較，觀察到2種多糖保護(hù)的胚胎均有明顯的血流恢復(fù)。見(jiàn)圖5A，圖5B。進(jìn)一步使用O-dianisidine進(jìn)行血紅蛋白染色，發(fā)現(xiàn)PHZ誘導(dǎo)后心臟部位血流量顯著減少（黑色虛線框處），而阿司匹林，GXN02，丹參多糖和川芎多糖治療后回心血量明顯恢復(fù)。上述結(jié)果提示丹參多糖和川芎多糖具有抗血栓活性。見(jiàn)圖5C。

2.5 丹參多糖和川芎多糖的抗血栓活性具有協(xié)同增效作用 基于中醫(yī)配伍理論，丹參和川芎可能存在協(xié)同增效關(guān)系。由于丹參多糖來(lái)源于丹參，川芎多糖來(lái)源于川芎，于是本課題進(jìn)一步探討丹參多糖和川芎多糖是否具有協(xié)同增效作用，將丹參多糖與川芎多糖進(jìn)行搭配。分別搭配50 μg/mL丹參多糖和川芎多糖，100 μg/mL丹參多糖和川芎多糖，250 μg/mL丹參多糖和川芎多糖。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示二者聯(lián)合作用時(shí)比單一作用表現(xiàn)出更好的效果，尤其發(fā)現(xiàn)在100 μg/mL濃度中二者間存在顯著協(xié)同作用（CI=0.7816），50 μg/mL（CI=0.9307）和250 μg/mL（CI=1.1458）濃度中也顯示這一趨勢(shì)。見(jiàn)圖6A，6B，6C。

2.6 丹參多糖和川芎多糖對(duì)PHZ誘導(dǎo)的氧化損傷的抑制作用 DCFH-DA是檢測(cè)細(xì)胞氧化應(yīng)激標(biāo)志物H2O2、ROS和RNS的特異性熒光探針，可以表現(xiàn)斑馬魚胚胎氧化應(yīng)激水平。在PHZ孵育后，DCFH-DA信號(hào)明顯增強(qiáng)，而GXN02和丹參多糖預(yù)保護(hù)后，斑馬魚ROS的水平顯著降低，這說(shuō)明它們具有抗氧化作用。見(jiàn)圖7A，7B。進(jìn)一步通過(guò)丙二醛（MDA）分析研究多糖對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化的影響。PHZ刺激后，內(nèi)源性MDA濃度升高，冠心寧片全方浸膏粉預(yù)培養(yǎng)可有效抑制其升高。丹參多糖和川芎多糖都表現(xiàn)出抑制趨勢(shì)，而丹參多糖相對(duì)效果更為顯著。見(jiàn)圖7C。

綜上所述，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)冠心寧片水溶性組分及丹參多糖和川芎多糖均具有抗氧化作用，而同濃度下丹參多糖作用更強(qiáng)。上述結(jié)果提示丹參多糖和川芎多糖可能通過(guò)調(diào)控氧化應(yīng)激及脂質(zhì)過(guò)氧化水平緩解血栓形成。

3 討論

血栓形成的原因有很多，動(dòng)脈血栓形成的主要誘因是動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的破裂，包括到血管內(nèi)皮細(xì)胞破壞、斑塊破裂及炎癥反應(yīng)等。靜脈血栓形成可由多因素引發(fā)，包括血流異常、血液本身屬性改變及內(nèi)皮細(xì)胞的改變等。與動(dòng)脈血栓不同，在不少靜脈血栓形成過(guò)程中，其血管內(nèi)皮層可保持完整，但可以從具有抗凝血特性的表面轉(zhuǎn)化為具有促凝血特性的表面氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過(guò)氧化物水平的升高是血栓形成的重要病理因素，同時(shí)也是PHZ誘導(dǎo)動(dòng)物損傷模型的重要機(jī)制[18]。PHZ的氧化導(dǎo)致產(chǎn)生超氧自由基、過(guò)氧化氫和其他氧化物質(zhì)，這些物質(zhì)會(huì)損傷內(nèi)皮細(xì)胞和紅細(xì)胞膜，最終導(dǎo)致血栓形成和溶血[19]。本研究采用苯肼刺激斑馬魚胚胎構(gòu)建血栓模型。斑馬魚與人類遺傳保守性高，并且同樣有凝血因子、血小板受體等。早期斑馬魚胚胎的透皮吸氧能力可以使其在沒(méi)有血液循環(huán)的情況下長(zhǎng)期存活。并且，結(jié)合紅細(xì)胞熒光標(biāo)記轉(zhuǎn)基因斑馬魚，可在體內(nèi)動(dòng)態(tài)觀測(cè)胚胎外周循環(huán)中血流情況，因此在藥物篩選中具有優(yōu)勢(shì)。

