柴保國，陳佩格，韓 露，高貴超，崔俊亞，李登云

（1.河南牧翔動(dòng)物藥業(yè)有限公司，河南 鄭州 450000；2.河南省畜牧總站）

黃芪、防風(fēng)和白術(shù)是常用的中醫(yī)藥材，這三味藥組成又稱玉屏風(fēng)散，是治療氣虛感冒的代表方劑。黃芪能夠調(diào)節(jié)血壓、增強(qiáng)免疫功能，白術(shù)能夠健脾胃，降血糖，而防風(fēng)有消炎鎮(zhèn)痛等作用，防風(fēng)配合著黃芪、白術(shù)，能夠健脾去濕，對(duì)于疾病有防范作用，同時(shí)還能夠治療感冒。絞股藍(lán)又名七葉膽，五葉參，具有降血脂，調(diào)血壓，防治血栓，防治心血管疾患，調(diào)節(jié)血糖，促睡眠，緩衰老，抗癌，提高免疫力等特點(diǎn)。

中藥發(fā)酵是指在微生態(tài)學(xué)理論指導(dǎo)下，將中藥研究與微生物發(fā)酵技術(shù)相結(jié)合，利用微生物強(qiáng)大的代謝和繁殖能力，以中草藥物或提取物（液）為基質(zhì)使有機(jī)物分解的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)過程。在中藥發(fā)酵過程中，菌種的選育是中藥發(fā)酵的關(guān)鍵。目前在多數(shù)實(shí)驗(yàn)研究中，多采用枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、植物乳桿菌等，但枯草芽孢桿菌對(duì)不同的中藥發(fā)酵效果也有所不同。根據(jù)李國紅等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在經(jīng)枯草芽孢桿菌發(fā)酵后，部分中藥的發(fā)酵產(chǎn)物抗菌活性增加，而部分中藥的發(fā)酵產(chǎn)物抗菌活性卻有所降低。凝結(jié)芽孢桿菌是兼性厭氧菌，具備高抗逆性、強(qiáng)黏附性、分泌消化酶、產(chǎn)抑菌物質(zhì)、易于培養(yǎng)與貯存穩(wěn)定等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，現(xiàn)已被農(nóng)業(yè)農(nóng)村部列為可直接飼用于畜禽生產(chǎn)的新型飼料添加劑。因此，凝結(jié)芽孢桿菌是目前畜牧業(yè)研究和應(yīng)用的熱點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 藥材和菌種

黃芪、白術(shù)、防風(fēng)、絞股藍(lán)購自河北省安國市永益中藥材有限公司，經(jīng)河南省牧翔動(dòng)物藥業(yè)有限公司質(zhì)管部檢驗(yàn)為正品。凝結(jié)芽孢桿菌（含量為20 億cfu/g），購自山東康地恩生物科技有限公司。

1.2 主要試劑

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、蛋白胨、葡萄糖、酵母浸出物，均購自北京奧博星生物科技有限公司；人參皂苷Rb1，購自中國藥品生物制品檢定所；淀粉和玉米粉購自農(nóng)貿(mào)市場；硫酸銨，購自上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 凝結(jié)芽孢桿菌的復(fù)蘇與培養(yǎng)

將保存的凝結(jié)芽孢桿菌菌種接種到種子斜面培養(yǎng)基，活化培養(yǎng)。取活化的菌種接種到50 mL（250 mL 三角瓶）營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃，180r／min，培養(yǎng)24 h后備用。

1.4 復(fù)方中藥發(fā)酵條件優(yōu)化

采用單向透氣閥袋固體發(fā)酵方法對(duì)復(fù)方中藥黃芪、白術(shù)、防風(fēng)、絞股藍(lán)進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵室溫度控制在30 ℃，濕度≤50%，考察不同碳源、氮源及發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵進(jìn)程的影響。

