冼康華，蘇 江，付傳明，何 文，劉寶駿，黃寧珍，何金祥

(廣西壯族自治區(qū)中國科學(xué)院廣西植物研究所，廣西喀斯特植物保育與恢復(fù)生態(tài)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西桂林 541006)

0 引言

華重樓(Parispolyphyllavar.chinensis)為百合科(Liliaceae)重樓屬(Paris)多年生草本植物，具有清熱解毒、消腫止痛、涼肝定驚等功效，是我國傳統(tǒng)名貴中藥材[1,2]。華重樓對生長環(huán)境要求高，且生長緩慢，種子從發(fā)芽到藥用，一般需10年以上[3]。研究表明，藥用植物產(chǎn)生的黃酮、生物堿、萜類等次級代謝產(chǎn)物，在生長過程中很容易釋放到土壤中，從而引起植物根際土壤理化性質(zhì)的改變，導(dǎo)致根際土壤微生物和土壤酶活性的變化[4]。華重樓長時間的單一化種植及次級代謝產(chǎn)物的逐年累積極易引發(fā)連作障礙，從而導(dǎo)致華重樓的品質(zhì)和產(chǎn)量難以得到保障，嚴(yán)重影響華重樓的產(chǎn)量及產(chǎn)業(yè)發(fā)展。因此，在栽培生產(chǎn)中有針對性地選擇合適的微生物肥料科學(xué)合理施肥，維持栽培地土壤理化性狀和有益微生物群體、數(shù)量的平衡，是華重樓人工栽培成功的關(guān)鍵[5,6]。

目前，已有多位學(xué)者多方面報道華重樓的人工施肥研究。鄭欽方等[7]在華重樓施肥時以腐熟的有機(jī)肥為主，輔施葉面肥，不施化肥。李偉等[8]則以充分腐熟的廄肥(如羊糞)混合史丹利復(fù)合肥為主要肥料。劉哲等[9]研究不同梯度水平氮、磷、鉀肥對華重樓根莖產(chǎn)量和品質(zhì)的影響，結(jié)果表明，氮、磷、鉀肥配施有利于華重樓根莖的增重率、總皂苷含量和浸出物含量的提高。而有關(guān)華重樓栽培中微生物菌肥的應(yīng)用卻鮮有報道，選擇何種類型的菌肥有待進(jìn)一步研究。微生物菌肥是一類含有特定微生物活體的肥料，通過微生物的生命活動及代謝產(chǎn)物促使農(nóng)作物得到特定施肥效應(yīng)，具有應(yīng)用效果好、保護(hù)環(huán)境、對作物增產(chǎn)增效、安全無毒等優(yōu)點(diǎn)[10-12]，因而在農(nóng)業(yè)上應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)大。但由于現(xiàn)階段仍存在菌種效能不穩(wěn)定且肥效短期不明顯、肥料種類少等問題[13]，尤其是許多珍稀瀕危中藥材仍未有穩(wěn)定高效的微生物菌肥種類，從而導(dǎo)致我國中藥材產(chǎn)業(yè)種植技術(shù)落后、品質(zhì)退化、農(nóng)藥殘留等問題日益突出。因此，開展我國傳統(tǒng)特色中藥材微生物菌肥的研究工作十分有意義。研究表明，微生物菌肥可以改良土壤微生態(tài)結(jié)構(gòu)[13,14]，從而提高土壤肥力[15-17]與肥料利用效率[18,19]，促進(jìn)中藥材生長，提高中藥材的產(chǎn)量和品質(zhì)[20-23]，目前在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)特別是經(jīng)濟(jì)作物栽培上得到廣泛應(yīng)用。根際土壤微生物群落多樣性可敏感地反映出植物的生長、繁殖以及代謝活動的變化[24]，施加菌肥后，根際土壤微生物必然會發(fā)生變化，根際微生物的組成和結(jié)構(gòu)變化對植物的生長發(fā)育、營養(yǎng)吸收和抗逆性等都會產(chǎn)生影響。同時，由于多方面的作用，土壤理化性質(zhì)也可能發(fā)生相應(yīng)的改變。因此，研究根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及土壤理化性質(zhì)的變化可以快速推測出所用菌肥對華重樓生長的影響。

