張賀蕾，陳 芬，馬 麗，劉 博

（1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 宿遷農(nóng)科所，江蘇 宿遷 223800；2.大連海洋大學(xué) 海洋科技與環(huán)境學(xué)院，遼寧 大連 116023）

萱草（Hemerocallis fulva），又稱鹿箭、忘憂草、金針等，為三大宿根花卉之一，是阿?；疲ˋsphodelaceae）萱草屬（Hemerocallis）多年生宿根草本植物。其品種種類繁多，花色豐富多彩，花型千變?nèi)f化，適應(yīng)性強(qiáng)，喜陽光又耐半陰，喜干旱又耐濕潤，集觀花、觀葉于一體，有極高的觀賞價值和生態(tài)價值，是園林綠化及家庭園藝的優(yōu)良植物。萱草屬植物有20 余種，主要分布于中歐及東亞，原產(chǎn)于我國的約有11 種[1]。隨著我國大力推廣生態(tài)型節(jié)約型的園林綠化理念，宿根花卉在園林中廣泛應(yīng)用[2]，作為“宿根之王”的萱草以行植、叢植、群植的配置方式大量栽植于花境、花壇中，可以營造空間層次感，使園林景觀更具柔和協(xié)調(diào)之美。

近年來，學(xué)者主要對萱草屬植物的細(xì)胞學(xué)、分類學(xué)[3]、雜交育種、遺傳多樣性和親緣關(guān)系等方面進(jìn)行研究，如黃花花[4]以大花萱草品種金娃娃、吉星、紅運(yùn)、黃繡客、太谷紅和香寶進(jìn)行不同品種間雜交，結(jié)果表明，不同大花萱草品種間雜交親和性差異很大，切割柱頭和花蕾期授粉均可提高常規(guī)雜交親和性。高超利[5]利用大花萱草品種金娃娃、紅寶雜交，雜交后代有一定程度的進(jìn)化現(xiàn)象。趙珺[6]將重瓣魏河作為母本與盛夏的酒紅、回復(fù)、粉邊玫紅進(jìn)行雜交，發(fā)現(xiàn)雜交后代的花瓣數(shù)量出現(xiàn)了分離現(xiàn)象，且廣義遺傳力均大于0.9，重瓣性狀的遺傳變異與環(huán)境無關(guān)，而是與遺傳效應(yīng)有關(guān)。目前，美國利用我國和日本原產(chǎn)的萱草已培育出了8 萬多個形態(tài)各異[7]、顏色豐富、觀賞性高的品種。我國的萱草品種大部分是國外培育出來的[8]，這與我國是萱草資源大國不符。新品種育種工作進(jìn)展較為緩慢的原因主要與萱草染色體倍性、花粉活力及柱頭可授性有關(guān)。大花萱草，尤其是重瓣萱草多數(shù)為雄蕊瓣化，由于花粉敗育，雜交結(jié)實(shí)率非常低。

在干燥條件下，花藥開裂攜帶具有活力的雄配子或其前體花粉粒到達(dá)適宜的接受柱頭即為傳粉過程，所以花粉的活力與柱頭的可授性是保證其受精的重要因素[9]。本試驗(yàn)通過3 個大花萱草品種間雜交，探究親本花粉活力和柱頭可授性以及雜交后代的形態(tài)特征，以期提高雜交結(jié)實(shí)率，同時為今后培育更多的重瓣萱草品種提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料與組合配制

試驗(yàn)于2014年6月，晴天9：00 在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院宿遷農(nóng)科所院內(nèi)試驗(yàn)地進(jìn)行，以北京植物園基地與虹越園藝家引進(jìn)的酒紅341、寶貝的眼睛作為母本，蕾絲方巾作為父本進(jìn)行正、反交，配制4 組雜交組合，每個組合授粉30 朵花。

以雜交后獲得的F1群體作為研究對象，將F1群體采用分株繁殖栽培，每個株系分割成3 株，每株距離為20 cm 左右，行距25 cm 左右，并標(biāo)號。采用正常的水肥管理方法，定期除草，使其始終保持干凈的生長環(huán)境。

1.2 花粉活力檢測

花粉活力測定試驗(yàn)采用的是液體培養(yǎng)法，花粉活力高低以花粉萌發(fā)率作為衡量標(biāo)準(zhǔn)[10]。具體方法：于8：00、9：00、10：00、11：00、12：00、14：00 和16：00[11]用小刷子從酒紅341、寶貝的眼睛、蕾絲方巾的花藥中刮下散發(fā)出的成熟花粉，將其充分混勻，參照焦雪輝等[12]篩選的蔗糖50 g/L+硼酸30 mg/L+氯化鈣40 mg/L 作為適宜花粉培養(yǎng)液，用移液槍將培養(yǎng)液滴于載玻片上，并放置于墊有濕濾紙的培養(yǎng)皿中，隨后于25 ℃的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 h 后在顯微鏡（解剖鏡）上觀察花粉的萌發(fā)情況。萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)以花粉管長度超過花粉直徑為依據(jù)，花粉活力計(jì)算公式為