1.4.1 最佳發(fā)酵碳源篩選

凝結(jié)芽孢桿菌可以分解淀粉，因此選擇以葡萄糖、淀粉和玉米粉作為備選碳源，考察不同碳源在不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵進(jìn)程的影響。通過測(cè)定發(fā)酵后凝結(jié)芽孢桿菌數(shù)量，選擇最佳發(fā)酵碳源及發(fā)酵時(shí)間。

1.4.2 最佳發(fā)酵氮源篩選

選擇以硫酸銨、酵母浸出物及蛋白胨分別作為氮源，考察不同氮源在不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵進(jìn)程的影響。通過測(cè)定發(fā)酵后凝結(jié)芽孢桿菌數(shù)量，選擇最佳發(fā)酵氮源及發(fā)酵時(shí)間。

1.5 發(fā)酵前后有效成分檢測(cè)

按比例分別稱取復(fù)方中藥和最優(yōu)發(fā)酵體系發(fā)酵的復(fù)方中藥樣品100 g，各加10倍量水煎煮40 min，離心取上清液濃縮定容至400 mL，分別進(jìn)行高效液相色譜法檢測(cè)絞股藍(lán)皂苷含量變化和紫外分光光度計(jì)法檢測(cè)總多糖含量變化。

早期中立評(píng)估(Early Neutral Evaluation，簡稱ENE)作為一種非訴訟糾紛解決方式，是近年來國際上興起的一種司法ADR制度。與民間ADR不同，司法ADR又稱法院附設(shè)ADR，是指以法院為主持機(jī)構(gòu)或者受法院指導(dǎo)，但與訴訟程序截然不同的具有準(zhǔn)司法性質(zhì)的訴訟外糾紛解決程序。〔9〕

分別取適量的發(fā)酵前后提取液，加乙醇靜置24 h后離心，收集沉淀加適量蒸餾水溶解稀釋，然后進(jìn)行二次醇沉，最后收集沉淀且烘干至恒重后使用蒸餾水溶解稀釋，制成樣品溶液。以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，采用苯酚-硫酸法，取2 mL樣品溶液在490 nm處測(cè)定吸收度，計(jì)算。

1.6 絞股藍(lán)皂苷含量變化檢測(cè)

絞股藍(lán)中含有50多種皂苷，其中Ⅲ、Ⅳ、Ⅶ、Ⅻ分別與人參皂苷Rb1、Rb2、Rd、F2 為同一物質(zhì)，該研究以人參皂苷Rb1為對(duì)照品，采用高效液相色譜法檢測(cè)發(fā)酵前后提取液中絞股藍(lán)皂苷的含量變化。

高效液相色譜條件為，色譜柱：C18反相色譜柱（粒徑5 m，250 mmx4.6 mm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸溶液（32∶68）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長：203 nm；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：10 uL。樣品中人參皂苷Rb1 的含量（X1）以質(zhì)量分?jǐn)?shù)（%）表示，計(jì)算方式為：X1=（P1×m2×n1）/（P2×m1×n2）×100%。其中P1 為樣品溶液峰面積值；m2 為標(biāo)準(zhǔn)品稱樣質(zhì)量（g）；n1為樣品稀釋倍數(shù)；P2為標(biāo)準(zhǔn)品溶液峰面積值；m1為樣品稱樣質(zhì)量（g）；n2為標(biāo)準(zhǔn)品稀釋倍數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵時(shí)間優(yōu)化

不同碳源在不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌數(shù)量的影響結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，葡萄糖、淀粉及玉米粉作為碳源時(shí)，凝結(jié)芽孢桿菌的數(shù)量隨著發(fā)酵時(shí)間的增加呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，其中凝結(jié)芽孢桿菌的數(shù)量在發(fā)酵48 h時(shí)達(dá)到高峰。在發(fā)酵48 h時(shí)，用玉米粉發(fā)酵的凝結(jié)芽孢桿菌數(shù)量明顯比用葡萄糖和淀粉發(fā)酵的數(shù)量高，呈差異性顯著，所以在發(fā)酵時(shí)間為48 h時(shí)，最佳發(fā)酵碳源為玉米粉。