本研究選用兩種常用的微生物菌肥，內(nèi)含的微生物菌種分別為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)和解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)[25]?？莶菅挎邨U菌是芽孢桿菌屬中的一種革蘭氏陽性菌，其分泌的脂肽類、抗菌蛋白、酚類及多烯類等抗菌物質(zhì)具有抑制病原真菌的效果[26,27]；解淀粉芽孢桿菌對植物病原菌具有很強(qiáng)的抑制力，其產(chǎn)生的酶類、脂肽類抗生素、生物表面活性素、聚酮類化合物和抑菌蛋白，在生物防治應(yīng)用中對植物病原真菌、細(xì)菌、病毒、線蟲的抑制起主要作用，同時能夠促進(jìn)植物根系及植株生長，并具有誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性的能力，從而減少病害的發(fā)生[28-30]。本研究通過高通量測序技術(shù)分析使用不同菌肥后華重樓根際土壤微生物的變化，篩選出適合華重樓生長的微生物菌肥種類，為華重樓的人工栽培技術(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

以引種至廣西植物研究所內(nèi)1年半、根莖刻痕數(shù)為5個的華重樓為實(shí)驗(yàn)材料。

1.2 微生物菌肥類型

枯草芽孢桿菌：水劑，有效活菌數(shù)≥10億/g；解淀粉芽孢桿菌：粉劑，有效活菌數(shù)≥10億/g，含有機(jī)質(zhì)≥65%。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計

2019年3-10月完成田間實(shí)驗(yàn)，選取長勢一致的華重樓，分為4個處理組，每個處理組種植30株。處理組1 (J1)：僅施用枯草芽孢桿菌，施用濃度為6 g/m2，施用方式為兌水灌根；處理組2 (J2)：僅施用解淀粉芽孢桿菌，施用濃度為120 g/m2,施用方式為拌土圍根；處理組3 (J3)：兩種微生物菌肥混施，其中枯草芽孢桿菌施用濃度為6 g/m2,施用方式為兌水灌根，解淀粉芽孢桿菌施用濃度為120 g/m2,施用方式為拌土圍根；處理組4 (J4)：不施菌肥，為對照處理組。各處理3次重復(fù)，施肥后按常規(guī)方法管理。

1.4 土壤樣品采集與處理

當(dāng)年11月于每個處理組隨機(jī)選取華重樓10株，抖去根系上附著顆粒較大的土壤，收集根系以及附著的土壤即為根際土，將混合均勻的根際土壤放入無菌塑料袋中，用標(biāo)簽記錄采樣的信息，放入戶外保鮮箱后立即帶回實(shí)驗(yàn)室，每個采樣點(diǎn)3次重復(fù)。采集的土壤一份置于-80℃下保存，用于土壤DNA提取及后續(xù)的細(xì)菌16S rDNA和真菌18S rDNA測序；一份室內(nèi)自然風(fēng)干，研磨，過2 mm篩，用于土壤理化性質(zhì)測定。

1.5 測定方法

土壤理化性質(zhì)測定參照《土壤農(nóng)化分析》[31]，測定項(xiàng)目和方法如下：全氮TN (凱氏定氮法)、全磷TP(鉬銻顯色法)、全鉀TK (火焰光度法或原子吸收分光光度法)、土壤有機(jī)碳TOC (重鉻酸鉀水合加熱法)、銨態(tài)氮A和硝態(tài)氮N (定氮儀法)、速效磷AP(鹽酸-氟化銨法)、速效鉀AK (浸提+原子吸收法)和pH值。

土壤微生物DNA提取和測序：使用土壤基因組DNA快速抽提試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]提取土壤微生物總DNA，DNA送到上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行測序。整個測序流程包括PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物的混樣、純化，文庫的構(gòu)建。對細(xì)菌V3-V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，引物采用338F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)。擴(kuò)增程序如下：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸45 s，持續(xù)28個循環(huán)周期；72℃延伸10 min。對真菌V5-V7區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，引物采用SSU0817F(5′-TTAGCATGGAATAATRRAATA-

