方譜縣，劉康，張蕙暢，夏思進(jìn)，張健淞，任杰，肖少波，方六榮

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院/湖北省生豬健康養(yǎng)殖協(xié)同創(chuàng)新中心，武漢 430070

豬δ冠狀病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種豬腸道致病性冠狀病毒，主要感染新生仔豬，臨床癥狀與豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea，PED)和豬傳染性胃腸炎(porcine transmissible gastroenteritis，TGE)相似，以腹瀉、嘔吐、脫水為主要特征[1-3]。自2014年初在美國(guó)暴發(fā)后，加拿大、韓國(guó)、中國(guó)、泰國(guó)、越南、老撾、日本等國(guó)家也相繼從豬腹瀉樣品中檢測(cè)到PDCoV，給養(yǎng)豬業(yè)造成了較大的經(jīng)濟(jì)損失[4]。臨床上PDCoV常與其他病毒混合感染，比如PEDV、TGEV以及PRRSV[5-6]。最近研究表明PEDV和PDCoV混合感染比單一病毒感染具有更嚴(yán)重的臨床癥狀，這給腸道病毒的防控帶來很大的挑戰(zhàn)[7]。目前，尚無商品化的疫苗可用，病毒的分離培養(yǎng)對(duì)PDCoV診斷方法的建立和疫苗的研制及致病機(jī)制的研究具有十分重要的意義。

PDCoV為單股正鏈RNA病毒，基因組大小約為25.4 kb，屬于冠狀病毒科、δ冠狀病毒屬成員，具有其他冠狀病毒類似的基因分布(5′ UTR-ORF1a-ORF1b-S-E-M-NS6-N-NS7-NS7a-3′ UTR)。其中，ORF1a和ORF1b編碼2個(gè)多聚蛋白pp1a、pp1ab，被自身編碼的木瓜樣蛋白酶(nsp3)和3C樣蛋白酶(nsp5)加工成15個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白；3′端基因組編碼4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白[刺突蛋白(S)，小膜蛋白(E)，膜蛋白(M)，核衣殼蛋白(N)]以及3個(gè)輔助蛋白(NS6，NS7，NS7a)[8-10]。目前，PDCoV是唯一通過體外細(xì)胞培養(yǎng)成功分離的δ冠狀病毒屬成員，是研究δ冠狀病毒屬病毒的良好模型。研究發(fā)現(xiàn)PDCoV具有非常廣泛的宿主嗜性[11]，對(duì)牛、雞、小鼠以及火雞易感，甚至還可以感染人[12-15]，提示該病毒具有跨種傳播的能力，給動(dòng)物和人類健康帶來危險(xiǎn)。

PDCoV和PEDV都屬于不容易分離培養(yǎng)的病毒，在體外培養(yǎng)中往往需要添加外源性胰蛋白酶[16]。相對(duì)于PEDV，可在體外培養(yǎng)傳代的PDCoV毒株仍然很少，盡管近年來PDCoV生物學(xué)功能等基礎(chǔ)研究獲得較多的研究進(jìn)展[17-19]，但是對(duì)該病毒的起源、進(jìn)化以及具有廣泛的宿主嗜性的機(jī)制尚不清楚。因此，加大其流行病學(xué)調(diào)查、臨床上毒株的分離以及免疫致病機(jī)制的研究具有重要意義。本研究采集了河北省某2個(gè)豬場(chǎng)發(fā)生腹瀉的仔豬小腸內(nèi)容物，經(jīng)過病毒分離、鑒定和培養(yǎng)，獲得2株P(guān)DCoV，分別命名為PDCoV CHN-HeB-A1株和CHN-HeB-B2株，對(duì)其體外增殖能力、全基因組測(cè)序和遺傳進(jìn)化進(jìn)行了分析，以期為后續(xù)疫苗的研發(fā)和診斷試劑的研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病料、細(xì)胞及主要試劑

