郭秋均 ，孫其偉

(1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門(mén)醫(yī)院腫瘤科， 北京 100053；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院預(yù)防保健科，北京 100091)

西黃丸是經(jīng)典的抗腫瘤名方，由牛黃、麝香、乳香、沒(méi)藥等組成，具有清熱解毒、消腫散結(jié)之功效，可以治療乳巖、橫、瘰、痰核等惡疾。目前西黃丸多以單用或配合現(xiàn)代抗腫瘤手段治療乳腺癌等腫瘤疾病。三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)約占乳腺癌總發(fā)病率的15%～20%，由于缺乏雌激素受體、孕激素受體和人表皮生長(zhǎng)因子受體2，對(duì)化療敏感性差，缺乏內(nèi)分泌、靶向治療等治療手段，通常被認(rèn)為是最難治療的乳腺癌亞型[1]，免疫治療是其潛在有效治療方案[2]。既往研究發(fā)現(xiàn)，西黃丸治療三陰性乳腺癌有一定療效，但其作用機(jī)制有待進(jìn)一步明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)的理論，對(duì)生物系統(tǒng)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析，選取特定信號(hào)節(jié)點(diǎn)進(jìn)行多靶點(diǎn)藥物分析的方法，開(kāi)啟了中醫(yī)藥多靶標(biāo)與多種疾病間復(fù)雜網(wǎng)狀關(guān)系研究的新模式。本研究擬通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)西黃丸治療三陰性乳腺癌的關(guān)鍵靶點(diǎn)及其免疫學(xué)機(jī)制進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 中藥復(fù)方作用靶點(diǎn)的篩選

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)(TCMSP，traditional chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform https://tcmspw.com/tcmsp.php)對(duì)牛黃、麝香、乳香、沒(méi)藥以生物利用度(OB)≥30%、類(lèi)藥性(DL)≥0.18且藥物半衰期(HL)≥4作為閾值進(jìn)行篩選，對(duì)復(fù)方中藥的藥物作用靶點(diǎn)進(jìn)行研究，OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)(online mendelian inheritance in man，https://omim.org/)、Genecard數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.genecards.org/)以及TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)用于篩選三陰性乳腺癌的病理靶點(diǎn)。通過(guò)Venn圖對(duì)中藥藥物靶點(diǎn)以及三陰性乳腺癌病理靶點(diǎn)進(jìn)行整合，以確定潛在中藥治療三陰性乳腺癌的作用機(jī)制。

1.2 TCGA數(shù)據(jù)獲取

通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)(The cancer genome atlas，https://portal.gdc.cancer.gov/)下載并處理乳腺癌原始的mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)，并分離出三陰性乳腺癌表達(dá)譜，探討三陰性乳腺癌的差異基因，差異篩選條件為L(zhǎng)ogFC> 2 & adj.P<0.05。利用limma包對(duì)下載的mRNA level 3的FPKM數(shù)據(jù)進(jìn)行整合和標(biāo)準(zhǔn)化，分析差異表達(dá)基因及其表達(dá)水平，差異基因篩選條件為 LogFC>2 &P<0.05。

1.3 篩選復(fù)方中藥治療三陰性乳腺癌的最佳靶點(diǎn)并構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)

使用STRING在線數(shù)據(jù)庫(kù)11.0(https://string-db.org)對(duì)牛黃、麝香、乳香、沒(méi)藥抗三陰性乳腺癌作用靶點(diǎn)進(jìn)行評(píng)估，并將置信度得分>0.4作為截點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)，得到一個(gè)靶-靶功能相關(guān)蛋白網(wǎng)絡(luò)、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction, PPI)網(wǎng)絡(luò)。此外，利用Cytoscape (version3.7.1) 中的Network Analyzer用于分析網(wǎng)絡(luò)中的拓?fù)鋮?shù)，如中值degree和最大degree。進(jìn)一步通過(guò)Cytoscape軟件可視化生成的PPI網(wǎng)絡(luò)，分析關(guān)鍵基因在疾病發(fā)生發(fā)展中的作用，探討疾病與基因表達(dá)的相關(guān)性。

1.4 GO和KEGG功能注析

利用R包“clusterprofiler”對(duì)核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO(gene oncology)富集和KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路分析，探討目標(biāo)基因的功能相關(guān)性。p值和q值均小于0.05的GO和KEGG富集通路被認(rèn)為是顯著性類(lèi)別。

1.5 免疫細(xì)胞浸潤(rùn)分析

采用CIBERSORT算法對(duì)三陰性乳腺癌患者RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，用以推斷22種免疫浸潤(rùn)細(xì)胞的相對(duì)比例，并對(duì)基因表達(dá)量以及免疫細(xì)胞含量進(jìn)行spearman 相關(guān)性分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用R語(yǔ)言(version 3.6)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均為雙側(cè)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三陰性乳腺癌靶點(diǎn)基因篩選