GGA-3′)和1196R (5′-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3′)，擴(kuò)增程序如下：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸45 s，持續(xù)37個循環(huán)周期；72℃延伸10 min。本研究利用Illumina平臺進(jìn)行測序。

1.6 微生物組測序數(shù)據(jù)質(zhì)控與分析

對測序得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接質(zhì)控，得到有效數(shù)據(jù)。采用Uparse軟件平臺進(jìn)行操作分類單元(Operational Taxonomic Units，OTU)聚類和物種信息分析。OTU聚類步驟如下：(1)對優(yōu)化序列提取非重復(fù)序列，便于降低分析中間過程冗余計算量；(2)去除沒有重復(fù)的單序列；(3)按照97%相似性對非重復(fù)序列(不含單序列)進(jìn)行OTU聚類，在聚類過程中去除嵌合體，得到OTU的代表序列；(4)將所有優(yōu)化序列map至OTU代表序列，選出與代表序列相似性在97%以上的序列，生成OTU表格。采用RDP classifier貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析。

1.7 華重樓根際土壤微生物組成分析

基于測序的數(shù)據(jù)，利用R語言工具生成土壤微生物群落柱形圖(Bar圖)；利用Mothur軟件分析隨機(jī)抽樣下的Alpha多樣性指數(shù)來反映微生物群落的豐富度和多樣性，包括Ace、Chao、Simpson和Shannon指數(shù)。Ace和Chao指數(shù)反映群落中物種的數(shù)量，衡量群落的豐富度；Simpson和Shannon指數(shù)受樣品群落的物種豐富度和均勻度影響，反映群落的多樣性。Ace、Chao和Shannon指數(shù)越大，Simpson指數(shù)越小，說明樣品的物種多樣性越高。Venn圖可用于統(tǒng)計多組或多個樣本中所共有和獨(dú)有的OTU數(shù)目，采用R語言工具和作圖生成。

1.8 華重樓根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)差異性分析

利用Beta多樣性對不同樣品微生物群落間的物種多樣性進(jìn)行比較分析，探索不同樣品間群落組成的相似性或差異性。用Qiime計算Beta多樣性距離矩陣，然后用R語言作圖畫樹。

1.9 數(shù)據(jù)處理

采用單因素方差分析進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，顯著性水平設(shè)置為0.05，用最小顯著性差異法(Least Significant Difference，LSD)進(jìn)行多重比較分析，以上分析在SPSS 21.0軟件上運(yùn)行，用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和統(tǒng)計。

2 結(jié)果與分析

2.1 施用菌肥后土壤微生物群落組成差異分析

2.1.1 施用菌肥后細(xì)菌群落組成差異分析

華重樓土壤樣品中共檢測出細(xì)菌23門57綱125目185科284屬525種，各實(shí)驗(yàn)樣地細(xì)菌門(Phylum)和綱(Class)水平的群落結(jié)構(gòu)如圖1所示。從門水平上(圖1a)看，根際土壤中主要優(yōu)勢菌門為變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)和綠彎菌門(Chloroflexi)。在門水平上，與對照組(J4)相比，施加枯草芽孢桿菌(J1)使變形菌門、放線菌門的豐度升高，酸桿菌門、綠彎菌門豐度降低；而施加解淀粉芽孢桿菌(J2)則會降低變形菌門、放線菌門的豐度，使酸桿菌門、綠彎菌門豐度增加。另外，所有施加菌肥的處理組均會顯著降低芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)的豐度，而使厚壁菌門(Firmicutes)的豐度增加?？莶菅挎邨U菌比解淀粉芽孢桿菌更利于厚壁菌門的生長，但兩種菌肥同施(J3)會引起厚壁菌門豐度下降。通過綱分類層次(圖1b)統(tǒng)計，根際土壤中以放線菌綱(Actinobacteria)、γ-變形菌綱(Gamma-proteobacteria)及α-變形菌綱(Alpha-proteobacteria)為優(yōu)勢菌綱。