病料為河北省某2個(gè)豬場(chǎng)發(fā)生腹瀉仔豬的小腸內(nèi)容物，其中有3份樣品采自A豬場(chǎng)，2份樣品采自B豬場(chǎng)。腎小管上皮細(xì)胞LLC-PK1由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存?？筆DCoV M蛋白單克隆抗體為筆者所在實(shí)驗(yàn)室自制保存。FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。RNA反轉(zhuǎn)錄試劑、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶、高保真DNA聚合酶、DNA Marker、pGEM-T Easy克隆載體等購(gòu)自大連寶生物公司。Trizol總RNA提取試劑盒為Omega公司產(chǎn)品。

1.2 病料處理

采集的小腸內(nèi)容物中加入3～5倍體積的MEM培養(yǎng)液、青霉素200 U/mL和鏈霉素200 μg/mL，經(jīng)攪拌混勻，在-20 ℃凍融3次，于4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，收集上清，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 RNA提取與RT-PCR分析

根據(jù)PDCoV CHN-HN-2014株(GenBank登錄號(hào)：KT336560)、PEDV AJ1102株(GenBank登錄號(hào)：JX188454)、TGEV WH-1株(GenBank登錄號(hào)：HQ462571)全基因組序列，設(shè)計(jì)特異性引物分別檢測(cè)PDCoV M基因、PEDV N基因和TGEV N基因(表1)。提取處理后的病料總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以cDNA為模板，利用各引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)DNA試劑盒回收，克隆至pGEM-T Easy載體中進(jìn)行測(cè)序鑒定。

表1 PEDV、PDCoV和TGEV檢測(cè)引物序列 Table 1 Primer sequences for detection of PEDV,PDCoV and TGEV

1.4 病毒的分離

取2 mL上述RT-PCR檢測(cè)為PDCoV陽(yáng)性的樣品懸液，用0.22 μm濾器過濾除菌后，接種至長(zhǎng)滿單層的LLC-PK1細(xì)胞，在37 ℃ 5% CO2的條件下吸附2～3 h后，棄去培養(yǎng)基，加入10 mL維持液(含7.5 μg/mL胰酶的MEM培養(yǎng)液)，于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d后收毒，若未觀察到細(xì)胞病變，則于-20 ℃凍融2～3次后再接種LLC-PK1細(xì)胞進(jìn)行盲傳，并對(duì)收集的每代病毒液進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，若傳到第5代(F5)仍無細(xì)胞病變則棄掉。

1.5 病毒的鑒定

1)間接免疫熒光分析。將PDCoV接種24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的LLC-PK1細(xì)胞，同時(shí)，設(shè)立不接毒對(duì)照組。待細(xì)胞出現(xiàn)病變后，PBS洗滌3次，室溫下4%多聚甲醛固定15 min；再用預(yù)冷的甲醇透化10 min，PBS洗滌3次，5%牛血清封閉45 min，PDCoV M單克隆抗體37 ℃孵育1 h。PBS洗滌3次，加入FITC標(biāo)記的山羊抗鼠IgG，37 ℃孵育45 min，PBS洗滌3次，加入1∶2 000稀釋的DAPI(4′,6-二脒基-2-苯基吲哚)進(jìn)行核染色15 min，PBS洗3次，通過熒光顯微鏡觀察并拍照。

2)Western blot分析。將PDCoV感染LLC-PK1細(xì)胞，待細(xì)胞出現(xiàn)明顯的病變后收集細(xì)胞樣品，同時(shí)設(shè)立不接毒細(xì)胞對(duì)照組。將細(xì)胞樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，經(jīng)過10%的脫脂奶粉封閉2 h、PDCoV M單克隆抗體室溫孵育2 h、HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG室溫作用1 h，最后，通過BIO-RAD化學(xué)發(fā)光成像儀進(jìn)行顯色分析。