1.3 柱頭可授性測定

采用聯(lián)苯胺-過氧化氫法測定柱頭可授性[13]。試驗(yàn)材料選用酒紅341、寶貝的眼睛、蕾絲方巾3 個品種，每個品種分別于開花前一天9：00，開花當(dāng)天9：00、12：00、15：00，開花后一天9：00[14]采取10 個柱頭，將去掉花柱的柱頭浸泡在有聯(lián)苯胺-過氧化氫反應(yīng)液（1%聯(lián)苯胺∶3%過氧化氫∶水=4∶11∶22）的培養(yǎng)皿中，浸泡5 min 后置于Motic BA 400 光學(xué)顯微鏡下觀察柱頭情況。根據(jù)聯(lián)苯胺溶液呈色情況以及是否有氣泡產(chǎn)生確定柱頭可授性等級[15-16]，分級標(biāo)準(zhǔn)為：0 級，不變色，無氣泡產(chǎn)生，無可授性；1 級，輕微變色，有幾個氣泡，具有輕微可授性；2 級，呈淺藍(lán)色，有較少氣泡，具有低可授性；3 級，呈淺藍(lán)色，有較多氣泡，具有較低可授性；4 級，呈藍(lán)色，有大量連續(xù)小氣泡，具有高可授性；5 級，呈深藍(lán)色，有連續(xù)大氣泡，具有高可授性。

1.4 表型性狀觀測

選取開花正常、發(fā)育健全、生長健壯的F1群體作為研究對象，根據(jù)2014年中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測試指南——萱草屬》對其葉叢、葉片、花葶、花、內(nèi)外花被片等表型性狀進(jìn)行觀察與測定。調(diào)查時間為2021年6月1日—7月1日，每個株系選取完全開放的花朵，用卷尺、游標(biāo)尺測定表型性狀指標(biāo)并賦值（表1）。

表1 萱草的表型性狀測定標(biāo)準(zhǔn)與方法

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2003 和SPSS 25 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對花粉活力和柱頭可授性以及描述性統(tǒng)計(jì)進(jìn)行分析，并計(jì)算變異系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同采集時間花粉活力檢測結(jié)果

由圖1、表2 可知，栽培的單瓣萱草品種酒紅341、寶貝的眼睛在9：00—12：00 花粉萌發(fā)率較高，隨后呈現(xiàn)下降趨勢，花粉平均萌發(fā)率分別為39.2%、34.1%；重瓣萱草品種蕾絲方巾在8：00—11：00有較高的花粉萌發(fā)率，隨后呈現(xiàn)下降趨勢，且下降幅度較大，花粉平均萌發(fā)率為11.0%。3 個萱草品種在9：00 的花粉萌發(fā)率高于其他時間段；重瓣萱草品種蕾絲方巾花粉萌發(fā)率低于單瓣萱草品種酒紅341、寶貝的眼睛。

表2 不同萱草品種花粉的萌發(fā)率 單位：%

2.2 不同采集時間柱頭可授性檢測結(jié)果

由圖2、表3 可知，萱草的柱頭可授性受不同采集時間的影響，3 種萱草品種均在開花當(dāng)天9：00 具有相對較強(qiáng)的柱頭可授性。寶貝的眼睛柱頭可授性持續(xù)時間較長，到開花當(dāng)天15：00 仍有較強(qiáng)的可授性；開花前一天9：00 酒紅341、寶貝的眼睛柱頭可授性高于蕾絲方巾。3 種萱草品種的柱頭可授性均在開花后一天很弱甚至沒有，與萱草單朵花花期僅有一天契合。

表3 不同采集時間萱草品種柱頭的可授性結(jié)果

圖2 不同采集時間不同萱草品種柱頭可授性觀察情況

2.3 不同雜交組合的坐果率

由表4 可知，雜交組合寶貝的眼睛×蕾絲方巾的成活率、發(fā)芽率、坐果率均最高，分別為90.91%、86.67%、33.33%；重瓣萱草蕾絲方巾作為母本進(jìn)行雜交不結(jié)果。在后續(xù)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，施用一定配比的肥料可以提高重瓣萱草作為母本的結(jié)實(shí)率，但是相對結(jié)實(shí)率還是比較低，可能與開花本身需要消耗大量營養(yǎng)物質(zhì)有關(guān)，從而影響坐果發(fā)育。