圖1 在門(a)、綱(b)水平上華重樓根際土壤細(xì)菌的相對豐度

2.1.2 施用菌肥后真菌群落組成差異分析

華重樓土壤樣品中共檢測出真菌8門26綱54目66科69屬82種，各處理組真菌門和綱水平的群落結(jié)構(gòu)如圖2所示。從門水平上(圖2a)看，土壤中的真菌主要由擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、子囊菌門(Ascomycota)與毛霉門(Mucoromycota)組成。在門水平上，與對照組(J4)相比，施加枯草芽孢桿菌(J1)后擔(dān)子菌門的豐度顯著降低，同時子囊菌門豐度顯著增加，單施解淀粉芽孢桿菌(J2)則對擔(dān)子菌門及子囊菌門豐度影響不大。兩種菌肥混施(J3)時，同樣會引起擔(dān)子菌門豐度顯著下降、子囊菌門豐度顯著提高，但幅度相對單施枯草芽孢桿菌有所下降，表明混施時枯草芽孢桿菌對擔(dān)子菌門和子囊菌門豐度的變化起主要作用，解淀粉芽孢桿菌可以緩解枯草芽孢桿菌對擔(dān)子菌門和子囊菌門的作用?？莶菅挎邨U菌對毛霉菌門的生長有促進(jìn)作用，而解淀粉芽孢桿菌則會抑制毛霉菌門的生長，二者混施時，會導(dǎo)致毛霉菌門豐度顯著下降。在綱水平上(圖2b)，以傘菌綱(Agaricomycetes)、糞殼菌綱(Sordariomycetes)和散囊菌綱(Eurotiomycetes)為優(yōu)勢菌綱。其中，施加枯草芽孢桿菌會顯著降低傘菌綱的豐度，但會促進(jìn)糞殼菌綱和散囊菌綱真菌的生長；而解淀粉芽孢桿菌則可以顯著提高傘菌綱真菌的豐度，抑制散囊菌綱真菌的生長。

圖2 在門(a)、綱(b)水平上華重樓根際土壤真菌的相對豐度

2.2 施用菌肥后土壤微生物群落的多樣性差異分析

2.2.1 施用菌肥后細(xì)菌群落的多樣性差異分析

供試土壤樣品的細(xì)菌群落豐度指數(shù)(Ace，Chao)和多樣性指數(shù)(Simpson，Shannon)如表1所示。在豐度方面，單施枯草芽孢桿菌(J1)與兩種菌肥混施(J3)處理組細(xì)菌的Ace、Chao指數(shù)均低于對照組(J4)，表明這兩種處理方式可能抑制了細(xì)菌的生長，造成細(xì)菌數(shù)量(豐度)顯著降低(P<0.05)，單施枯草芽孢桿菌的抑菌效果更為明顯。而單施解淀粉芽孢桿菌(J2)時，土壤中Ace、Chao指數(shù)均為最高，表明施加解淀粉芽孢桿菌可以促進(jìn)土壤中細(xì)菌的生長，但與對照組相比差異不顯著(P>0.05)。

表1 土壤微生物群落的豐富度和多樣性指數(shù)

在多樣性方面，施加枯草芽孢桿菌后，土壤中細(xì)菌Shannon指數(shù)較對照組顯著下降(P<0.05)，而Simpson指數(shù)則顯著升高(P<0.05)，表明單施枯草芽孢桿菌會導(dǎo)致土壤中細(xì)菌種類減少，細(xì)菌多樣性降低。而施加解淀粉芽孢桿菌(J2)與兩種菌肥混施(J3)的處理組中，Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)與對照組相比差異不顯著(P>0.05)，表明這兩種處理方式并未造成細(xì)菌物種種類的變化。

2.2.2 施用菌肥后真菌群落的多樣性差異分析

供試土壤樣品的真菌群落豐度指數(shù)(Ace，Chao)和多樣性指數(shù)(Simpson，Shannon)亦如表1所示。在豐度方面，各施加菌肥的處理組根際土壤中真菌Ace、Chao指數(shù)均比對照組低，表明施加菌肥會抑制真菌的生長，造成真菌數(shù)量下降，導(dǎo)致真菌豐富度降低，但各處理組間真菌豐度差異不顯著(P>0.05)。