通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分選三陰性乳腺癌數(shù)據(jù)集，包括正常組113例、腫瘤組158例，分離出三陰性乳腺癌基因表達(dá)譜，共篩選出458個(gè)差異基因(圖1)，其中上調(diào)基因153個(gè)，下調(diào)基因305個(gè)。進(jìn)一步通過(guò)OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)以及GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(Relevance score≥20)探討三陰性乳腺癌的相關(guān)靶點(diǎn)1973個(gè)，取差異基因與疾病數(shù)據(jù)庫(kù)交集基因131個(gè)。

注：a.TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)篩選三陰性乳腺癌差異基因火山圖；b.TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)篩選三陰性乳腺癌458個(gè)差異基因表達(dá)譜；c.OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)與GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)差異基因交集圖1 三陰性乳腺癌差異基因篩選比較

2.2 西黃丸作用于三陰性乳腺癌關(guān)鍵基因分析

對(duì)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)分別基于牛黃、麝香、乳香、沒(méi)藥這4種中藥獲取所含藥物有效成分以及有效成分所作用的靶點(diǎn)共301個(gè)，并使用Cytoscape通過(guò)網(wǎng)絡(luò)圖的形式展示中藥成分與靶點(diǎn)的作用關(guān)系(圖2)，再將藥物靶點(diǎn)與前者的131基因取交集，得到19個(gè)交集基因(圖3)。進(jìn)一步通過(guò)單因素Cox和生存分析，篩選其中與腫瘤患者生存預(yù)后相關(guān)的基因，其中共識(shí)別4個(gè)關(guān)鍵基因，即CXC趨化因子配體10(Chemokine ligand-10，CXCL10)、腺病毒E2啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄因子1(E2F transcription factor 1，E2F1)、AP-1轉(zhuǎn)錄因子亞單位(AP-1 transcription factor subunit，F(xiàn)OS)、凝血因子3(Coagulation factor III，F(xiàn)3)，其中CXCL10、E2F1是三陰性乳腺癌保護(hù)性因素，F(xiàn)OS、F3是三陰性乳腺癌預(yù)后危險(xiǎn)因素(圖4)。

圖2 西黃丸組分牛黃、麝香、乳香、沒(méi)藥有效成分靶向分析

圖3 西黃丸藥物組分有效靶點(diǎn)與三陰性乳腺癌疾病靶點(diǎn)交集分析

注：a.CXCL10改善三陰性乳腺癌10年生存時(shí)間(p=0.015)；b.E2F1改善三陰性乳腺癌10年生存時(shí)間(p=0.014)；c.F3降低三陰性乳腺癌10年生存時(shí)間(p=0.010);FOS降低三陰性乳腺癌10年生存時(shí)間(p=0.026)圖4 西黃丸干預(yù)三陰性乳腺癌關(guān)鍵基因生存預(yù)后分析

2.3 西黃丸干預(yù)三陰性乳腺癌潛在網(wǎng)絡(luò)通路機(jī)制

GO 富集分析篩選得到GO條目25條 (P<0.05)，涉及生物過(guò)程10條，細(xì)胞組成6條，分子功能9條(圖5)。KEGG富集結(jié)果顯示，4個(gè)核心基因主要涉及通路11條，主要涉及為白介素-17(Interleukin-17, IL-17)、Toll樣受體(Toll-like receptor)和腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor, TNF)等信號(hào)通路(圖6)。

圖5 西黃丸干預(yù)三陰性乳腺癌關(guān)鍵基因GO分析

圖6 西黃丸干預(yù)三陰性乳腺癌關(guān)鍵基因KEGG分析

2.4 西黃丸干預(yù)三陰性乳腺癌核心靶點(diǎn)通路交互分析

采用Cytoscape軟件，生成西黃丸抑制三陰性乳腺癌靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)可視化和核心靶點(diǎn)相關(guān)通路的交互圖，圖表能清晰地顯示西黃丸上調(diào)E2F1、CXCL10和下調(diào)FOS、F3的分子機(jī)制及其對(duì)三陰性乳腺癌的調(diào)控作用(圖7)。

圖7 西黃丸干預(yù)三陰性乳腺癌核心靶點(diǎn)通路交互分析

2.5 西黃丸干預(yù)三陰性乳腺癌關(guān)鍵靶點(diǎn)與腫瘤免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的關(guān)系