表4 萱草雜交組合的坐果率

2.4 F1 群體表型性狀及聚類分析

2.4.1 F1群體表型性狀 對F1群體17 個株系（圖3）的葉叢、葉片、花葶、花、內(nèi)外花被片等23 個表型性狀進(jìn)行調(diào)查。由表5 可知，葉叢姿態(tài)半直立16 份、斜伸1 份；葉色淺綠色3 份、綠色7 份、深綠色7 份；花葶均有分枝；花均有苞片，花形狀圓形16 份、三角形1 份，花型杯型7 份、喇叭型10 份，重瓣4 份、單瓣13 份，顏色數(shù)量1 種3 份、2 種7 份、3 種5 份、4 種2 份，花眼綠色15 份、黃色2 份；外花被片花色按色系分6 組：第Ⅰ組為紅色色系5 份、第Ⅱ組為橙紅色系4 份、第Ⅲ組為橙色系1 份、第Ⅳ組為黃色系5 份、第Ⅴ組為紫紅色系1 份、第Ⅵ組為黃橙色系1 份，外花被片有斑2 份、無斑15 份，有邊緣波皺13 份、無邊緣波皺4 份，有花肋13 份、無花肋4 份，花肋顏色白色3 份、黃色10 份、無色4 份；內(nèi)花被片無反卷3 份、反卷程度弱8 份、反卷程度中6 份，內(nèi)花被片有斑8 份、無斑9 份，邊緣均有波皺，波皺程度弱6份、中8 份、強(qiáng)3 份，均無彩緣，均有花肋，花肋顏色白色11 份、黃色6 份。

表5 雜交F1群體表型性狀

圖3 雜交F1 群體

2.4.2 表型性狀聚類分析 對23 個表型性狀采用類平均法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，運(yùn)用歐氏距離作為間距對調(diào)查數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析。由圖4 可以看出，在歐氏距離25 處可以將F1群體17 個株系和3 個親本萱草品種分為兩大類型。1-1、1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7 和親本蕾絲方巾、酒紅341 為第Ⅰ類型，其特點(diǎn)為葉片偏長，平均為60.4 cm；花型均為杯型，花眼均為綠色；外花被片均無斑，外花被片有花肋的前提下，花肋顏色為白色。2-1、2-2、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7、2-8、2-9、2-10 和親本寶貝的眼睛為第Ⅱ類型，其特點(diǎn)花型均為喇叭型，外花被片均有邊緣波皺，外花被片花肋顏色均為黃色。

圖4 F1 群體17 個株系聚類分析

親緣關(guān)系遠(yuǎn)近可以通過遺傳距離大小呈現(xiàn)。按親本的不同，群體材料被分為兩大類：第Ⅰ類，按親緣遠(yuǎn)近可以分為3 個小類群，其中，1-1、1-4、1-5 可以歸為一類，花系均為黃色系，外花被片均有花肋，為白色；內(nèi)花被片反卷弱，邊緣波皺弱；開花日期相近；花直徑中等，花眼、外花被片花肋顏色、內(nèi)花被片反卷程度均與母本酒紅341 相同，內(nèi)外花被片均無斑；1-2、1-3、1-6 歸為一類，株高偏矮小，平均株高42.4 cm，葉片深綠色，外花被片均無花肋，內(nèi)花被片均無反卷，邊緣波皺程度中等偏上；1-2、1-3 與父本蕾絲方巾類似，花形狀、花型、葉片綠色程度均與父本相同；1-7 植株相對高大，葉叢斜伸，內(nèi)花被片有花肋，為黃色，生長旺盛。第Ⅱ類，按親緣遠(yuǎn)近可以分為5 個小類群，表型性狀與母本寶貝的眼睛類似；2-1、2-2 可以歸為一類，花色均為橙紅色系，花眼均為黃色，植株高大，平均株高62.9 cm，葉叢直徑較大，葉片繁多；2-8、2-9、2-10 歸為一類，葉片深綠色，花色偏深，內(nèi)花被片邊緣波皺程度中等；2-6 花重瓣，葉片綠色，花顏色較為豐富，內(nèi)花被片反卷程度中等；2-4、2-5、2-7 歸為一類，葉片淺綠色，內(nèi)花被片反卷弱，邊緣波皺程度中等偏強(qiáng)；2-3 花朵形狀為三角形，植株高大，內(nèi)花被片花肋明顯。

2.4.3 F1群體表型性狀的遺傳變異 由表6 可知，以酒紅341 作為母本、蕾絲方巾作為父本及蕾絲方巾作為母本、酒紅341 作為父本，雜交的F1個體之間表現(xiàn)的性狀各不相同，存在一定的變異。標(biāo)準(zhǔn)差最大的是葉叢直徑，最小的是花葶粗度；變異系數(shù)為12.31%～47.37%，變異系數(shù)最小的是葉片長度，變異系數(shù)最大的是花葶粗度，其次為著花密度。