在多樣性方面，施加枯草芽孢桿菌后真菌Shannon指數(shù)高于對照組，且是4個處理組中最高的，而Simpson指數(shù)則是最低的，表明施加枯草芽孢桿菌后土壤真菌物種數(shù)量增多，真菌多樣性升高。施加解淀粉芽孢桿菌與兩種菌肥混施的處理組中真菌Shannon指數(shù)均小于對照組，而Simpson指數(shù)與對照組相比有所增加，表明真菌物種數(shù)量減少，多樣性降低。

2.3 施用菌肥后土壤微生物Beta多樣性差異分析

細(xì)菌聚類分析(圖3a)結(jié)果顯示，根際土壤中的細(xì)菌劃分為3個類群：單施解淀粉芽孢桿菌土壤(J2)和不施肥土壤(J4)、單施枯草芽孢桿菌土壤(J1)、兩種菌肥混施土壤(J3)，表明單施解淀粉芽孢桿菌時細(xì)菌組成與對照組相近，各組之間的距離則表明單施枯草芽孢桿菌時細(xì)菌群落構(gòu)成變化最大。真菌聚類分析(圖3b)結(jié)果顯示，真菌也劃分為3個類群：單施枯草芽孢桿菌土壤(J1)和不施肥土壤(J4)，單施解淀粉芽孢桿菌土壤(J2)、兩種菌肥混施土壤(J3)，表明單施枯草芽孢桿菌時真菌群落結(jié)構(gòu)與對照組相近，而各組之間的距離則表明單施解淀粉芽孢桿菌時真菌群落構(gòu)成變化最大。綜上可知，枯草芽孢桿菌主要影響華重樓根際土壤中細(xì)菌的組成，而解淀粉芽孢桿菌則主要影響真菌的組成。

圖3 不同施肥處理根際土壤微生物UPGMA聚類分析

2.4 施用菌肥后土壤微生物群落的相關(guān)性差異分析

在97%的相似度下聚類，得到各處理組土壤樣品的OTU數(shù)。從表2可知，各土壤樣品的細(xì)菌OTU數(shù)均高于真菌OTU數(shù)。各施肥處理組中，單施解淀粉芽孢桿菌(J2)細(xì)菌OTU數(shù)略高于對照組，而單施枯草芽孢桿菌(J1)和兩種菌肥混施(J3)土壤中細(xì)菌OTU數(shù)與對照組(J4)相比分別下降36.08%和14.08%。各處理組真菌OTU數(shù)較對照組均有降低，其中兩種菌肥混施處理組真菌OTU數(shù)降幅最大，下降約35.11%；單施解淀粉芽孢桿菌(J2)處理組下降約18.32%；單施枯草芽孢桿菌下降約8.40%。上述結(jié)果說明，兩種菌肥混施對真菌OTU數(shù)目會產(chǎn)生疊加的抑制效果。

表2 華重樓土壤樣本測序獲得的細(xì)菌和真菌OTU序列數(shù)

從細(xì)菌OTU韋恩圖(圖4a)可知，經(jīng)不同施肥處理的華重樓根際土壤共有的細(xì)菌OTU數(shù)為846個，分別占各處理組總OTU數(shù)的67.25%、42.53%、50.03%和42.99%；J1、J2、J3和J4特有的細(xì)菌OTU數(shù)分別為47，138，109和134個，分別占各處理組總OTU數(shù)的3.74%、6.94%、6.45%和6.81%，說明枯草芽孢桿菌對細(xì)菌的影響大于解淀粉芽孢桿菌，解淀粉芽孢桿菌土壤中的細(xì)菌組成與不施肥處理組更接近。

圖4 不同施肥處理根際土壤細(xì)菌和真菌OTU韋恩圖

從真菌OTU韋恩圖(圖4b)可以看出，各處理組共有的真菌OTU數(shù)為48個，分別占各處理組總OTU數(shù)的40.00%、44.86%、56.47%和36.64%；J1、J2、J3和J4特有的真菌OTU數(shù)分別為18，12，7和25個，分別占各處理組總OTU數(shù)的15.00%、11.21%、8.24%和19.08%。經(jīng)施肥后各處理組特有的真菌OTU數(shù)均比對照組低，且兩種菌肥混施時下降最多。枯草芽孢桿菌處理組(J1)土壤中真菌組成與不施肥處理組更為接近，兩種菌肥處理比單一菌肥處理對真菌組成影響更大。