3)PDCoV病毒粒子的超離純化與電鏡觀察。病毒液經(jīng)過離心和0.45 μm濾器過濾去除細(xì)胞碎片，加入終濃度為0.5 mol/L的NaCl和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的PEG6000，充分混勻后置于4 ℃沉淀24 h，8 000 r/min離心1.5 h，棄去上清，沉淀中加入少量Tris-EDTA-氯化鈉緩沖液(TEN/STE)，于4 ℃溶解過夜；上述溶液經(jīng)30%、45%和60%梯度蔗糖溶液離心，在30%～45%分層處和45%～60%分層處分別取樣；30 000 r/min離心4 h棄去上清去除蔗糖，在沉淀中加入少量STE于4 ℃溶解過夜。將獲得的病毒懸液樣品分別滴到銅網(wǎng)上吸附5 min，用濾紙輕輕吸取病毒懸液，待干燥后滴加20 g/L的磷鎢酸進(jìn)行負(fù)染1 min，棄掉磷鎢酸，待干燥后在日立H-7000FA電子顯微鏡下觀察并拍照。

1.6 病毒的TCID50測(cè)定

將病毒用含7.5 μg/mL胰酶的MEM培養(yǎng)液在1.5 mL EP管中作10倍系列稀釋，將每個(gè)稀釋度的病毒液接種到單層LLC-PK1的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每個(gè)稀釋度接種8孔，每孔接種100 μL。同時(shí)，設(shè)立MEM培養(yǎng)液作陰性對(duì)照。將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，12 h后開始觀察，記錄細(xì)胞產(chǎn)生CPE孔數(shù)，直至細(xì)胞病變穩(wěn)定。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，按Reed-Muench法計(jì)算病毒的TCID50。

1.7 PDCoV全基因組序列測(cè)定與分析

參照文獻(xiàn)[20]和PDCoV全基因組序列，設(shè)計(jì)16對(duì)擴(kuò)增引物將PDCoV全基因組序列分為16個(gè)1 500～1 900 bp的基因片段進(jìn)行擴(kuò)增，所用引物序列見表2。將各片段克隆至pGEM-T Easy載體中，并送至武漢擎科生物公司測(cè)序。使用SeqMan軟件將16個(gè)基因片段序列拼接為完整的PDCoV全基因組序列。使用MegAlign軟件對(duì)PDCoV全基因組序列進(jìn)行分析，利用MEGA 7.0軟件對(duì)全基因組序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病料的RT-PCR檢測(cè)

利用合成的特異性引物(表2)通過RT-PCR對(duì)臨床上常見的3種豬腸道冠狀病毒(PEDV、 TGEV和PDCoV)進(jìn)行檢測(cè)，核酸凝膠電泳分析結(jié)果顯示5份樣品經(jīng)RT-PCR分析均獲得大小約437 bp的PDCoV M基因特異性條帶，而對(duì)PEDV和TGEV檢測(cè)均為陰性(圖1)，說明腹瀉樣品為PDCoV陽(yáng)性。

表2 PDCoV全基因組引物序列 Table 2 Primer sequences used to generate the full-length genome of PDCoV

M:代表DNA Marker; 1～7:RT-PCR檢測(cè)PEDV; 8～14:RT-PCR檢測(cè)TGEV; 15-21:RT-PCR檢測(cè)PDCoV; 3-7、10-14、17-21:代表5份腹瀉樣品; 1、8、15:陽(yáng)性對(duì)照; 2、9、16:陰性對(duì)照; M:DNA Marker; 1-7:Detection of PEDV by RT-PCR； 8-14:Detection of TGEV by RT-PCR; 15-21:Detection of PDCoV by RT-PCR； 3-7,10-14,17-21：Five diarrhea samples; 1,8,15:Positive control; 2,9,16:Negative control.

2.2 PDCoV的分離

將處理好的5份PDCoV陽(yáng)性樣品接種長(zhǎng)滿單層的LLC-PK1細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)接種后第3天有2份樣品(分別來源于2個(gè)豬場(chǎng))接種的細(xì)胞產(chǎn)生病變，主要表現(xiàn)為細(xì)胞變圓、聚集、裂解、脫落，與PDCoV所致的病變一致，收集細(xì)胞培養(yǎng)物。將此2份細(xì)胞培養(yǎng)物在LLC-PK1細(xì)胞上傳至F5，結(jié)果每代都能穩(wěn)定地引起細(xì)胞病變。提取每代病毒的RNA，通過RT-PCR方法擴(kuò)增PDCoV的M基因，結(jié)果均能獲得大小約437 bp的特異性條帶(圖2)。說明所獲得的2株病毒均能在細(xì)胞上穩(wěn)定傳代，分別命名為CHN-HeB-A1和CHN-HeB-B2株。