表6 F1 群體表型性狀的描述性統(tǒng)計(jì)

10 個表型性狀均近正態(tài)單峰分布，符合數(shù)量性狀特點(diǎn)?；ㄝ愦侄绕群头宥染笥?，著花密度的峰度大于1，呈現(xiàn)明顯正偏性和極端值，其余8 個表型性狀峰度和偏度絕對值均小于1。

3 討論

花粉活力是雜交育種的關(guān)鍵因素，是植物有性繁殖的基礎(chǔ)要素，最適宜的授粉時間與花粉的萌發(fā)率、萌發(fā)時間直接相關(guān)[17]。本試驗(yàn)中，花粉活力最高的是酒紅341，平均萌發(fā)率為39.2%；最低的是蕾絲方巾，平均萌發(fā)率為11.3%；二者均在14：00 后花粉活力呈現(xiàn)下降趨勢。酒紅341、寶貝的眼睛萌發(fā)率整體高于蕾絲方巾。

柱頭可授性對開花不同階段傳粉成功率、自花傳粉率、各傳粉者相對重要性有很大程度的影響，是傳粉過程中必不可少的因素[18]。不同萱草品種在不同時期的柱頭可授性結(jié)果不同，3 種萱草品種均在開花當(dāng)天9：00 具有相對較強(qiáng)的柱頭可授性；寶貝的眼睛柱頭可授性可持續(xù)到開花當(dāng)天15：00；3 種萱草品種的柱頭可授性均在開花后一天很弱，甚至沒有；重瓣萱草品種蕾絲方巾與單瓣萱草品種酒紅341、寶貝的眼睛花期只有一天契合。為了提高雜交結(jié)實(shí)率，可以根據(jù)萌發(fā)時間和柱頭可授性確認(rèn)雜交授粉時間。重瓣萱草品種蕾絲方巾、單瓣萱草品種酒紅341、寶貝的眼睛最適宜授粉時間均為9：00，此時花粉散發(fā)與柱頭可授性最強(qiáng)時間一致，花粉與柱頭有足夠的時間完成受精，重瓣萱草蕾絲方巾可以通過二次授粉的方式促進(jìn)雜交育種，為萱草雜交育種最佳授粉時間提供理論依據(jù)。

在新品種培育工作上，首先要深入了解雜交群體表型性狀的變異程度和多樣性水平[19]。本試驗(yàn)通過聚類分析將F1群體17 個株系分為兩大類型：第Ⅰ類共7 份材料，其特點(diǎn)為花型均為杯型，花眼均為綠色，外花被片均無斑，外花被片有花肋且顏色為白色；其中1-2、1-3 與父本蕾絲方巾始花期接近，花型、花形狀、葉片綠色程度與父本相同；1-4、1-5 與母本酒紅341 表型性狀相似，花眼、外花被片花肋顏色、內(nèi)花被片反卷程度均與母本相同。第Ⅱ類共10 份材料，與母本寶貝的眼睛表型性狀類似，其特點(diǎn)為葉片偏長，平均68.4 cm，花型均為喇叭型，外花被片均有邊緣波皺，外花被片花肋顏色均為黃色。

F1群體17 個株系表型性狀呈現(xiàn)多樣性，觀賞價值較高，適應(yīng)性強(qiáng)，符合花境和園林景觀造景需求，適合在江蘇省宿遷地區(qū)栽植；酒紅341、寶貝的眼睛、蕾絲方巾均是較好的親本材料，具有較好的經(jīng)濟(jì)價值。但蕾絲方巾作為母本時，雜交組合后代平均發(fā)芽率為60.0%，坐果率為0。在后續(xù)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，施用一定配比的肥料可以提高重瓣萱草的結(jié)實(shí)率，但是相對結(jié)實(shí)率還是比較低，可能與開花本身需要消耗大量營養(yǎng)物質(zhì)有關(guān)，還有待研究。10 個表型性狀均分離廣泛，遺傳變異程度均達(dá)到了中等水平以上，遺傳改良能力較強(qiáng)，為今后選育出觀賞性較強(qiáng)的萱草品種提供理論依據(jù)。在后續(xù)的試驗(yàn)中，可擴(kuò)大萱草的品種范圍，并結(jié)合分子標(biāo)記、孢粉學(xué)等技術(shù)，進(jìn)一步研究萱草的親和性，進(jìn)行更準(zhǔn)確的遺傳多樣性分析，以期更快培育出萱草新品種。