經(jīng)不同施肥處理的華重樓根際土壤共有的細(xì)菌OTU數(shù)為846個，未施肥土壤中特有的細(xì)菌OTU數(shù)為134個，分別占未施肥土壤細(xì)菌總OTU數(shù)的42.99%和6.81%；而各處理組共有的真菌OTU數(shù)為48個，未施肥土壤中特有的真菌OTU數(shù)為25個，分別占未施肥土壤真菌總OTU數(shù)的36.64%和19.08%。對照組土壤中共有真菌OTU比例低于細(xì)菌，而特有真菌OTU比例高于細(xì)菌，表明施肥后根際土壤真菌OTU類型變化比細(xì)菌大。

2.5 施用菌肥對華重樓根際土壤理化性質(zhì)的影響

對不同施肥處理的華重樓根系土壤中的全氮(TN)、全磷(TP)、全鉀(TK)、土壤有機(jī)碳(TOC)、銨態(tài)氮(A)、硝態(tài)氮(N)、速效磷(AP)和速效鉀(AK)等指標(biāo)進(jìn)行測定(表3)，并根據(jù)1980年全國第2次土壤普查養(yǎng)分分級標(biāo)準(zhǔn)[32]進(jìn)行評價。由表3可知，J4樣地土壤中除TN和TK處于缺乏狀態(tài)外，TP、TOC、AK及AP均處于較豐以上水平，pH值為6.14，適宜華重樓生長。與對照組(J4)相比，施加菌肥后TK、TOC、N及AK水平顯著下降(P<0.05)，而pH值顯著上升(P<0.05)。其中，施用枯草芽孢桿菌(J1)和兩種菌肥混施(J3)處理組中TN含量顯著下降至極缺水平，特別是兩種菌肥混施時TN含量與對照組相比下降66.15%；而施加解淀粉芽孢桿菌后TN含量顯著上升(P<0.05)，約為未施肥處理組的2倍。另外，兩種菌肥混施還會使AP含量顯著降低(P<0.05)，TP含量也有下降，但未達(dá)顯著水平(P>0.05)。綜合比較后發(fā)現(xiàn)，兩種菌肥混施時，土壤理化性質(zhì)中除pH值顯著上升外，其余指標(biāo)均顯著下降，且TN、TP、TOC、A、N、AP及AK均為各處理組中最低水平；單施枯草芽孢桿菌時，TP、AP及pH值較對照組有所上升；而單施解淀粉芽孢桿菌時，TK含量最低，TN、TP、AP及pH值較對照組有所上升，其中TN、AP及pH值為各處理組中最高水平。

表3 不同菌肥處理后華重樓根際土壤的理化性質(zhì)變化

3 討論

3.1 不同微生物菌肥對華重樓根際土壤微生物的影響

土壤微生物數(shù)量和活性是衡量土壤質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，土壤微生物的種類和數(shù)量可以作為評價土壤肥力的指標(biāo)[33]。本研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌對華重樓根際土壤中細(xì)菌與真菌的影響不同。枯草芽孢桿菌會顯著抑制華重樓根際土壤中細(xì)菌的生長，引起細(xì)菌豐富度和多樣性顯著降低；同時對真菌的生長也有一定抑制作用，造成真菌總體豐富度略有降低，但顯著增加真菌物種的數(shù)量，提高真菌物種的多樣性，這與高吉坤[34]、樊勝南等[35]的研究結(jié)果有所差異。解淀粉芽孢桿菌對華重樓根際土壤中細(xì)菌無顯著影響，與枯草芽孢桿菌混施時還可以緩和其對細(xì)菌豐度的影響，同時提高細(xì)菌的多樣性。胡基華等[36]研究發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌能顯著降低土壤中真菌數(shù)量，而本研究中解淀粉芽孢桿菌雖未能顯著降低土壤中真菌個體數(shù)量，但卻顯著降低土壤中真菌的物種數(shù)量。造成上述差異的原因可能與菌肥施用濃度、施用組合和施用方式有關(guān)。于會麗等[37]研究發(fā)現(xiàn)，隨著微生物菌肥用量增加，土壤微生物活性和多樣性指數(shù)呈先增加后降低的趨勢。黎妍妍等[38]研究結(jié)果表明，不同菌肥施用方式對煙株根際土壤真菌群落結(jié)果有顯著影響，拌土圍根、米糠+拌土圍根這兩種方式均可顯著提高煙株根際土壤真菌的數(shù)量和群落多樣性。因此，在實(shí)際生產(chǎn)栽培中應(yīng)根據(jù)華重樓根際土壤微生物的狀況，正確選擇適宜的微生物菌肥濃度、組合及施用方式。