通過(guò)進(jìn)一步探討西黃丸干預(yù)三陰性乳腺癌潛在的免疫學(xué)分子機(jī)制，研究結(jié)果表明，CXCL10與記憶T細(xì)胞活化正相關(guān)，與M2型巨噬細(xì)胞表達(dá)負(fù)相關(guān)；E2F1與濾泡型輔助T細(xì)胞(follicular helper T cell，Tfh)表達(dá)正相關(guān)，與靜止記憶T細(xì)胞負(fù)相關(guān)；F3與靜止樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)正相關(guān)，與Tfh表達(dá)負(fù)相關(guān)；FOS與靜止記憶T細(xì)胞正相關(guān)，與M0表型巨噬細(xì)胞表達(dá)負(fù)相關(guān)(圖8)，說(shuō)明西黃丸可能是通過(guò)上調(diào)CXCL10、E2F1，下調(diào)F3、FOS從而抑制M2表型巨噬細(xì)胞，與促進(jìn)Tfh細(xì)胞表達(dá)、DC細(xì)胞和記憶T細(xì)胞活化等機(jī)制有關(guān)。

a.CXCL10；b.B:E2F1；c.F3；d.FOS圖8 西黃丸干預(yù)三陰性乳腺癌關(guān)鍵靶點(diǎn)與腫瘤免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的關(guān)系

3 討論

乳腺癌屬于中醫(yī)學(xué)“乳巖”“乳石癰”范疇，其病機(jī)為肝郁脾虛、氣血瘀滯、痰瘀毒聚發(fā)為乳巖，病屬本虛標(biāo)實(shí)[3]。痰瘀凝聚經(jīng)絡(luò)是三陰性乳腺癌形成與進(jìn)展的重要機(jī)制，活血化瘀化痰是三陰性乳腺癌的重要治法。

三陰性乳腺癌是臨床難治型乳腺癌亞型。本研究通過(guò)藥物靶點(diǎn)與疾病差異基因交集分析發(fā)現(xiàn)，西黃丸調(diào)控4個(gè)乳腺癌預(yù)后關(guān)鍵基因。其中CXCL10是趨化因子超家族中的1種，與相應(yīng)趨化因子受體結(jié)合，調(diào)控半胱天冬酶(caspase)家族等通路激酶，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、血管生成。E2F1是細(xì)胞周期G1期向S期轉(zhuǎn)變的重要調(diào)節(jié)因子，磷酸化后可與DNA結(jié)合阻止轉(zhuǎn)錄過(guò)程。E2F1同時(shí)還可通過(guò)調(diào)控p53、p73、caspase家族等多種蛋白抑制腫瘤細(xì)胞抗凋亡途徑。Fos是原癌基因，是AP-1轉(zhuǎn)錄因子亞單位，其基因編碼的亮氨酸拉鏈蛋白可以與JUN家族的蛋白二聚，從而形成轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物AP-1、FOS蛋白被認(rèn)為是細(xì)胞增殖、分化和轉(zhuǎn)化的調(diào)節(jié)因子[4]。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，凝血酶通過(guò)多種途徑促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移及血管新生F3生存分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)3高表達(dá)與三陰性乳腺癌的不良預(yù)后有關(guān)，而西黃丸可能通過(guò)降低F3的表達(dá)，從而影響三陰性乳腺癌的預(yù)后。

腫瘤微環(huán)境顯著影響著腫瘤的診斷、生存結(jié)局和臨床治療敏感性。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor associated macrophages, TAMs)根據(jù)其功能不同，普遍將其分為M1型與M2型兩類(lèi)[5]。通常認(rèn)為，M2型巨噬細(xì)胞釋放CXCL家族趨化因子，IL-6、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移[6]。分析結(jié)果提示，西黃丸的作用靶點(diǎn)可能與M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)。記憶T細(xì)胞是T細(xì)胞中的重要亞群，在乳腺癌免疫應(yīng)答的啟動(dòng)階段，CD4+記憶T細(xì)胞對(duì)CD8+T細(xì)胞衰竭有抑制作用[7]，而西黃丸作用于E2F1對(duì)記憶T細(xì)胞有潛在的調(diào)控作用。Tfh是一種特殊類(lèi)型的輔助性T細(xì)胞，通過(guò)影響B(tài)細(xì)胞功能與遷移在非特異性免疫應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[8]。在三陰性乳腺癌中，被免疫檢查點(diǎn)抑制劑激活的Tfh細(xì)胞可調(diào)節(jié)B細(xì)胞產(chǎn)生IgG抗體，這些抗體對(duì)免疫治療的療效至關(guān)重要。若抑制B細(xì)胞生成這些抗體，免疫治療效果就會(huì)嚴(yán)重受限。此外，CXCL10是腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞極化與自噬機(jī)制研究中的重要靶點(diǎn)，同時(shí)也是影響T細(xì)胞功能的重要分子[9]。本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)手段，揭示了西黃丸在調(diào)節(jié)三陰性乳腺癌關(guān)鍵靶點(diǎn)和腫瘤微環(huán)境中的潛在重要靶點(diǎn)，為中醫(yī)藥防治三陰性乳腺癌的臨床與機(jī)制研究提供了新思路，但其中具體的因子和細(xì)胞表達(dá)需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)印證。