圖1 不同碳源在不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌數(shù)量的影響

不同氮源在不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌數(shù)量的影響結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，硫酸銨、酵母浸出物及蛋白胨作為氮源時(shí)，凝結(jié)芽孢桿菌的數(shù)量隨著發(fā)酵時(shí)間的增加呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，其中凝結(jié)芽孢桿菌的數(shù)量在發(fā)酵48 h時(shí)達(dá)到高峰。在發(fā)酵48 h時(shí)，用蛋白胨發(fā)酵的凝結(jié)芽孢桿菌數(shù)量明顯比用酵母浸出物和硫酸銨發(fā)酵的數(shù)量高，呈差異性顯著，所以在發(fā)酵時(shí)間為48 h時(shí)，最佳發(fā)酵氮源為蛋白胨。

圖2 不同氮源在不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌數(shù)量的影響

2.2 發(fā)酵產(chǎn)物有效成分檢測(cè)

發(fā)酵前后皂苷含量的變化如圖3所示。由圖3可知，相較發(fā)酵前，發(fā)酵后絞股藍(lán)皂苷的含量大大提高，呈差異性極顯著。說明凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵可以降解藥材中的纖維素，促進(jìn)復(fù)方中藥的有效成分溶出。

圖3 發(fā)酵前后皂苷含量的變化

發(fā)酵前后多糖含量的變化如圖4所示。由圖4可知，相較發(fā)酵前，發(fā)酵后總多糖的含量大大提高，呈差異性顯著。說明凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵可以分解藥材的細(xì)胞壁，促使多糖從細(xì)胞壁或者蛋白復(fù)合體中游離出來。

圖4 發(fā)酵前后多糖含量的變化

3 討論

為確保食品安全、降低耐藥性風(fēng)險(xiǎn)及抗生素殘留造成的危害，世界各國紛紛在食品動(dòng)物飼養(yǎng)過程中實(shí)行“減抗”、“禁抗”政策，研究開發(fā)新型抗生素替代產(chǎn)品以減少抗生素的使用是一條可行之路。

發(fā)酵中獸藥作為一種新型抗生素替代產(chǎn)品，成為目前畜牧業(yè)研究的熱點(diǎn)。該研究通過單因素試驗(yàn)法采用凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)中藥復(fù)方進(jìn)行固體發(fā)酵，摸索凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵中藥的最佳碳源為玉米粉，與李登云、崔東良等研究結(jié)果一致；最佳氮源為蛋白胨，最優(yōu)發(fā)酵時(shí)間為48 h。

黃芪、白術(shù)、防風(fēng)及絞股藍(lán)作為一種提升機(jī)體免疫力的中藥組方，其發(fā)揮功能的主要有效成分是多糖類和皂苷類物質(zhì)。該研究通過檢測(cè)發(fā)酵前后多糖類和皂苷類的含量變化，研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后可有效提高多糖及皂苷等有效成分的溶出，為后期發(fā)酵復(fù)方中藥在臨床中應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

4 小結(jié)

通過用凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)復(fù)方中藥進(jìn)行發(fā)酵，摸索發(fā)酵最佳碳源、氮源及發(fā)酵時(shí)間，并檢測(cè)發(fā)酵前后凝結(jié)芽孢桿菌含量及總多糖、絞股藍(lán)皂苷含量的變化。試驗(yàn)結(jié)果表明：最佳發(fā)酵碳源為玉米粉，最佳發(fā)酵氮源為蛋白胨，最優(yōu)發(fā)酵時(shí)間為48 h。該發(fā)酵條件下，凝結(jié)芽孢桿菌含量增加，發(fā)酵的復(fù)方中藥有效成分總多糖及絞股藍(lán)皂苷含量增加?！?/p>