3.2 不同微生物菌肥對華重樓根際土壤理化性質(zhì)的影響

土壤養(yǎng)分是土壤質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，合理的養(yǎng)分含量對植物生長至關(guān)重要[39]。土壤酸化會引起連作障礙，而連作障礙又會導(dǎo)致中藥材低產(chǎn)、低質(zhì)、低效[40]。毛玉東等[41]研究發(fā)現(xiàn)，華重樓根莖總皂苷含量隨土壤pH值升高而增加，并建議在華重樓人工栽培中，土壤pH值應(yīng)控制在中性范圍(6.50-7.50)內(nèi)。本研究中與不施肥組相比，施加兩種菌肥后所有處理組根際土壤的pH值顯著上升，說明施加微生物菌肥可預(yù)防連作障礙的發(fā)生，同時也可將土壤的pH調(diào)節(jié)至更適合華重樓生長的水平。微生物菌肥可以促進(jìn)植物的營養(yǎng)吸收，使植物品質(zhì)改善，從而使產(chǎn)量提高[42]。本研究中，施加兩種微生物菌肥后土壤中TK、TOC、A、N及AK等水平顯著下降，可能是微生物菌肥可促進(jìn)華重樓根系對這些營養(yǎng)元素的吸收，從而導(dǎo)致碳、氮、鉀元素在土壤中的含量減少，尤其以兩種菌肥混施時，促進(jìn)營養(yǎng)吸收效果最好。而單施解淀粉芽孢桿菌時，土壤中TN含量顯著上升，可能是解淀粉芽孢桿菌促進(jìn)了固氮菌類的生長，從而使土壤中的氮素含量顯著增加[43]。也有研究表明，微生物菌肥在分解有機(jī)質(zhì)時需要合成蛋白質(zhì)，從而需要一定量的氮素，因此土壤中必須保證含有充足的有機(jī)質(zhì)和氮肥,如果土壤營養(yǎng)含量不足，可能會造成一定程度的脫肥[44]，這也可能是導(dǎo)致施肥后部分營養(yǎng)元素下降的原因。目前關(guān)于微生物菌肥與植物、根際土壤理化性質(zhì)的作用機(jī)理尚不明確，仍有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究表明，枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌對華重樓根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性影響不同，施加微生物菌肥后會引起根際土壤理化性質(zhì)發(fā)生顯著變化。施用本研究濃度的枯草芽孢桿菌會引起細(xì)菌豐富度和多樣性下降而真菌群落多樣性顯著升高，促使土壤由髙肥力的“細(xì)菌型”向低肥力的“真菌型”轉(zhuǎn)變，可能會增加病蟲害發(fā)生的概率，導(dǎo)致作物產(chǎn)量及質(zhì)量下降等負(fù)面影響；施用解淀粉芽孢桿菌對細(xì)菌豐富度和多樣性影響不顯著，卻能顯著降低真菌的多樣性；兩種菌肥混施還能中和枯草芽孢桿菌對細(xì)菌的抑制作用，提升細(xì)菌的多樣性，這為今后的研究提供了思路和方向。本研究結(jié)果為進(jìn)一步探索適合華重樓人工栽培的微生物菌肥奠定了基礎(chǔ)，有助于促進(jìn)華重樓的可持續(xù)利用及產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。