M:代表DNA Marker; 1:陽(yáng)性對(duì)照; 2:陰性對(duì)照; 3-7:第1代至第5代CHN-HeB-A1株; 8-12:第1代至第5代CHN-HeB-B2株。M:DNA 2000 Marker; 1:Positive control; 2:Negative control；3-7:CHN-HeB-A1 strain from F1 to F5; 8-12:CHN-HeB-B2 strain from F1 to F5.

2.3 PDCoV分離株的鑒定

將PDCoV CHN-HeB-A1和CHN-HeB-B2株分別接種于24孔板培養(yǎng)的LLC-PK1細(xì)胞，待細(xì)胞出現(xiàn)病變時(shí)，收獲細(xì)胞樣品進(jìn)行IFA和Western blot分析。IFA結(jié)果顯示2株病毒感染的細(xì)胞均可觀察到特異性綠色熒光，而對(duì)照組沒有綠色熒光(圖3A)；Western blot結(jié)果表明PDCoV M單克隆抗體特異性識(shí)別病毒表達(dá)的M蛋白條帶(圖3B)。進(jìn)一步通過超離純化和電鏡觀察，結(jié)果顯示采集30%、45%蔗糖分層處的樣品可以觀察到病毒粒子，病毒粒子成球型，直徑100～150 nm，表面有囊膜和纖突，完整的病毒粒子呈典型的皇冠狀(圖3C)。這些結(jié)果證實(shí)這2株病毒均為PDCoV。

2.4 PDCoV感染細(xì)胞的動(dòng)力學(xué)分析

為了分析2株病毒在LLC-PK1細(xì)胞上的增殖情況，將PDCoV CHN-HeB-A1株和CHN-HeB-B2株分別以感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection,MOI)為0.1的劑量接種LLC-PK1細(xì)胞，于接種后6、12、18和24 h收取培養(yǎng)物，進(jìn)行間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖4A所示，PDCoV CHN-HeB-A1株和CHN-HeB-B2株感染細(xì)胞6 h時(shí)均可觀察到少量的特異性綠色熒光，隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，含有綠色熒光的細(xì)胞逐漸增多，24 h后由于細(xì)胞出現(xiàn)脫落，綠色熒光數(shù)量減少，整個(gè)實(shí)驗(yàn)中對(duì)照組細(xì)胞均無特異性綠色熒光。

同時(shí)，將2株病毒分別以相同劑量(0.1 MOI)接種LLC-PK1細(xì)胞，于接種后4、8、12、16、20、24 h分別收取細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行TCID50檢測(cè)，繪制病毒的一步生長(zhǎng)曲線。結(jié)果如圖4B所示，感染后4 h，即可檢測(cè)到較低滴度的病毒，隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，病毒滴度也逐漸升高。在感染24 h后，兩分離株具有相當(dāng)?shù)牟《镜味取＿@些結(jié)果表明2株P(guān)DCoV具有相似的體外增殖曲線。

2.5 PDCoV全基因組測(cè)序與序列分析

提取病毒RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，利用16對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示分別擴(kuò)增出覆蓋PDCoV CHN-HeB-A1(圖5A)和CHN-HeB-B2株(圖5B)全基因組的16個(gè)片段，與預(yù)期片段大小相符。將各片段克隆至pGEM-T Easy克隆載體，送至武漢擎科生物技術(shù)有限公司測(cè)序，利用SeqMan軟件對(duì)所獲得的序列進(jìn)行拼接，最終獲得2株P(guān)DCoV的全基因組序列。由于2毒株核苷酸相似性極高，達(dá)99.95%，提交了其中1個(gè)毒株(CHN-HeB-A1)全基因序列至GenBank，核酸序列號(hào)為MG242062。

A:IFA檢測(cè)PDCoV; B:Western blot檢測(cè)PDCoV; C:電鏡觀察PDCoV。 A:PDCoV detection via IFA; B:PDCoV detection via Western blot; C:PDCoV detection via electron micrograph.