目前，天然產(chǎn)物和中草藥作為抗血栓藥物的潛在來(lái)源已經(jīng)引起了人們的廣泛關(guān)注。根據(jù)中醫(yī)理論，丹參的主要功能是活血化瘀，川芎具有活血開(kāi)郁行氣、祛風(fēng)燥濕止痛之功效。在化合物水平上，課題組前期研究確證了冠心寧片中隱丹參酮和洋川芎內(nèi)酯Ⅰ的抗血栓作用以及它們的協(xié)同增效作用[7]，機(jī)制上通過(guò)氧化應(yīng)激、血小板活化和凝血級(jí)聯(lián)等多種信號(hào)通路，在不同水平上協(xié)同調(diào)控動(dòng)物模型的血栓形成等。然而，冠心寧片中的其他成分，如包括多糖等水溶性物質(zhì)是否具有抗血栓方面的藥理活性尚不清楚。

本研究提示丹參多糖和川芎多糖在斑馬魚模型中具有抗血栓活性。通過(guò)結(jié)合基于熒光顯微成像的活體動(dòng)態(tài)視頻拍攝及血紅蛋白染色，我們通過(guò)定性及定量分析驗(yàn)證了丹參多糖和川芎多糖的抗血栓活性，且二者合用后，其抗血栓活性進(jìn)一步增強(qiáng)，提示二者之間具有協(xié)同增效作用。既往研究提示這2種多糖具有若干藥理活性。Wang等[20]使用小鼠模型發(fā)現(xiàn)了丹參多糖可以增強(qiáng)益生菌LB的功能，可用于高脂血癥治療。Han等[21]基于四氯化碳誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷模型，發(fā)現(xiàn)丹參多糖可以防止肝損傷。Chen等[22]基于腫瘤患者外周血T淋巴細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)，認(rèn)為丹參多糖通過(guò)激活TLRs、MAPK和核因子κB信號(hào)通路，可以增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化能力。Geng等[23]通過(guò)抑制H2O2誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞線粒體功能失調(diào)、Caspase3級(jí)聯(lián)失活和增強(qiáng)抗氧化能力，說(shuō)明了丹參多糖在體外可能具有心血管作用藥效。Wang等[24]基于H2O2處理的斑馬魚模型，認(rèn)為川芎多糖具有強(qiáng)大的抗氧化活性和良好的自由基清除能力。氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過(guò)氧化物水平的升高是促血液凝固和血栓的重要病理因素[25]，也是PHZ誘導(dǎo)動(dòng)物損傷模型的重要病理機(jī)制。本研究使用細(xì)胞氧化應(yīng)激標(biāo)志物H2O2、ROS的特異性熒光探針DCFH-DA，也發(fā)現(xiàn)了多糖組分通過(guò)調(diào)控氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過(guò)氧化物水平，這有可能與其抗血栓活性相關(guān)。

綜上所述，本研究基于斑馬魚血栓模型采用活體熒光顯微成像，發(fā)現(xiàn)了冠心寧片水溶性組分的抗血栓活性，且丹參多糖和川芎多糖具有協(xié)同抗血栓作用，其抗氧化應(yīng)激活性可能與抗血栓相關(guān)。最后，本研究還存在一些局限性。例如，冠心寧的2種多糖成分并沒(méi)有確證的化學(xué)結(jié)構(gòu)，由于材料受限，我們只獲得了純度為60%的丹參多糖和川芎多糖，不排除其他混雜因素對(duì)結(jié)果的干擾作用。此外，這2種多糖的具體抗血栓作用機(jī)制及下游作用靶點(diǎn)還需要進(jìn)一步闡明。

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（2021-10-25收稿 責(zé)任編輯：王明）