A:IFA檢測(cè)PDCoV感染; B:PDCoV在LLC-PK1細(xì)胞上的一步生長(zhǎng)曲線。 A:Detection of PDCoV infection via IFA; B:One-step growth curve of PDCoV in LLC-PK1 cells.

M:代表DNA Marker; A:擴(kuò)增的PDCoV CHN-HeB-A1株16個(gè)基因片段; B:擴(kuò)增的PDCoV CHN-HeB-B2株16個(gè)基因片段。M:DNA 2000 Marker; A:16 gene fragments amplified from PDCoV CHN-HeB-A1 strain; B:16 gene fragments amplified from PDCoV CHN-HeB-B2 strain.

利用MegAlign軟件對(duì)已報(bào)道的28株代表性毒株全基因組進(jìn)行序列分析，結(jié)果顯示所有毒株相似性在97.0～99.9%，且PDCoV CHN-HeB-A1株和CHN-HeB-B2株序列與國(guó)內(nèi)部分地區(qū)報(bào)道的毒株序列相似性相對(duì)較高，為98.7%～99.1%；與美日韓毒株的相似性為98.3%～98.8%，與東南亞毒株相距最遠(yuǎn)，相似性為97.4%～97.7%(表3)。利用MEGA 7.0軟件對(duì)PDCoV CHN-HeB-A1和CHN-HeB-B2株與其他GenBank已發(fā)表的102株P(guān)DCoV全基因組序列進(jìn)行全基因組的遺傳進(jìn)化分析，并利用ITOL網(wǎng)站(http://itol.embl.de/)對(duì)樹形圖進(jìn)行美化，結(jié)果顯示中國(guó)大陸毒株(包括分離的CHN-HeB-A1株和CHN-HeB-B2株)與中國(guó)香港毒株處于同一簇；美國(guó)、韓國(guó)、日本毒株處于一簇；東南亞毒株單獨(dú)成簇(圖6)。

圖6 PDCoV全基因組序列的系統(tǒng)發(fā)育樹分析Fig.6 Phylogenetic tree analysis of the genomic sequences of PDCoVs

3 討 論

由于PDCoV在LLC-PK1細(xì)胞上增殖的病毒滴度要高于在ST細(xì)胞上的增殖滴度，本研究選用了LLC-PK1細(xì)胞進(jìn)行病毒的分離和培養(yǎng)，成功分離獲得了2株可以穩(wěn)定傳代的PDCoV，并進(jìn)一步通過IFA、Western blot分析和電鏡觀察得到全面鑒定。為了獲得增殖滴度高的病毒，對(duì)PDCoV CHN-HeB-A1與PDCoV CHN-HeB-B2株進(jìn)行了克隆純化。同時(shí)為了盡量減少病毒的傳代次數(shù)，選擇了F3代病毒用于空斑純化，經(jīng)過3輪空斑純化，獲得了病毒滴度較高(108.0TCID50/mL以上)的F6代病毒，用于后續(xù)研究。已有研究報(bào)道PDCoV分離株主要分為3個(gè)大的分支，包括東南亞(泰國(guó)、老撾、越南)毒株、中國(guó)毒株、美日韓(美國(guó)、日本、韓國(guó))毒株[21-22]。本研究中PDCoV分離株CHN-HeB-A1與CHN-HeB-B2屬于中國(guó)毒株這一分支，全基因組進(jìn)化分析表明這2個(gè)毒株與中國(guó)香港毒株處于同一簇。我們也對(duì)S基因序列進(jìn)行了進(jìn)化樹分析，結(jié)果與全基因組進(jìn)化樹基本一致。

通過IFA和Western blot分析表明本研究分離到的2株P(guān)DCoV與筆者所在實(shí)驗(yàn)室前期利用PDCoV CHN-HN-2014株M蛋白制備的單克隆抗體有很好的免疫反應(yīng)，其致病性和免疫原性有待進(jìn)一步研究。